黃寶玲，陳海彬，李詠梅，唐泳鈺，李佳純，葉婉苑

（廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510430）

澳洲堅(jiān)果又名夏威夷果、澳洲核桃等，因味美營(yíng)養(yǎng)高，被譽(yù)為“堅(jiān)果之王”[1]；其果實(shí)由果仁、果殼和青皮組成，可食用部位果仁在澳洲堅(jiān)果占比17%，被廣泛應(yīng)用于即食型干果產(chǎn)品、澳洲堅(jiān)果油、澳洲堅(jiān)果乳飲料等[2]。青皮是堅(jiān)果加工的主要副產(chǎn)物，占澳洲堅(jiān)果鮮果質(zhì)量的45%～60%，除極少量用于漚肥或飼料，絕大部分被丟棄，造成了極大的浪費(fèi)。近年來(lái)，有較多學(xué)者意識(shí)到澳洲堅(jiān)果青皮的潛在的保健、藥用價(jià)值，已開(kāi)展部分研究工作。郭剛軍等人[3]采用80%乙醇超聲提取澳洲堅(jiān)果青皮，并用不同極性溶劑對(duì)其提取物進(jìn)行分步萃取。結(jié)果表明，乙酸乙酯提取物含有較高含量的總酚和黃酮，正丁醇提取物提取多糖效果較好。張明等人[4]同樣以乙醇為提取溶劑，通過(guò)超聲輔助方式對(duì)澳洲堅(jiān)果青皮的總酚提取進(jìn)行工藝優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，料液比為1∶50（g∶mL），超聲溫度70 ℃，超聲功率250 W，超聲時(shí)間24 min 時(shí)，總酚提取效果最佳，可達(dá)（1 836.21±32.51） mg/100 g，該結(jié)果為澳洲堅(jiān)果青皮生物活性成分的開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

提取多酚的傳統(tǒng)方法常以有機(jī)溶劑為介質(zhì)，存在費(fèi)時(shí)、生產(chǎn)能耗高、活性組分易損失、得率低等不足。近年來(lái)，環(huán)境友好的低共熔溶劑（Deep eutectic solvents，DESs） 備受關(guān)注[5]。DESs 是由氫鍵供體和氫鍵受體組成的2 個(gè)組分或3 組分低共熔混合物，具有熔點(diǎn)低、無(wú)毒、成本低、生物可降解性等良好特性[6]。通過(guò)改變DESs 的組成成分、摩爾比、水分添加量等因素，可使DESs 的理化性質(zhì)發(fā)生變化，從而影響其對(duì)生物活性成分的提取。目前，已有較多研究表明低共熔溶劑法在植物活性成分提取中具有卓越的提取能力。孫悅等人[7]采用超聲輔助低共熔溶劑法探究DESs 體系（組成組分、摩爾比、水分添加量） 與提取方式（料液比、提取溫度、超聲時(shí)間及超聲功率） 對(duì)甘草多糖提取率的影響。結(jié)果顯示，甘草多糖提取劑選擇摩爾比1∶3，水分添加量40%的氯化膽堿- 異丙醇體系時(shí)，多糖提取率較好。并且在該提取溶劑下，改變提取方式優(yōu)化甘草多糖提取工藝后，提取率可達(dá)8.31%。李杰等人[8]以氯化膽堿- 乙二醇- 水組成的低共熔溶劑（DESs）為提取溶劑，采用單因素試驗(yàn)和Box-behnken 響應(yīng)面法對(duì)超聲輔助DESs 提取柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，優(yōu)化后的工藝對(duì)3 種黃酮類(lèi)成分的總提取率為20.78%。王曉藝等人[9]同樣采用超聲輔助低共熔溶劑方法對(duì)玫瑰多酚進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，通過(guò)與傳統(tǒng)乙醇提取溶劑相比發(fā)現(xiàn)，低共熔溶劑具有較強(qiáng)的多酚提取能力，提取量較乙醇相比提高了24%。

為了解低共熔溶劑對(duì)澳洲堅(jiān)果青皮多酚提取的規(guī)律，采用澳洲堅(jiān)果青皮為試驗(yàn)材料，分別選擇價(jià)廉易得、生物活性成分提取能力較好的氯化膽堿、1.3- 丁二醇為氫鍵供體與氫鍵受體，組成氯化膽堿- 1.3 丁二醇體系，創(chuàng)新性地通過(guò)超聲輔助低共熔溶劑法提取澳洲堅(jiān)果青皮中的多酚，優(yōu)化出綠色環(huán)保高效的提取方式，為澳洲堅(jiān)果青皮資源化利用提供有價(jià)值的參考依據(jù)，促進(jìn)澳洲堅(jiān)果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑與儀器

澳洲堅(jiān)果青皮、氯化膽堿、乳酸、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚、碳酸鈉、無(wú)水乙醇。

UC-9000 型超聲波清洗儀，深圳朗杰超聲電器有限公司產(chǎn)品；UV3000 型紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；FA124 型萬(wàn)分電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；TG16-WS 型離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 青皮多酚提取

青皮多酚提取流程：澳洲堅(jiān)果青皮粉末→加入低共熔溶劑攪拌→混勻→超聲輔助提取→離心→上清液。

1.2.2 低共熔溶劑配制

稱(chēng)量一定量的氯化膽堿與1.3 - 丁二醇，按照摩爾比1∶3 比例混合，置于80 ℃水浴中溶解，配制成100%的低共熔溶劑，冷卻待用。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1） DESs 體積分?jǐn)?shù)對(duì)青皮多酚提取的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g 青皮粉末，置于100 mL 錐形瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為0，12.5%，25%，50%，75%，100%的DESs 30 mL，用玻璃棒輕輕攪拌，在40 ℃條件下，用40 kHz 超聲輔助提取30 min，將得到的粗提液以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min，上清液待用。平行3 次試驗(yàn)。

（2） 料液比對(duì)青皮多酚提取的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g 青皮粉末，置于100 mL 錐形瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為50%的DESs，配制料液比為1∶20，1∶60，1∶100，1∶140，1∶180，1∶220，用玻璃棒輕輕攪拌，在40 ℃條件下，用40 kHz 超聲輔助提取30 min，將得到的粗提液以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min，上清液待用。平行3 次試驗(yàn)。

（3） 提取時(shí)間對(duì)青皮多酚提取的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g 青皮粉末，置于100 mL 錐形瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為50%的DESs 30 mL，用玻璃棒輕輕攪拌，在40 ℃、40 kHz 超聲輔助條件下，分別提取10，30，50，70，90 min，將得到的粗提液以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min，上清液待用。平行3 次試驗(yàn)。

1.2.4 沒(méi)食子酸標(biāo)曲的繪制

參照Pantelidis G E 等人[10]的方法測(cè)定沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇配置10，20，40，60，80 μg/mL 的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取1 mL 不同質(zhì)量濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入去離子水1 mL 和體積分?jǐn)?shù)為10%的福林酚試劑5 mL，搖勻，靜置反應(yīng)5 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的碳酸鈉溶液2 mL，用去離子水定容至10 mL，在避光條件靜置1 h，以水為參比，測(cè)定反應(yīng)液在波長(zhǎng)765 nm 下的吸光度（A）。以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（C） 為橫坐標(biāo)，吸光度（A） 為縱坐標(biāo)，做出沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 青皮多酚提取量測(cè)定

用待測(cè)的青皮多酚上清液代替沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定吸光度，再代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，按照公式計(jì)算多酚提取量。

式中：C——上清液中多酚質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——上清液的體積，mL；

N——容量瓶量程，mL；

W——青皮粉末的質(zhì)量，g；

M——提取液取液量，mL。

1.2.6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別對(duì)DESs 體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間3 個(gè)因素取三水平設(shè)計(jì)因素水平表，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)與表格采用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)圖繪制采用Gragh Pad 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Y=0.012 5X+0.114 2，R2=0.999。由圖1 可知，沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為0～100 μg/mL 與吸光度線性關(guān)系良好。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 DESs 體積分?jǐn)?shù)對(duì)青皮多酚提取的影響

DESs 體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 DESs 體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取量的影響

由圖2 可知，青皮多酚提取量隨著DESs 的體積分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)DESs 的體積分?jǐn)?shù)為0～50%時(shí)，多酚提取量隨著DESs 的體積分?jǐn)?shù)增加而增加；當(dāng)DESs 的體積分?jǐn)?shù)為50～100%時(shí)，多酚提取量隨著DESs 的體積分?jǐn)?shù)增加而降低。主要的原因是：①DESs 可在常溫下形成廣泛的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，使其具有高黏度的特征，體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)，DESs 黏度過(guò)大時(shí)限制有效成分的提??；②DESs 中加入一定量水后，離子水之間形成的氫鍵可降低DESs 的黏度，提高從固體到液體的傳質(zhì)速率。另外，多酚類(lèi)物質(zhì)是帶有多個(gè)羥基的極性物質(zhì)，水的加入可增加DESs 的極性，使DESs 的極性趨近于青皮多酚極性，促進(jìn)多酚類(lèi)物質(zhì)的溶解。但DESs 體積分?jǐn)?shù)過(guò)小時(shí)，水量添加過(guò)多可能破壞體系中的氫鍵，影響多酚類(lèi)物質(zhì)與DESs 的氫鍵作用，從而造成多酚類(lèi)物質(zhì)提取量降低。綜合考慮，DESs 的體積分?jǐn)?shù)宜為50%，此時(shí)多酚提取量最高，為287.16 mg/100 g。

2.2.2 料液比對(duì)青皮多酚提取的影響

料液比對(duì)多酚提取量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)多酚提取量的影響

多酚類(lèi)物質(zhì)提取過(guò)程中，物料與溶劑的比例對(duì)提取量有很大影響。由圖3 可知，當(dāng)青皮粉與DESs料液比小于1∶140 時(shí)，多酚提取量隨著料液比的增大而提高。可能是因?yàn)殡S著DESs 添加量增多，青皮粉與DESs 之間的接觸面積增大的同時(shí)，增大了兩者之間的濃度差，增強(qiáng)青皮多酚類(lèi)物質(zhì)向DESs 擴(kuò)散的傳質(zhì)推動(dòng)力，提高提取率。當(dāng)青皮粉與DESs 料液比為1∶140 時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大。當(dāng)料液比大于1∶140，DESs 趨于飽和時(shí)，多酚提取量隨著料液比的增大而降低，可能是因?yàn)楫?dāng)料液比過(guò)大時(shí)，多糖、果膠、可溶性蛋白等物質(zhì)的溶出影響了多酚類(lèi)物質(zhì)的溶解，使多酚提取量降低。綜合考慮，選擇1∶140 為最佳料液比。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)青皮多酚提取的影響

提取時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響見(jiàn)圖4。

由圖4 可知，在10～50 min 內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，青皮中多酚提取量呈增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。50 min 后，多酚提取量略有變化，但差異不明顯。因?yàn)槌暤目栈饔媚軌蚴骨嗥し壑械募?xì)胞發(fā)生破裂，釋放出多酚類(lèi)物質(zhì)。在初始階段，提取時(shí)間較短，多酚提取不完全，提取量低；延長(zhǎng)提取時(shí)間能夠增加DESs與青皮粉之間的傳質(zhì)，提取量增加；50 min 后，提取過(guò)程接近于固液平衡，擴(kuò)散速度降低，多酚提取量沒(méi)有顯著性增加。同時(shí)，超聲過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)破壞多酚物質(zhì)，提取時(shí)間為90 min 時(shí)多酚類(lèi)物質(zhì)略有下降。綜合考慮，選擇50 min 為最佳提取時(shí)間。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)方差分析見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析

以多酚提取量為考查指標(biāo)，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。由表2 可知，各因素對(duì)多酚提取效果的影響主次為料液比（A） ＞提取時(shí)間（C） ＞體積分?jǐn)?shù)（B）。由表3 可知，料液比對(duì)青皮多酚提取量影響顯著（p＜0.05）。數(shù)據(jù)顯示，超聲輔助低共熔溶劑提取青皮多酚最優(yōu)工藝條件為A3B1C3，即料液比1∶160，體積分?jǐn)?shù)40%，提取時(shí)間60 min。

3 結(jié)論

采用超聲輔助低共熔溶劑提取澳洲堅(jiān)果青皮中多酚類(lèi)物質(zhì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)方法優(yōu)化青皮多酚的最佳提取工藝。試驗(yàn)得到最優(yōu)提取工藝參數(shù)為料液比為1∶140，低共熔溶劑體積分?jǐn)?shù)40%，超聲提取時(shí)間60 min，此條件下多酚得率為439.64 mg/g，提取量?jī)?yōu)于前人報(bào)道結(jié)果，說(shuō)明低共熔溶劑具有良好的多酚提取能力。

不僅為澳洲堅(jiān)果加工產(chǎn)業(yè)處理青皮等副產(chǎn)物資源化、高值化的綜合利用提供了數(shù)據(jù)支撐，也為多酚、黃酮等生物活性成分提供了一種高效綠色環(huán)保的提取方法，在功能性食品領(lǐng)域上具有廣闊的應(yīng)用前景。