張靖鵬,解 芳,麻淑珍
(1.中國檢驗認(rèn)證集團(tuán)青海有限公司,青海西寧 810000;2.青??灯丈锟萍脊煞萦邢薰?,青海西寧 810003)
五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.) 又稱北五味子,是木蘭科植物干燥果實,含有豐富的木脂素、多糖、揮發(fā)油、黃酮和有機酸等[1],其中有效成分為五味子醇甲,又稱五味子素,包含五味子甲素、五味子乙素及五味子丙素,使五味子中重要的有效成分成為一些藥物的主要藥效物質(zhì)[2-3]。研究表明,五味子具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心等中醫(yī)功效,以及調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗疲勞、降血糖、保肝、抗衰老、抗腫瘤、抑制帕金森癥等作用[3-4],五味子醇甲還具有預(yù)防及治療神經(jīng)退行性疾病、緩解肝損傷、調(diào)節(jié)改善睡眠、緩解抑郁、抗氧化應(yīng)激及保護(hù)腦缺血等功效[5-13]。目前,工業(yè)生產(chǎn)中常采用70%~80%(V/V) 的乙醇對五味子醇甲進(jìn)行提取[14],輔以一定比例的輔料后使用噴霧干燥技術(shù)制備微膠囊[15]。劉慧等人[16]研究不同DE 值的麥芽糊精對五味子噴霧干燥的影響,發(fā)現(xiàn)加入麥芽糊精后得粉率增加,含水量降低,玻璃化轉(zhuǎn)變溫度升高,流動性變好,微觀形態(tài)呈球形。此外,通過研究五味子多糖微囊制備工藝發(fā)現(xiàn)通過優(yōu)化噴霧干燥工藝,在五味子多糖與殼聚糖質(zhì)量比為1∶3,進(jìn)風(fēng)溫度為160 ℃,進(jìn)料速度為5 mL/min,空氣流速為600 L/h條件下,所制備的微囊粉表面光潤且載藥量、收率、包封率及緩釋性能達(dá)到最佳[17]。饒小勇等人[18]通過對五味子提取物噴霧干燥工藝進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)輔料添加量及進(jìn)風(fēng)溫度均會影響五味子噴干粉的顆粒性質(zhì)。乙醇作為常用的浸提劑已被廣泛使用到植物提取物的生產(chǎn)及試驗中[19],但其不可難免會殘存在產(chǎn)品中。研究表明,乙醇可能對人體多個器官(如腸道、胃及腦) 均有損傷作用[20]。因此,如何進(jìn)一步在五味子醇提后的制粒過程中保留有效成分而去除乙醇?xì)埩舫蔀檠芯康闹攸c。
1,1 - 二苯基- 2 - 三硝基苯肼(2,2,-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)、2'- 聯(lián)氨- 雙- 3 - 乙基苯并噻唑啉- 6 - 磺酸(2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS) 均具有反應(yīng)穩(wěn)定、易操控等特點,常作為體外自由基清除能力評價指示劑使用,而總還原能力(Ferric Reducing Antioxidant Power,F(xiàn)RAP) 與銅離子還原能力(Cupric Reducing Antioxidant Power,CuPRAC) 則是通過還原金屬離子進(jìn)行評估的另一種體外抗氧化方法[21-22]。此外,通過響應(yīng)面法優(yōu)化五味子提取物噴霧干燥工藝,可進(jìn)一步提高有效成分含量及得率[23]。研究表明,五味子具備較強的抗氧化能力[3],通過對工藝優(yōu)化后的噴霧干燥工藝后所得的五味子醇提物進(jìn)行體外抗氧化試驗可以進(jìn)一步驗證提取物的抗氧化作用。
以五味子醇甲及乙醇?xì)埩袅繛轫憫?yīng)值,采用單因素分析、Box-benhnken 響應(yīng)面優(yōu)化五味子醇提物噴霧干燥工藝,通過體外抗氧化試驗對工藝優(yōu)化后的五味子醇提物的體外抗氧化能力進(jìn)行驗證評價,為五味子提取物的加工提供一定實踐及理論參考。
五味子,購自遼寧省岫巖滿族自治縣;食品級酒精(純度95%),梅河口市阜康酒精有限責(zé)任公司提供;DPPH、ABTS;2,9- 二甲基-1,10- 菲啰啉(新亞銅靈);L- 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品(維C) (Scientific Phygene);FRAP(T-AOC) 試劑盒,南京建成生物工程研究所提供;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
754PC 型紫外可見光分光光度計,上海元析儀器有限公司產(chǎn)品;ST-360 型酶標(biāo)儀,上??迫A生物工程股份有限公司產(chǎn)品;HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋,天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠產(chǎn)品;LPG-5 型噴霧干燥機組,江蘇先鋒干燥工程有限公司產(chǎn)品;R5002K 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海夏豐實業(yè)有限公司產(chǎn)品。
1.2.1 五味子醇提工藝
將五味子粉碎,加入乙醇(60%),提取2 h 后,濃縮至可溶性固形物含量為20%,添加一定比例輔料后進(jìn)行噴霧干燥,最終得到五味子醇提物。
1.2.2 單因素試驗
以噴霧干燥過程中不同進(jìn)口溫度、出口溫度、進(jìn)料速度與霧化器離心頻率進(jìn)行單因素試驗,考查不同因素對噴干粉中五味子醇甲含量及乙醇?xì)埩袅康挠绊?。除變化量外,試驗固定進(jìn)口溫度為160 ℃,出口溫度為80℃,進(jìn)料速度為3 mL/s,離心頻率為160 Hz,分別研究進(jìn)口溫度(140,150,160,170,180 ℃)、出口溫度(70,75,80,85,90 ℃)、進(jìn)料速度(1,2,3,4,5 mL/s)、離心頻率(140,150,160,170,180 Hz) 對五味子醇甲含量及乙醇?xì)埩袅康挠绊憽?/p>
1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計
根據(jù)單因素確定3 個水平,以進(jìn)口溫度、出口溫度、進(jìn)料速度與離心頻率為試驗因素,以五味子醇甲含量及乙醇?xì)埩袅繛轫憫?yīng)值,采取Box-behnken中心組合法進(jìn)行四因素三水平試驗設(shè)計。
響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計見表1。
表1 響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計
1.2.4 理化檢測
檢測噴干粉中五味子醇甲含量使用《中國藥典2020 年版》第一部五味子項下中五味子醇甲含量的檢測方法,檢測乙醇?xì)埩袅繀⒄铡吨袊幍?020 年第四部》通則0861 殘留溶劑測定法進(jìn)行測定。
1.2.5 體外抗氧化能力評價
樣品設(shè)置見表2。
表2 樣品設(shè)置
分別稱取4 種醇提物及維C 3.5 mg/mL 樣本溶液,對上述樣本溶液依次進(jìn)行梯度稀釋,得到1.0,2.0,2.5,3.0,3.5 mg/mL 質(zhì)量濃度梯度的樣本及對照品溶液。
(1) DPPH 自由基抗氧化能力測定。稱2 mgDPPH,用乙醇溶解定容至25 mL,得到DPPH 儲備液。吸取DPPH 儲備液15 mL 并用乙醇定容至25 mL,得到DPPH 工作液。于96 孔板中加入200 μL 的DPPH 工作液,再各自加入5 μL 樣本溶液和5 μL 維C 溶液,分別作為樣品組和陽性對照組,每隔5 min 于波長517 nm 處測定OD 值,直至測至30 min,空白對照組以乙醇代替樣本溶液。DPPH 自由基清除率計算公式為:
式中:OD1——空白對照組吸光度;
OD2——樣本組吸光度。
(2) ABTS 自由基抗氧化能力測定。稱取ABTS 57.6 mg,用濃度為0.02 mol/L 的醋酸緩沖液溶解,定容至15 mL。稱取硫酸鉀6.6 mg,用濃度為0.02 mol/L的醋酸緩沖液溶解,定容至10 mL。取ABTS 溶液5 mL和過硫酸鉀溶液5 mL,混勻后避光反應(yīng)12 h,得到ABTS 母液。吸取ABTS 母液280 μL,用濃度為0.02 mol/L 的醋酸緩沖液稀釋至6.5 mL,避光反應(yīng)30 min 后,即得ABTS 工作液。
將96 孔板中加入200 μL 的ABTS 工作液,再各自加入10 μL 樣本溶液和10 μL 維C 溶液,分別作為樣品組和陽性對照組。每隔10 min 于波長734 nm 處測定OD 值,直至測至60 min,空白對照組以乙醇代替樣本溶液。ABTS 自由基清除率計算公式為:
式中:OD1——空白對照組吸光度;
OD2——樣本組吸光度。
(3) FRAP 抗氧化能力測定。以試劑盒提供的試驗方法進(jìn)行試驗,于比色皿中加入1 800 μL FRAP工作液,再分別加入樣本溶液50 μL,將其置于25~37 ℃下孵育10 min,于波長520 nm 處檢測吸光度,根據(jù)吸光度計算公式:
式中:A1——測定組吸光度;
A2——空白組吸光度;
T——反應(yīng)時間(30 min);
V1——取樣量,mL;
V2——反應(yīng)液總體積,mL。
(4) CuPRAC 抗氧化能力測定。稱取CuCl2·2H2O 4.28 mg 加水溶解,定容至25 mL,搖勻備用;稱取19.27 g 醋酸銨加水溶解,定容至250 mL,搖勻備用;稱取164.89 mg 新亞銅靈(2,9- 二甲基-1,10- 菲啰啉) 加無水乙醇溶解,定容至100 mL,搖勻,避光保存。
吸取新亞銅靈溶液、CuCl2溶液和醋酸銨溶液各1 mL,分別加入維C(3.5 mg/mL) 溶液10,20,30,40,50,60 μL 后用無水乙醇補足4 mL,避光反應(yīng)30 min 后于波長450 nm 處檢測OD 值。作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程。按上述操作加入樣品溶液2.5 μL,反應(yīng)30 min 后于波長450 nm 處檢測OD 值。根據(jù)樣品OD 值,帶入回歸方程得到對應(yīng)的清除維C-Cu2+還原能力值。
1.2.6 數(shù)據(jù)分析
試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 17 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,每個試驗重復(fù)3 次。試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 17 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用單因素ANOVA 分析,以評價2 組差異的顯著性。使用Design Expert V8.0.5軟件對響應(yīng)面模型進(jìn)行分析。
2.1.1 進(jìn)口溫度對五味子醇提物中五味子醇甲含量及乙醇?xì)埩袅康挠绊?/p>
進(jìn)口溫度對噴干粉中五味子醇甲含量(a) 及乙醇?xì)埩袅浚╞) 的影響見圖1。
圖1 進(jìn)口溫度對噴干粉中五味子醇甲含量(a)及乙醇?xì)埩袅浚╞) 的影響
由圖1(a) 可知,當(dāng)進(jìn)口溫度為140~150 ℃時,噴干粉中五味子醇甲含量隨著進(jìn)口溫度的升高而增加,可能是由于水分及乙醇不斷散失造成五味子醇甲含量不斷增加[26]。當(dāng)進(jìn)口溫度升高至160 ℃以上時,五味子醇甲含量明顯下降,可能由于溫度過高導(dǎo)致五味子醇甲分解[24]。
由圖1(b) 可知,隨著進(jìn)口溫度上升,噴干粉中的乙醇?xì)埩袅恐饾u降低,可能是由于乙醇受熱后不斷散失而造成[24]。
2.1.2 出口溫度對五味子醇提物中五味子醇甲含量及乙醇?xì)埩袅康挠绊?/p>
出口溫度對噴干粉中五味子醇甲含量(a) 及乙醇?xì)埩袅浚╞) 的影響見圖2。
圖2 出口溫度對噴干粉中五味子醇甲含量(a)及乙醇?xì)埩袅浚╞) 的影響
由圖2(a) 可知,當(dāng)出口溫度為70~80 ℃時,噴干粉中五味子醇甲含量隨著進(jìn)口溫度的增加而增加,可能是由于水分及乙醇不斷散失造成五味子醇甲含量不斷增加[16]。當(dāng)出口溫度增加至85 ℃以上時,五味子醇甲含量略有下降,可能由于溫度過高導(dǎo)致五味子醇甲部分分解[14,18]。
由圖2(b) 可知,隨著出口溫度上升,噴干粉中的乙醇?xì)埩袅恐饾u降低,可能是由于乙醇受熱后不斷散失而造成[14]。
2.1.3 進(jìn)料速度對五味子醇提物中五味子醇甲含量及乙醇?xì)埩袅康挠绊?/p>
進(jìn)料速度對噴干粉中五味子醇甲含量(a) 及乙醇?xì)埩袅浚╞) 的影響見圖3。
圖3 進(jìn)料速度對噴干粉中五味子醇甲含量(a)及乙醇?xì)埩袅浚╞) 的影響
由圖3(a) 可知,當(dāng)進(jìn)料速度在3 mL/s 以下時,噴干粉中的五味子醇甲含量不斷升高,說明隨料液增加五味子醇甲受溫度影響較小并噴干粉中不斷累積,當(dāng)將進(jìn)料速度增加至3 mL/s 以上時,噴干粉中五味子醇甲含量會稍有下降,是由于進(jìn)料過快導(dǎo)致干燥效率降低,從而導(dǎo)致部分噴干粉出現(xiàn)粘壁,而塔壁溫度過高而導(dǎo)致五味子醇甲受熱分解[16,18]。
由圖3(b) 可知,隨著進(jìn)料速度增加,噴干粉中的乙醇?xì)埩袅恐饾u升高,可能是由于進(jìn)料速度過快而乙醇無法完全揮發(fā)[14]。
2.1.4 離心頻率對五味子醇提物中五味子醇甲含量及乙醇?xì)埩袅康挠绊?/p>
離心頻率對噴干粉中五味子醇甲含量(a) 及乙醇?xì)埩袅浚╞) 的影響見圖4。
圖4 離心頻率對噴干粉中五味子醇甲含量(a)及乙醇?xì)埩袅浚╞) 的影響
由圖4(a) 可知,當(dāng)霧化器離心頻率為160 Hz以下時,噴干粉中的五味子醇甲含量不斷升高,說明隨著霧化器離心頻率增加噴干粉霧化效果變好,五味子醇甲在噴干粉中不斷累積,當(dāng)將離心頻率增加至160 Hz 以上時,噴干粉中五味子醇甲含量會有所下降,可能由于離心頻率過快會導(dǎo)致干燥效率降低,導(dǎo)致部分噴干粉出現(xiàn)粘壁,塔壁溫度過高而導(dǎo)致五味子醇甲受熱分解[16,18]。
由圖4(b) 可知,隨著離心頻率增加,噴干粉中的乙醇?xì)埩袅恐饾u下降,至170 Hz 時則趨于平緩,可能是由于離心頻率過高,導(dǎo)致噴干粉霧化顆粒中水分及乙醇蒸發(fā)不徹底,導(dǎo)致乙醇無法完全揮發(fā)[16,18]。
2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果
在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選取進(jìn)口溫度、出口溫度、進(jìn)料速度及離心頻率4 個因素為變量,以噴干粉中五味子醇甲含量及乙醇?xì)埩袅繛轫憫?yīng)值,采用Design Expert 8.0.6 統(tǒng)計軟件進(jìn)行四因素三水平試驗。
響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。
表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果
采用Design Expert 8.0.6 軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸分析,對自變量A、B、C、D與五味子醇甲含量(方程A) 及乙醇?xì)埩袅浚ǚ匠藼) 進(jìn)行多元二項式方程擬合。回歸方程,如下:
方程A:
方程B:
2.2.2 響應(yīng)面方差分析
方差分析結(jié)果見表4。
表4 方差分析結(jié)果(b)
表4 方差分析結(jié)果(a)
回歸方程顯著性檢驗p<0.05,表明模型具有顯著性;失擬項p=0.082 7,0.198 0>0.05,表明方程擬合程度較高,無明顯失擬存在,此模型成立[23]。
出口溫度和進(jìn)口溫度的響應(yīng)面圖見圖5,進(jìn)料速度和進(jìn)口溫度的響應(yīng)面圖見圖6,離心頻率和進(jìn)口溫度的響應(yīng)面圖見圖7,進(jìn)料速度和出口溫度的響應(yīng)面圖見圖8,離心頻率和出口溫度的響應(yīng)面圖見圖9,進(jìn)料速度和離心頻率的響應(yīng)面圖見圖10。
圖5 出口溫度和進(jìn)口溫度的響應(yīng)面圖
圖7 離心頻率和進(jìn)口溫度的響應(yīng)面圖
圖8 進(jìn)料速度和出口溫度的響應(yīng)面圖
圖9 離心頻率和出口溫度的響應(yīng)面圖
圖10 進(jìn)料速度和離心頻率的響應(yīng)面圖
由圖5 ~圖10 可以直觀地反映各因素間的交互作用及各因素與響應(yīng)值間的關(guān)系。響應(yīng)面坡度越陡表示兩因素交互作用越大,反之則表示兩因素交互作用不顯著[23]。
經(jīng)軟件分析,五味子醇提物最佳噴霧干燥工藝為進(jìn)口溫度160.1 ℃,出口溫度85.4 ℃,進(jìn)料速度2.8 mL/s,離心頻率159.6 Hz,預(yù)測五味子醇甲含量為0.902 49%。為了便于控制試驗條件,將最佳工藝調(diào)整為進(jìn)口溫度160 ℃,出口溫度85 ℃,進(jìn)料速度3 mL/s,離心頻率為160 Hz。應(yīng)用此條件進(jìn)行3 次平行試驗,平均五味子醇甲含量為(0.85±0.01) %(RSD<2%),乙醇?xì)埩袅繛椋?.34±0.01) %(RSD<2%),與預(yù)測值接近,說明該模型可用于擬合分析,結(jié)果穩(wěn)定可靠,與其他研究的相關(guān)提取參數(shù)一致[23]。
2.3.1 DPPH 自由基清除能力測定
DPPH 抗氧化試驗(濃度測試(a))、反應(yīng)時長測試(b)) 見圖11。
圖11 DPPH 抗氧化試驗(質(zhì)量濃度測試(a))、反應(yīng)時長測試(b))
由圖11 可知,在相同活性成分濃度含量、反應(yīng)時間條件下,維C 及五味子醇提物D 對DPPH 自由基清除能力最強,五味子醇提物C(工藝優(yōu)化后)對DPPH 自由基也有較強的清除能力,五味子醇提物C 較具有較強的清除能力,五味子醇提物A 與B的清除能力相當(dāng),且均有劑量依賴性。其中,五味子醇提取C 的IC50(半清除率質(zhì)量濃度) 達(dá)3.5 mg/mL以上。40 min 時,3.5 mg/mL 的不同五味子醇提物對DPPH 自由基清除能力的順序為維C>五味子醇提物D>五味子醇提物C>五味子醇提物A>五味子醇提物B。
2.3.2 ABTS 自由基清除能力測定
ABTS 抗氧化試驗(濃度測試(a)、反應(yīng)時長測試(b)) 見圖12。
圖12 ABTS 抗氧化試驗(質(zhì)量濃度測試(a)、反應(yīng)時長測試(b))
由圖12 可知,在相同活性成分濃度含量、反應(yīng)時間條件下,維C 及五味子醇提物C(即工藝優(yōu)化后) 對DPPH 自由基清除能力最強,五味子醇提物D 較五味子醇提物B 具有較強的清除能力,五味子醇提物A 則清除能力最弱,且均有劑量依賴性。其中,五味子醇提取C 的IC50(半清除率質(zhì)量濃度) 在4.0 mg/mL 以下。40 min 時,5 mg/mL 的不同五味子醇提物對DPPH 自由基清除能力的順序為維C>五味子醇提物C>五味子醇提物B>五味子醇提物D>五味子醇提物A。
2.3.3 FRAP 抗氧化能力測定
FRAP 抗氧化試驗(質(zhì)量濃度測試) 見圖13。
圖13 FRAP 抗氧化試驗(質(zhì)量濃度測試)
由圖13 可知,五味子醇提物C(工藝優(yōu)化后)具有最強的還原能力,其次為五味子醇提物B 和D,五味子醇提物A 則相對較弱。
2.3.4 CuPRAC 抗氧化能力測定
CuPRAC 抗氧化試驗(質(zhì)量濃度測試) 見圖14。
圖14 CuPRAC 抗氧化試驗(質(zhì)量濃度測試)
由圖14 可知,從還原能力來看,五味子醇提物C(工藝優(yōu)化后) 對Cu2+離子的還原能力最強,五味子醇提物D 次之,五味子醇提物A 與B 還原能力幾乎一樣。
五味子醇甲作為五味子中重要的活性成分是評價產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)[2],多項研究都表明五味子醇甲具有一定藥效功能[3],是加工藥品或保健食品的重要藥用植物。作為醇溶性物質(zhì),五味子醇甲一直使用乙醇提取[14],可能造成噴霧干燥后終產(chǎn)品中的乙醇?xì)埩袅可?,最終造成對人體的危害[20]。
基于單因素試驗、響應(yīng)面優(yōu)化試驗,進(jìn)一步優(yōu)化五味子醇提取物噴霧干燥工序的相關(guān)關(guān)鍵工藝條件,從而得到最優(yōu)工藝條件。此外,通過使用體外抗氧化試驗的方法對工藝優(yōu)化前后所制備的噴干粉進(jìn)行對比試驗,試驗發(fā)現(xiàn)工藝優(yōu)化后的五味子醇提物較其他樣品具有更高的體外抗氧化能力,對人體更為有利[3]。通過單因素試驗發(fā)現(xiàn),進(jìn)、出口溫度的增加均可能會降低噴干粉中五味子醇甲的含量,進(jìn)料速度過快及離心頻率的增加可能導(dǎo)致乙醇?xì)埩袅窟^高。響應(yīng)面試驗表明,在最優(yōu)噴霧干燥工藝條件下,可以獲得五味子醇甲較高且乙醇?xì)埩袅枯^低的噴干粉。此外,體外抗氧化試驗結(jié)果顯示,通過工藝優(yōu)化所得的五味子醇提物較優(yōu)化前具有更高抗氧化特性,而醇提濃縮液相對抗氧化性較弱,可見噴干粉可以進(jìn)一步富集有效成分[18]。
通過單因素試驗及響應(yīng)面法設(shè)計優(yōu)化了五味子醇提物噴霧干燥工藝最佳工藝條件。結(jié)果表明,五味子醇提物的最佳工藝條件為進(jìn)口溫度160 ℃,出口溫度85 ℃,進(jìn)料速度3 mL/s,霧化器離心頻率160 Hz。應(yīng)用此條件進(jìn)行3 次平行試驗,平均五味子醇甲含量達(dá)到0.85%,乙醇?xì)埩袅繛?.34%。此外,通過進(jìn)行體外抗氧化試驗,發(fā)現(xiàn)五味子醇提物(工藝優(yōu)化后) 對ABTS 自由基、DPPH 自由基均有最較強清除能力,且對Cu2+的總抗氧化能力最強,進(jìn)一步說明工藝優(yōu)化后不但可以有效提高五味子醇甲的含量及將乙醇?xì)埩袅拷档阶畹?,最大程度地保留五味子中的抗氧化成分。由此,?jīng)過對五味子醇提物噴霧干燥工藝及抗氧化能力進(jìn)行研究,可以為五味子提取物的進(jìn)一步研制開發(fā)提供了一定的實踐及科學(xué)依據(jù)。