張靖鵬，解 芳，麻淑珍

（1.中國檢驗認證集團青海有限公司，青海西寧 810000；2.青?？灯丈锟萍脊煞萦邢薰荆嗪Ｎ鲗?810003）

五味子（Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.） 又稱北五味子，是木蘭科植物干燥果實，含有豐富的木脂素、多糖、揮發(fā)油、黃酮和有機酸等[1]，其中有效成分為五味子醇甲，又稱五味子素，包含五味子甲素、五味子乙素及五味子丙素，使五味子中重要的有效成分成為一些藥物的主要藥效物質[2-3]。研究表明，五味子具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心等中醫(yī)功效，以及調節(jié)免疫、抗氧化、抗疲勞、降血糖、保肝、抗衰老、抗腫瘤、抑制帕金森癥等作用[3-4]，五味子醇甲還具有預防及治療神經退行性疾病、緩解肝損傷、調節(jié)改善睡眠、緩解抑郁、抗氧化應激及保護腦缺血等功效[5-13]。目前，工業(yè)生產中常采用70%～80%（V/V） 的乙醇對五味子醇甲進行提取[14]，輔以一定比例的輔料后使用噴霧干燥技術制備微膠囊[15]。劉慧等人[16]研究不同DE 值的麥芽糊精對五味子噴霧干燥的影響，發(fā)現加入麥芽糊精后得粉率增加，含水量降低，玻璃化轉變溫度升高，流動性變好，微觀形態(tài)呈球形。此外，通過研究五味子多糖微囊制備工藝發(fā)現通過優(yōu)化噴霧干燥工藝，在五味子多糖與殼聚糖質量比為1∶3，進風溫度為160 ℃，進料速度為5 mL/min，空氣流速為600 L/h條件下，所制備的微囊粉表面光潤且載藥量、收率、包封率及緩釋性能達到最佳[17]。饒小勇等人[18]通過對五味子提取物噴霧干燥工藝進行研究，發(fā)現輔料添加量及進風溫度均會影響五味子噴干粉的顆粒性質。乙醇作為常用的浸提劑已被廣泛使用到植物提取物的生產及試驗中[19]，但其不可難免會殘存在產品中。研究表明，乙醇可能對人體多個器官（如腸道、胃及腦） 均有損傷作用[20]。因此，如何進一步在五味子醇提后的制粒過程中保留有效成分而去除乙醇殘留成為研究的重點。

1,1 - 二苯基- 2 - 三硝基苯肼（2,2,-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2'- 聯氨- 雙- 3 - 乙基苯并噻唑啉- 6 - 磺酸（2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 均具有反應穩(wěn)定、易操控等特點，常作為體外自由基清除能力評價指示劑使用，而總還原能力（Ferric Reducing Antioxidant Power，FRAP） 與銅離子還原能力（Cupric Reducing Antioxidant Power，CuPRAC） 則是通過還原金屬離子進行評估的另一種體外抗氧化方法[21-22]。此外，通過響應面法優(yōu)化五味子提取物噴霧干燥工藝，可進一步提高有效成分含量及得率[23]。研究表明，五味子具備較強的抗氧化能力[3]，通過對工藝優(yōu)化后的噴霧干燥工藝后所得的五味子醇提物進行體外抗氧化試驗可以進一步驗證提取物的抗氧化作用。

以五味子醇甲及乙醇殘留量為響應值，采用單因素分析、Box-benhnken 響應面優(yōu)化五味子醇提物噴霧干燥工藝，通過體外抗氧化試驗對工藝優(yōu)化后的五味子醇提物的體外抗氧化能力進行驗證評價，為五味子提取物的加工提供一定實踐及理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及設備

五味子，購自遼寧省岫巖滿族自治縣；食品級酒精（純度95%），梅河口市阜康酒精有限責任公司提供；DPPH、ABTS；2,9- 二甲基-1,10- 菲啰啉（新亞銅靈）；L- 抗壞血酸標準品（維C） （Scientific Phygene）；FRAP（T-AOC） 試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；其余試劑均為國產分析純。

754PC 型紫外可見光分光光度計，上海元析儀器有限公司產品；ST-360 型酶標儀，上海科華生物工程股份有限公司產品；HH-4 型數顯恒溫水浴鍋，天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠產品；LPG-5 型噴霧干燥機組，江蘇先鋒干燥工程有限公司產品；R5002K 型旋轉蒸發(fā)儀，上海夏豐實業(yè)有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 五味子醇提工藝

將五味子粉碎，加入乙醇（60%），提取2 h 后，濃縮至可溶性固形物含量為20%，添加一定比例輔料后進行噴霧干燥，最終得到五味子醇提物。

1.2.2 單因素試驗

以噴霧干燥過程中不同進口溫度、出口溫度、進料速度與霧化器離心頻率進行單因素試驗，考查不同因素對噴干粉中五味子醇甲含量及乙醇殘留量的影響。除變化量外，試驗固定進口溫度為160 ℃，出口溫度為80℃，進料速度為3 mL/s，離心頻率為160 Hz，分別研究進口溫度（140，150，160，170，180 ℃）、出口溫度（70，75，80，85，90 ℃）、進料速度（1，2，3，4，5 mL/s）、離心頻率（140，150，160，170，180 Hz） 對五味子醇甲含量及乙醇殘留量的影響。

1.2.3 響應面試驗設計

根據單因素確定3 個水平，以進口溫度、出口溫度、進料速度與離心頻率為試驗因素，以五味子醇甲含量及乙醇殘留量為響應值，采取Box-behnken中心組合法進行四因素三水平試驗設計。

響應面試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計

1.2.4 理化檢測

檢測噴干粉中五味子醇甲含量使用《中國藥典2020 年版》第一部五味子項下中五味子醇甲含量的檢測方法，檢測乙醇殘留量參照《中國藥典2020 年第四部》通則0861 殘留溶劑測定法進行測定。

1.2.5 體外抗氧化能力評價

樣品設置見表2。

表2 樣品設置

分別稱取4 種醇提物及維C 3.5 mg/mL 樣本溶液，對上述樣本溶液依次進行梯度稀釋，得到1.0，2.0，2.5，3.0，3.5 mg/mL 質量濃度梯度的樣本及對照品溶液。

（1） DPPH 自由基抗氧化能力測定。稱2 mgDPPH，用乙醇溶解定容至25 mL，得到DPPH 儲備液。吸取DPPH 儲備液15 mL 并用乙醇定容至25 mL，得到DPPH 工作液。于96 孔板中加入200 μL 的DPPH 工作液，再各自加入5 μL 樣本溶液和5 μL 維C 溶液，分別作為樣品組和陽性對照組，每隔5 min 于波長517 nm 處測定OD 值，直至測至30 min，空白對照組以乙醇代替樣本溶液。DPPH 自由基清除率計算公式為：

式中：OD1——空白對照組吸光度；

OD2——樣本組吸光度。

（2） ABTS 自由基抗氧化能力測定。稱取ABTS 57.6 mg，用濃度為0.02 mol/L 的醋酸緩沖液溶解，定容至15 mL。稱取硫酸鉀6.6 mg，用濃度為0.02 mol/L的醋酸緩沖液溶解，定容至10 mL。取ABTS 溶液5 mL和過硫酸鉀溶液5 mL，混勻后避光反應12 h，得到ABTS 母液。吸取ABTS 母液280 μL，用濃度為0.02 mol/L 的醋酸緩沖液稀釋至6.5 mL，避光反應30 min 后，即得ABTS 工作液。

將96 孔板中加入200 μL 的ABTS 工作液，再各自加入10 μL 樣本溶液和10 μL 維C 溶液，分別作為樣品組和陽性對照組。每隔10 min 于波長734 nm 處測定OD 值，直至測至60 min，空白對照組以乙醇代替樣本溶液。ABTS 自由基清除率計算公式為：

式中：OD1——空白對照組吸光度；

OD2——樣本組吸光度。

（3） FRAP 抗氧化能力測定。以試劑盒提供的試驗方法進行試驗，于比色皿中加入1 800 μL FRAP工作液，再分別加入樣本溶液50 μL，將其置于25～37 ℃下孵育10 min，于波長520 nm 處檢測吸光度，根據吸光度計算公式：

式中：A1——測定組吸光度；

A2——空白組吸光度；

T——反應時間（30 min）；

V1——取樣量，mL；

V2——反應液總體積，mL。

（4） CuPRAC 抗氧化能力測定。稱取CuCl2·2H2O 4.28 mg 加水溶解，定容至25 mL，搖勻備用；稱取19.27 g 醋酸銨加水溶解，定容至250 mL，搖勻備用；稱取164.89 mg 新亞銅靈（2,9- 二甲基-1,10- 菲啰啉） 加無水乙醇溶解，定容至100 mL，搖勻，避光保存。

吸取新亞銅靈溶液、CuCl2溶液和醋酸銨溶液各1 mL，分別加入維C（3.5 mg/mL） 溶液10，20，30，40，50，60 μL 后用無水乙醇補足4 mL，避光反應30 min 后于波長450 nm 處檢測OD 值。作標準曲線，得回歸方程。按上述操作加入樣品溶液2.5 μL，反應30 min 后于波長450 nm 處檢測OD 值。根據樣品OD 值，帶入回歸方程得到對應的清除維C-Cu2+還原能力值。

1.2.6 數據分析

試驗數據使用SPSS 17 軟件對數據進行統計分析，每個試驗重復3 次。試驗數據使用SPSS 17 軟件進行統計分析。數據采用單因素ANOVA 分析，以評價2 組差異的顯著性。使用Design Expert V8.0.5軟件對響應面模型進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果及分析

2.1.1 進口溫度對五味子醇提物中五味子醇甲含量及乙醇殘留量的影響

進口溫度對噴干粉中五味子醇甲含量（a） 及乙醇殘留量（b） 的影響見圖1。

圖1 進口溫度對噴干粉中五味子醇甲含量（a）及乙醇殘留量（b） 的影響

由圖1（a） 可知，當進口溫度為140～150 ℃時，噴干粉中五味子醇甲含量隨著進口溫度的升高而增加，可能是由于水分及乙醇不斷散失造成五味子醇甲含量不斷增加[26]。當進口溫度升高至160 ℃以上時，五味子醇甲含量明顯下降，可能由于溫度過高導致五味子醇甲分解[24]。

由圖1（b） 可知，隨著進口溫度上升，噴干粉中的乙醇殘留量逐漸降低，可能是由于乙醇受熱后不斷散失而造成[24]。

2.1.2 出口溫度對五味子醇提物中五味子醇甲含量及乙醇殘留量的影響

出口溫度對噴干粉中五味子醇甲含量（a） 及乙醇殘留量（b） 的影響見圖2。

圖2 出口溫度對噴干粉中五味子醇甲含量（a）及乙醇殘留量（b） 的影響

由圖2（a） 可知，當出口溫度為70～80 ℃時，噴干粉中五味子醇甲含量隨著進口溫度的增加而增加，可能是由于水分及乙醇不斷散失造成五味子醇甲含量不斷增加[16]。當出口溫度增加至85 ℃以上時，五味子醇甲含量略有下降，可能由于溫度過高導致五味子醇甲部分分解[14，18]。

由圖2（b） 可知，隨著出口溫度上升，噴干粉中的乙醇殘留量逐漸降低，可能是由于乙醇受熱后不斷散失而造成[14]。

2.1.3 進料速度對五味子醇提物中五味子醇甲含量及乙醇殘留量的影響

進料速度對噴干粉中五味子醇甲含量（a） 及乙醇殘留量（b） 的影響見圖3。

圖3 進料速度對噴干粉中五味子醇甲含量（a）及乙醇殘留量（b） 的影響

由圖3（a） 可知，當進料速度在3 mL/s 以下時，噴干粉中的五味子醇甲含量不斷升高，說明隨料液增加五味子醇甲受溫度影響較小并噴干粉中不斷累積，當將進料速度增加至3 mL/s 以上時，噴干粉中五味子醇甲含量會稍有下降，是由于進料過快導致干燥效率降低，從而導致部分噴干粉出現粘壁，而塔壁溫度過高而導致五味子醇甲受熱分解[16，18]。

由圖3（b） 可知，隨著進料速度增加，噴干粉中的乙醇殘留量逐漸升高，可能是由于進料速度過快而乙醇無法完全揮發(fā)[14]。

2.1.4 離心頻率對五味子醇提物中五味子醇甲含量及乙醇殘留量的影響

離心頻率對噴干粉中五味子醇甲含量（a） 及乙醇殘留量（b） 的影響見圖4。

圖4 離心頻率對噴干粉中五味子醇甲含量（a）及乙醇殘留量（b） 的影響

由圖4（a） 可知，當霧化器離心頻率為160 Hz以下時，噴干粉中的五味子醇甲含量不斷升高，說明隨著霧化器離心頻率增加噴干粉霧化效果變好，五味子醇甲在噴干粉中不斷累積，當將離心頻率增加至160 Hz 以上時，噴干粉中五味子醇甲含量會有所下降，可能由于離心頻率過快會導致干燥效率降低，導致部分噴干粉出現粘壁，塔壁溫度過高而導致五味子醇甲受熱分解[16，18]。

由圖4（b） 可知，隨著離心頻率增加，噴干粉中的乙醇殘留量逐漸下降，至170 Hz 時則趨于平緩，可能是由于離心頻率過高，導致噴干粉霧化顆粒中水分及乙醇蒸發(fā)不徹底，導致乙醇無法完全揮發(fā)[16，18]。

2.2 響應面優(yōu)化分析

2.2.1 響應面試驗結果

在單因素試驗的基礎上，選取進口溫度、出口溫度、進料速度及離心頻率4 個因素為變量，以噴干粉中五味子醇甲含量及乙醇殘留量為響應值，采用Design Expert 8.0.6 統計軟件進行四因素三水平試驗。

響應面試驗設計及結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果

采用Design Expert 8.0.6 軟件對試驗結果進行二次多元回歸分析，對自變量A、B、C、D與五味子醇甲含量（方程A） 及乙醇殘留量（方程B） 進行多元二項式方程擬合。回歸方程，如下：

方程A：

方程B：

2.2.2 響應面方差分析

方差分析結果見表4。

表4 方差分析結果（b）

表4 方差分析結果（a）

回歸方程顯著性檢驗p＜0.05，表明模型具有顯著性；失擬項p=0.082 7，0.198 0＞0.05，表明方程擬合程度較高，無明顯失擬存在，此模型成立[23]。

出口溫度和進口溫度的響應面圖見圖5，進料速度和進口溫度的響應面圖見圖6，離心頻率和進口溫度的響應面圖見圖7，進料速度和出口溫度的響應面圖見圖8，離心頻率和出口溫度的響應面圖見圖9，進料速度和離心頻率的響應面圖見圖10。

圖5 出口溫度和進口溫度的響應面圖

圖7 離心頻率和進口溫度的響應面圖

圖8 進料速度和出口溫度的響應面圖

圖9 離心頻率和出口溫度的響應面圖

圖10 進料速度和離心頻率的響應面圖

由圖5 ～圖10 可以直觀地反映各因素間的交互作用及各因素與響應值間的關系。響應面坡度越陡表示兩因素交互作用越大，反之則表示兩因素交互作用不顯著[23]。

經軟件分析，五味子醇提物最佳噴霧干燥工藝為進口溫度160.1 ℃，出口溫度85.4 ℃，進料速度2.8 mL/s，離心頻率159.6 Hz，預測五味子醇甲含量為0.902 49%。為了便于控制試驗條件，將最佳工藝調整為進口溫度160 ℃，出口溫度85 ℃，進料速度3 mL/s，離心頻率為160 Hz。應用此條件進行3 次平行試驗，平均五味子醇甲含量為（0.85±0.01） %（RSD＜2%），乙醇殘留量為（0.34±0.01） %（RSD＜2%），與預測值接近，說明該模型可用于擬合分析，結果穩(wěn)定可靠，與其他研究的相關提取參數一致[23]。

2.3 體外抗氧化試驗結果

2.3.1 DPPH 自由基清除能力測定

DPPH 抗氧化試驗（濃度測試（a））、反應時長測試（b）） 見圖11。

圖11 DPPH 抗氧化試驗（質量濃度測試（a））、反應時長測試（b））

由圖11 可知，在相同活性成分濃度含量、反應時間條件下，維C 及五味子醇提物D 對DPPH 自由基清除能力最強，五味子醇提物C（工藝優(yōu)化后）對DPPH 自由基也有較強的清除能力，五味子醇提物C 較具有較強的清除能力，五味子醇提物A 與B的清除能力相當，且均有劑量依賴性。其中，五味子醇提取C 的IC50（半清除率質量濃度） 達3.5 mg/mL以上。40 min 時，3.5 mg/mL 的不同五味子醇提物對DPPH 自由基清除能力的順序為維C＞五味子醇提物D＞五味子醇提物C＞五味子醇提物A＞五味子醇提物B。

2.3.2 ABTS 自由基清除能力測定

ABTS 抗氧化試驗（濃度測試（a）、反應時長測試（b）） 見圖12。

圖12 ABTS 抗氧化試驗（質量濃度測試（a）、反應時長測試（b））

由圖12 可知，在相同活性成分濃度含量、反應時間條件下，維C 及五味子醇提物C（即工藝優(yōu)化后） 對DPPH 自由基清除能力最強，五味子醇提物D 較五味子醇提物B 具有較強的清除能力，五味子醇提物A 則清除能力最弱，且均有劑量依賴性。其中，五味子醇提取C 的IC50（半清除率質量濃度） 在4.0 mg/mL 以下。40 min 時，5 mg/mL 的不同五味子醇提物對DPPH 自由基清除能力的順序為維C＞五味子醇提物C＞五味子醇提物B＞五味子醇提物D＞五味子醇提物A。

2.3.3 FRAP 抗氧化能力測定

FRAP 抗氧化試驗（質量濃度測試） 見圖13。

圖13 FRAP 抗氧化試驗（質量濃度測試）

由圖13 可知，五味子醇提物C（工藝優(yōu)化后）具有最強的還原能力，其次為五味子醇提物B 和D，五味子醇提物A 則相對較弱。

2.3.4 CuPRAC 抗氧化能力測定

CuPRAC 抗氧化試驗（質量濃度測試） 見圖14。

圖14 CuPRAC 抗氧化試驗（質量濃度測試）

由圖14 可知，從還原能力來看，五味子醇提物C（工藝優(yōu)化后） 對Cu2+離子的還原能力最強，五味子醇提物D 次之，五味子醇提物A 與B 還原能力幾乎一樣。

3 討論

五味子醇甲作為五味子中重要的活性成分是評價產品品質的重要指標[2]，多項研究都表明五味子醇甲具有一定藥效功能[3]，是加工藥品或保健食品的重要藥用植物。作為醇溶性物質，五味子醇甲一直使用乙醇提取[14]，可能造成噴霧干燥后終產品中的乙醇殘留量升高，最終造成對人體的危害[20]。

基于單因素試驗、響應面優(yōu)化試驗，進一步優(yōu)化五味子醇提取物噴霧干燥工序的相關關鍵工藝條件，從而得到最優(yōu)工藝條件。此外，通過使用體外抗氧化試驗的方法對工藝優(yōu)化前后所制備的噴干粉進行對比試驗，試驗發(fā)現工藝優(yōu)化后的五味子醇提物較其他樣品具有更高的體外抗氧化能力，對人體更為有利[3]。通過單因素試驗發(fā)現，進、出口溫度的增加均可能會降低噴干粉中五味子醇甲的含量，進料速度過快及離心頻率的增加可能導致乙醇殘留量過高。響應面試驗表明，在最優(yōu)噴霧干燥工藝條件下，可以獲得五味子醇甲較高且乙醇殘留量較低的噴干粉。此外，體外抗氧化試驗結果顯示，通過工藝優(yōu)化所得的五味子醇提物較優(yōu)化前具有更高抗氧化特性，而醇提濃縮液相對抗氧化性較弱，可見噴干粉可以進一步富集有效成分[18]。

4 結論

通過單因素試驗及響應面法設計優(yōu)化了五味子醇提物噴霧干燥工藝最佳工藝條件。結果表明，五味子醇提物的最佳工藝條件為進口溫度160 ℃，出口溫度85 ℃，進料速度3 mL/s，霧化器離心頻率160 Hz。應用此條件進行3 次平行試驗，平均五味子醇甲含量達到0.85%，乙醇殘留量為0.34%。此外，通過進行體外抗氧化試驗，發(fā)現五味子醇提物（工藝優(yōu)化后） 對ABTS 自由基、DPPH 自由基均有最較強清除能力，且對Cu2+的總抗氧化能力最強，進一步說明工藝優(yōu)化后不但可以有效提高五味子醇甲的含量及將乙醇殘留量降到最低，最大程度地保留五味子中的抗氧化成分。由此，經過對五味子醇提物噴霧干燥工藝及抗氧化能力進行研究，可以為五味子提取物的進一步研制開發(fā)提供了一定的實踐及科學依據。