韓欣悅，胡曉晴，劉 強(qiáng)，樊 宇，江思雨，陳紅玲

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州 234000）

牛蒡（Arctium lappaL.），又名大力子、東洋參，是菊科牛蒡?qū)僦备刀晟荼局参颷1]，在世界各地方均有種植，并且在我國已有近2 000 年的種植史，分布于江蘇、安徽、黑龍江、山東等地區(qū)，其中在江蘇徐州豐縣、沛縣和山東蘭陵縣種植歷史最悠久，面積規(guī)模最大。作為我國傳統(tǒng)中藥，其果實(shí)、根和葉均可作為藥用，現(xiàn)已被世界公認(rèn)為保健食品。牛蒡根中含有豐富的多糖、酚類物質(zhì)、蛋白質(zhì)[2]、氨基酸、維生素，以及鈣、鋅、磷、鐵等多種人體所需的營養(yǎng)物質(zhì)和礦物質(zhì)。已有研究表明，牛蒡根具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)神經(jīng)、降糖降脂、調(diào)節(jié)免疫[3]等作用，鑒于其豐富的藥理活性，有研究報(bào)道了不同基因型牛蒡根中咖啡?？鼘幩岷湍局氐亩糠治鼋Y(jié)果，并對其抗氧化活性進(jìn)行了研究，開發(fā)了具有較強(qiáng)抗氧化活性和良好色澤的牛蒡根茶，對焙燒效果進(jìn)行了測定，該試驗(yàn)為后續(xù)對牛蒡根的研究提供了理論支持[4]。

近年來，隨著酵素產(chǎn)品應(yīng)用市場的擴(kuò)展[5]，消費(fèi)者逐漸認(rèn)識(shí)到酵素的營養(yǎng)價(jià)值。研究表明[2]，酵素中含有豐富的維生素類、氨基酸和酚類、黃酮苷類化合物、礦物質(zhì)、功效性低聚糖和功效酶等多種功能性成分，部分研究報(bào)道也表明酵素有抑菌消炎、抗衰、優(yōu)化體內(nèi)環(huán)境、抗癌、凈化血液、調(diào)節(jié)免疫、修復(fù)機(jī)體損傷等方面的藥物活性。因此，若能開發(fā)出一種牛蒡（主要原料） 與酵素結(jié)合的[7]具有保健功能的新型產(chǎn)品[6]，不僅能夠進(jìn)一步綜合產(chǎn)品的保健性能，還能拓展牛蒡類休閑食品的范疇，提高對牛蒡植物的資源利用。

通過對牛蒡根（主要原料） 復(fù)合山藥、火龍果、葡萄、蘋果、檸檬等果蔬進(jìn)行試驗(yàn)[7]。以米曲霉（Aspergillus oryzae）[8]為發(fā)酵菌種，進(jìn)行人工發(fā)酵處理，合理調(diào)整發(fā)酵過程，減少發(fā)酵周期以制備牛蒡根復(fù)合果蔬酵素。以pH 值、糖度、酒精度、菌落數(shù)、大腸桿菌數(shù)（Number ofEscherichia coli）、致病菌數(shù)作為評價(jià)指標(biāo)，通過單因素方差試驗(yàn)分析（ANOVA）[10]和Box-behnken 響應(yīng)曲面試驗(yàn)[11]設(shè)計(jì)完善發(fā)酵條件，整合最優(yōu)發(fā)酵條件組合，為牛蒡根復(fù)合果蔬酵素的綜合性研發(fā)提供一定理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛蒡（Arctium lappaL.） 品種為柳川理想，購自江蘇省徐州市豐縣；土豆、山藥、火龍果、葡萄、蘋果、檸檬、枸杞等，均購自當(dāng)?shù)厥袌觯幻浊梗ˋspergillus oryzae≥90%），上海麥克林生化科技有限公司提供；食品級二氧化氯（ClO2），遼寧眾發(fā)生物科技有限公司提供；食品級檸檬酸，河南萬?；ぎa(chǎn)品有限公司提供；異抗壞血酸鈉，濟(jì)南魯輝化工有限公司提供；葡萄糖（C6H12O6），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004 型電子天平，山東濰坊盛翔試驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；BBS-SSC 型超凈工作臺(tái)，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司產(chǎn)品；JJ-2 型組織搗碎機(jī)，安慶結(jié)佳儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SHA-C 型水浴恒溫振蕩器，常州潤華電器有限公司產(chǎn)品；TGL-20B 型離心機(jī)，上海雙旭電子有限公司產(chǎn)品；JX-24 型打漿機(jī)，福州金翔食品機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；DSX-24L-1型高壓蒸汽滅菌器，四川高能科迪儀器有限公司產(chǎn)品；UV752 型紫外- 可見分光光度計(jì)，山東歐萊博醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；PB-10 型標(biāo)準(zhǔn)型pH 計(jì)，廣東正一實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

①制備米曲霉菌。參考文獻(xiàn)[13]第二章、第三章進(jìn)行米曲霉菌的分離篩選；

②新鮮牛蒡→低溫貯存→切除保鮮頭→清洗去皮→殺菌→糖化→去表皮→碎裂→浸漬；

③復(fù)合果蔬（山藥、火龍果、蘋果等） →清洗去皮→殺菌→去表皮→切塊→打漿；

④紫皮葡萄→清洗→殺菌→去表皮→搗碎；

①+②+③+④→混合攪拌均勻→密封發(fā)酵→牛蒡根果蔬復(fù)合酵素。

1.3.2 試驗(yàn)方法

（1） 將新鮮牛蒡在置于-5 ℃恒溫中貯存2 d 以上，將貯存后的牛蒡在超凈工作臺(tái)上切除保鮮頭、清洗去皮、在殺菌液75%乙醇溶液中殺菌3 h 后，將其放在糖化庫內(nèi)糖化70 d，糖化過的牛蒡去表皮，去皮的厚度為0.3～0.5 mm，將去皮過的牛蒡用粉碎機(jī)碎裂，按牛蒡的質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入25%白砂糖，15%護(hù)色液，護(hù)色液由（質(zhì)量百分比） 檸檬酸0.02%～0.10%，氯化鈣0.5%～1.5%、食鹽0.5%～0.8%和余量的水配制而成，均勻攪拌，用200 目過濾網(wǎng)過濾，在25 ℃條件下恒溫80 min。

（2） 將復(fù)合果蔬（山藥、火龍果、蘋果等） 分別在超凈工作臺(tái)上清洗去皮，在殺菌液中殺菌1 h后去表皮、切塊、打漿，打漿溫度控制在7～9 ℃，打漿速度為600～700 r/min，打漿時(shí)每隔1 min 加入各質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的護(hù)色液。

（3） 將紫皮葡萄在超凈工作臺(tái)上清新干凈后，在殺菌液中殺菌30 min 后去皮搗碎備用。

（4） 將碎牛蒡、復(fù)合果蔬（山藥、火龍果、蘋果等） 分別混合，然后加入備用的按混合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的6%紫皮葡萄后放入密封發(fā)酵玻璃罐，于20～30 ℃恒溫箱中發(fā)酵45～55 d，pH 值穩(wěn)定在3.0～3.5 即判斷發(fā)酵結(jié)束。

1.3.3 樣品液的制備

在整個(gè)發(fā)酵過程中，每隔8 d 取樣一次進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。樣品的制備：取20 mL 酵素原液（發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵物分層，上層為發(fā)酵果肉殘?jiān)?，中層液體為酵素） 以轉(zhuǎn)速3 500 r/min 離心10 min，取上清液得到樣品。

1.3.4 理化指標(biāo)測定

pH 值測定，參考文獻(xiàn)[14]中pH 計(jì)測定方法；糖度測定，參考文獻(xiàn)[15]中糖度計(jì)折光儀測定方法；酒精度測定，參考文獻(xiàn)[16]中酒度計(jì)測定方法。

1.3.5 微生物指標(biāo)測定

菌落總數(shù)測定：參考文獻(xiàn)[17]中GB 4789.2—2010 菌落總數(shù)測定方法；大腸桿菌群數(shù)測定：參考文獻(xiàn)[18]中GB 2789.3—2010 大腸桿菌群數(shù)測定方法；致病菌數(shù)測定：參考文獻(xiàn)[19]中GB 4789.15—2010 致病菌數(shù)測定方法。

1.3.6 感官評分標(biāo)準(zhǔn)

試驗(yàn)中由10 位具有專業(yè)知識(shí)的教師感官鑒評，小組根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行感官鑒定。

牛蒡根果蔬復(fù)合酵素的感官評分見表1。

表1 牛蒡根果蔬復(fù)合酵素的感官評分

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析[23]

2.1.1 發(fā)酵溫度對果蔬復(fù)合酵素感官評分的影響

發(fā)酵溫度對果蔬復(fù)合酵素感官評分的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對果蔬復(fù)合酵素感官評分的影響

由圖1 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，果蔬復(fù)合酵素的評分呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。因?yàn)榘l(fā)酵溫度過低，微生物代謝緩慢；發(fā)酵溫度過高，米曲霉菌的活性受到抑制；當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，評分最高，即果蔬復(fù)合酵素的最適發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)口感最佳。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對果蔬復(fù)合酵素感官評分的影響

發(fā)酵時(shí)間對果蔬復(fù)合酵素感官評分的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對果蔬復(fù)合酵素感官評分的影響

由圖2 可知，隨著酵素發(fā)酵時(shí)間的延長，果蔬復(fù)合酵素的評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。因?yàn)橛捎诎l(fā)酵時(shí)間的延長，米曲霉菌的種類和數(shù)量不斷減少，發(fā)酵過程接近終止。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為50 d 時(shí)，評分最高，即果蔬復(fù)合酵素的最適發(fā)酵時(shí)間為50 d 時(shí)香味濃郁醇厚。

2.1.3 米曲霉菌種接種量對果蔬復(fù)合酵素感官評分的影響

米曲霉菌種接種量對果蔬復(fù)合酵素感官評分的影響見圖3。

圖3 米曲霉菌種接種量對果蔬復(fù)合酵素感官評分的影響

由圖3 可知，隨著米曲霉菌種接種量的增加，果蔬復(fù)合酵素的評分呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在菌種接種量為2%時(shí)，評分最高，即果蔬復(fù)合酵素加入的最適米曲霉菌種量為2%時(shí)發(fā)酵最好。

2.1.4 紫皮葡萄添加量對果蔬復(fù)合酵素感官評分的影響

紫皮葡萄添加量對果蔬復(fù)合酵素感官評分的影響見圖4。

圖4 紫皮葡萄添加量對果蔬復(fù)合酵素感官評分的影響

由圖4 可知，隨著加入紫皮葡萄量的增加，果蔬復(fù)合酵素的評分呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。在紫皮葡萄添加量為6%時(shí)，評分最高，即果蔬復(fù)合酵素中最適紫皮葡萄量為6%時(shí)口感細(xì)膩爽滑。

2.2 正交試驗(yàn)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、菌種接種量、紫皮葡萄添加量對感官評分的影響進(jìn)行正交試驗(yàn)分析。

正交試驗(yàn)分析結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)分析結(jié)果

由表2 可知，各因素對果蔬復(fù)合酵素品質(zhì)和風(fēng)味的影響主次順序?yàn)镈＞C＞A＞B，通過正交試驗(yàn)結(jié)果分析可知，果蔬復(fù)合酵素研發(fā)的最優(yōu)配方組合為A3B2C3D2，此時(shí)產(chǎn)品的感官評分為90.25 分，即最適發(fā)酵溫度為25 ℃，發(fā)酵時(shí)間為50 d，米曲霉菌種接種量為2%，紫皮葡萄添加量為6%。

2.3 產(chǎn)品品質(zhì)檢測結(jié)果

2.3.1 感官指標(biāo)

色澤有澤感，澄清透亮；風(fēng)味，濃郁清香；口感，清新爽口，口感細(xì)膩；澄清度，均勻透明，無可見雜質(zhì)；質(zhì)地，富有彈性。

2.3.2 理化指標(biāo)測定

pH 值小于4，糖度小于600 mg/mL，酒精度小于0.50/100 g，符合酵素理化指標(biāo)檢測要求。

2.3.3 微生物指標(biāo)

經(jīng)檢測，細(xì)菌總數(shù)小于100 CFU/g，大腸菌群小于3 MPN/100 g，致病菌未檢出，符合酵素微生物指標(biāo)檢測要求。

3 結(jié)論

通過試驗(yàn)分析可知，牛蒡根果蔬復(fù)合酵素的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間50 d，米曲霉菌接種量2%，紫皮葡萄添加量6%。在此生產(chǎn)工藝下的酵素產(chǎn)品口感清新爽口、口味最佳，更進(jìn)一步綜合性發(fā)揮酵素產(chǎn)品的保健性能。