李 倩,王 珂,張慧敏

胃癌是常見的消化道腫瘤,患者5年生存率為18%左右[1]。胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲是不良預(yù)后的主要原因,而新生血管會促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移,因此尋找腫瘤血管生成的生物學(xué)機(jī)制并尋找潛在治療靶點具有重要意義[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白4B(reticulon 4B,RTN 4B),又稱為Nogo-B,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白4家族成員之一,在肝臟、卵巢、胃和血管等組織中均有表達(dá),在細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換和血管重構(gòu)等病理生理學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[3-5]。RTN 4B也會促進(jìn)血管生成[6]。近年來發(fā)現(xiàn),RTN 4B可能作為癌基因在卵巢癌和結(jié)直腸癌等發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[5,7]。然而RTN 4B與胃癌的關(guān)系既往少有報道。為了探討RTN 4B在胃癌中的作用,本研究檢測RTN 4B在胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中的表達(dá),并分析沉默或過表達(dá)RTN 4B對胃癌血管生成的影響。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2023年1-3月在我院手術(shù)切除的胃癌組織及配對的癌旁組織(距離癌組織邊緣>5 cm)各15例。其中男10例,女5例;年齡39～71歲,平均(54.90±7.10)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)病理學(xué)證實為胃癌;(2)術(shù)前未接受放化療;(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他部位腫瘤;(2)嚴(yán)重心肝腎功能異常;(3)免疫或代謝性疾病。

1.2 細(xì)胞與主要試劑 胃癌細(xì)胞系(AGS、NCI-N87、MGC803、BGC8231)和正常胃黏膜細(xì)胞系(GES-1)(上海冠導(dǎo)生物工程有限公司);人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC;上海晶諾生物科技有限公司);DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(上海佰舜泰生物科技有限公司);兔抗人多克隆抗體RTN 4B、兔抗人單克隆抗體低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)、兔抗人多克隆抗體血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、兔抗人多克隆抗體GAPDH均購于英國Abcam公司;RTN 4B干擾質(zhì)粒(RTN 4B siRNA)、RTN 4B過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-RTN 4B)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、凝膠快速制備試劑盒、免疫組化試劑盒(上海信裕生物科技有限公司);Matrix 基質(zhì)膠(美國BD)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色法檢測胃癌組織及癌旁組織RTN 4B表達(dá) 標(biāo)本經(jīng)過脫蠟、水化處理,加入3%過氧化氫,去除內(nèi)源性過氧化物酶,隨后用檸檬酸修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)。加入兔抗人多克隆抗體RTN 4B(1∶500),4 ℃孵育過夜,加入生物素標(biāo)記的二抗,37 ℃孵育30 min。用DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、封片,顯微鏡下觀察染色情況。

1.3.2 評分及標(biāo)準(zhǔn) 染色評分=染色強(qiáng)度評分×陽性細(xì)胞百分比評分。染色強(qiáng)度評分:陰性為0分,低表達(dá)為1分,中度表達(dá)2分,高表達(dá)3分;陽性細(xì)胞百分比評分:0%～5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,76%～100%為4分。染色評分0～4分為低表達(dá),5～12分為高表達(dá)[8]。

1.3.3 CD34標(biāo)記的血管微密度(micro vessel density,MVD)檢測 在低倍鏡(×100)下觀察血管密度最高處,隨后高倍鏡(×200)下觀察計數(shù)血管[9]。以任何1個棕色染色的內(nèi)皮細(xì)胞作為1個血管,管腔直徑>8個紅細(xì)胞和帶有肌層的血管不予計數(shù)。隨機(jī)取5個視野,觀察微血管數(shù),取平均數(shù)作為MVD值。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞以1×106個/孔的密度接種于6孔板,用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將RTN 4B siRNA質(zhì)粒(RTN 4B-siRNA組)和陰性對照質(zhì)粒(CON組)轉(zhuǎn)入AGS細(xì)胞,分別將RTN 4B過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-RTN 4B組)和陰性對照質(zhì)粒(pcDNA3.1-CON組)轉(zhuǎn)入NCI-N87細(xì)胞,操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 實時熒光定量PCR檢測RTN 4B mRNA表達(dá) 收集胃癌細(xì)胞,用Trizol試劑提取總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行PCR實驗。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s、60 ℃退火延伸31 s,合計40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法計算RTN 4B表達(dá)水平。RTN 4B引物序列:上游5′-CGATAACTTGATGACC CCAGAA-3′;下游5′-ATAACGGCAAGATTCCATTTC-3′。GAPDH引物序列:上游5′-CGAT ACAGAGAAGATTAGCATGGC-3′;下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.6 Western-blot檢測RTN 4B、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá) 收集胃癌細(xì)胞,加入蛋白裂解液提取蛋白。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度,加入蛋白20 μg/孔,用10%SDS-PAGE分離蛋白,隨后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h,加入RTN 4B抗體(1∶500)、HIF-1α抗體(1∶1000)、VEGF抗體(1∶500)或GAPDH抗體(1∶5000),4 ℃反應(yīng)過夜。次日加入二抗,室溫下反應(yīng)1.5 h。用ECL發(fā)光儀成像,Image J軟件分析灰度值。

1.3.7 血管生成實驗 收集胃癌細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞融合70 %時將RPMI-1640培養(yǎng)基換為DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h。收集胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液,用0.22 μm濾器過濾。將HUVEC細(xì)胞用胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液和新鮮培養(yǎng)基1∶1混合培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時,用0.25 %胰酶消化。隨后將細(xì)胞懸液接種于加有Matrigel基質(zhì)膠的24孔板中。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h。顯微鏡下觀察細(xì)胞成像情況,隨機(jī)取5個視野,對管長度和節(jié)點進(jìn)行定量分析[10]。

2 結(jié) 果

2.1 RTN 4B在胃癌組織中的表達(dá)及其與MVD關(guān)系 免疫組化檢測結(jié)果顯示,癌組織RTN 4B高表達(dá)率為73.33%(11/15),高于癌旁組織[13.33%(2/15)];癌組織MVD高于癌旁組織[(28.06±3.05)vs.(21.70±5.26)],差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖1)。在癌組織中,高表達(dá)RTN 4B組織的MVD為(30.25±6.16),高于低表達(dá)組織(25.71±9.25),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 胃癌組織免疫組化(×200)

2.2 RTN 4B在不同胃癌細(xì)胞株中的表達(dá) 胃癌細(xì)胞系(AGS、NCI-N87、MGC803、BGC8231)的RTN 4B基因及蛋白表達(dá)水平均高于正常胃黏膜細(xì)胞系(GES-1),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表1)。胃癌細(xì)胞系中AGS細(xì)胞的RTN 4B表達(dá)水平最高,而NCI-N87細(xì)胞最低(圖2)。

表1 不同細(xì)胞株內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白4B表達(dá)水平比較

圖2 Western-blot檢測胃癌細(xì)胞系和正常胃黏膜細(xì)胞系內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白4B表達(dá)水平

2.3 過表達(dá)RTN 4B對NCI-N87細(xì)胞血管生成及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 pcDNA3.1-RTN 4B組RTN 4B基因和蛋白表達(dá)水平均高于pcDNA3.1-CON組(P<0.05,表2)。血管生成實驗結(jié)果顯示,pcDNA3.1-RTN 4B組管長度和節(jié)點均高于pcDNA3.1-CON組(P<0.05,圖3)。

2.4 沉默RTN 4B對AGS細(xì)胞血管生成及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 RTN 4B-siRNA組RTN 4B基因和蛋白表達(dá)水平均低于CON組(P<0.05,表3)。血管生成實驗結(jié)果顯示,RTN 4B-siRNA組的管長度和節(jié)點高于CON組(P<0.05)。RTN 4B-siRNA組HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平均低于CON組(P<0.05,圖4)。

圖3 過表達(dá)RTN 4B對NCI-N87細(xì)胞血管生成及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表2 過表達(dá)RTN4B對胃癌細(xì)胞血管生成及相關(guān)蛋白的影響

表3 沉默RTN4B對胃癌細(xì)胞血管生成及相關(guān)蛋白的影響

圖4 沉默RTN 4B對AGS細(xì)胞血管生成及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

在胃癌中,新生血管會促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移,干預(yù)腫瘤血管生成會抑制腫瘤進(jìn)展[11,12]。尋找腫瘤血管生成的生物學(xué)機(jī)制對胃癌的治療有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn),RTN 4B在胃癌中高表達(dá),能夠促進(jìn)胃癌血管生成,可能成為治療靶點。

有研究發(fā)現(xiàn),RTN 4B參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[13]。RTN 4B通過RhoA-SRF-MRTFA通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲和遷移[14]。Nogo-B與c-FLIP相互作用,通過抑制凋亡而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲[5]。本研究發(fā)現(xiàn),RTN 4B在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中表達(dá)水平升高,提示RTN 4B參與胃癌發(fā)生。然而RTN 4B參與胃癌進(jìn)展的機(jī)制既往未見報道。腫瘤血管生成是腫瘤進(jìn)展的重要原因,而此過程較為復(fù)雜,涉及內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和形成新基底膜等[15-17]。Zheng等[4]發(fā)現(xiàn),RTN 4B通過激活Notch1通路促進(jìn)心肌梗死后的血管生成。在肝癌的研究中,RTN 4B可通過促進(jìn)腫瘤血管生成而參與癌癥進(jìn)展[6]。CD34主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞[18],本研究檢測CD34標(biāo)記的血管微密度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織MVD高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。并且在癌組織中,高表達(dá)RTN 4B組織的MVD高于低表達(dá)組織,結(jié)果說明RTN 4B能夠促進(jìn)血管生成。

為進(jìn)一步證實RTN 4B對胃癌血管生成的作用,本研究用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑分別將RTN 4B siRNA質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入AGS細(xì)胞,分別將RTN 4B過表達(dá)質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入NCI-N87細(xì)胞。結(jié)果顯示,過表達(dá)RTN 4B促進(jìn)胃癌血管生成,而沉默RTN 4B抑制血管生成。在低氧條件下,HIF-1α表達(dá)水平升高,進(jìn)一步促進(jìn)血管生成因子表達(dá),進(jìn)而參與腫瘤血管生成[19-21]。研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)RTN 4B促進(jìn)HIF-1α表達(dá),進(jìn)而參與肝癌進(jìn)展[22]。HIF-1α在促進(jìn)血管生成的過程中,VEGF是關(guān)鍵細(xì)胞因子。VEGF促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲,并可調(diào)節(jié)血管通透性[23-25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達(dá)RTN 4B促進(jìn)HIF-1α、VEGF表達(dá),而沉默RTN 4B抑制HIF-1α、VEGF表達(dá),進(jìn)一步說明RTN 4B影響血管生成。

綜上,RTN 4B在胃癌組織中高表達(dá),并且能夠促進(jìn)胃癌血管生成。但本研究存在一些局限性,如未對胃癌患者進(jìn)行隨訪,沒有分析RTN 4B與生存預(yù)后的關(guān)系;未分析RTN 4B與胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為的關(guān)系。未來需要開展臨床及基礎(chǔ)研究,進(jìn)一步探討RTN 4B在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。