劉星宇,李 慧,李 菁,王 瑩,趙立升,封純真

肥胖癥是一種以體內(nèi)脂肪過度沉積和體重超常為特征的慢性代謝性疾病,是引起高血壓病、糖尿病、心腦血管疾病、腫瘤等衰老相關(guān)疾病的危險因素和病理基礎(chǔ)。在過去30多年,世界范圍內(nèi)超重和肥胖患者急劇增多,導(dǎo)致一系列肥胖相關(guān)的健康問題[1]。因此,尋找防治肥胖的干預(yù)措施迫在眉睫。

尿石素A(urolithin A)是石榴、草莓、樹莓及核桃等水果或堅果中的鞣花單寧與鞣花酸經(jīng)腸道微生物作用產(chǎn)生的活性代謝物[2],具有抗癌[3]、抗炎[4,5]、抗衰老[6]等多種生物學(xué)作用。最近有研究發(fā)現(xiàn),尿石素A對肥胖及其相關(guān)疾病發(fā)揮有益的保護作用[7, 8],但其作用機制尚不十分清楚。促進白色脂肪棕色化是防治肥胖及其相關(guān)疾病的重要靶點[9, 10],因此,本研究探討尿石素A對高脂飲食小鼠白色脂肪棕色化的影響,以期為防治肥胖癥提供新藥物及新靶點。

1 對象與方法

1.1 材料與試劑 18月齡雄性C57小鼠18只(湖北省實驗動物研究中心);穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀(美國強生);酶標(biāo)儀(Synergy HT,美國Bio Tek);LabMaster呼吸代謝分析系統(tǒng)(德國TSE);電泳儀(DYY-8C,北京六一儀器廠);凝膠成像分析儀(FlourChem FC12,美國Alpha);血糖試紙(英國LifeScan Europe);BCA(bicinchoninic acid);測定試劑盒(中國博邁德);吐溫-80(美國Sigma-Aldrich);游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)試劑盒(南京建成生物工程研宄所);預(yù)制膠電泳液(中國索萊寶);PVDF(polyvinylidene fluoride)膜(美國Millipore);脫脂奶粉(美國BD);解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1;貨號bs-1925R,稀釋比例1∶1000,分子量33 ku,北京博奧森)、過氧化物酶體增殖體激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)抗體(貨號bs-4590R,稀釋比例1∶1000,分子量57 ku,北京博奧森);過氧化物酶體增殖體激活受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator 1α, PGC-1α)抗體(貨號sc-518025,稀釋比例1∶500,分子量92 ku,美國Santa Cruz);小鼠β-肌動蛋白(β-actin)抗體(貨號#3700,稀釋比例1∶1000,分子量45 ku,美國CST)。

1.2 實驗分組 實驗動物在解放軍總醫(yī)院實驗動物中心SPF級屏障環(huán)境中飼養(yǎng),溫度(25±1)℃,相對濕度(60±5)%,光照時間12 h/d,干燥通風(fēng)。實驗動物均單籠飼養(yǎng),自由進食、進水。實驗動物購回后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,然后將18只C57小鼠隨機分成3組:對照組,高脂飲食組(high fat diet,HFD)和尿石素A干預(yù)組(UA)。對照組小鼠仍采用維持飼料喂養(yǎng),HFD和UA組小鼠給予高脂飼料(60%能量由脂肪供應(yīng))喂養(yǎng)12周。期間UA組小鼠按照30 mg/(kg.d)[7]的劑量給予尿石素A灌胃(吐溫-80助溶),對照組和HFD組給予等劑量的吐溫-80灌胃。

1.3 檢測指標(biāo) (1)血液學(xué)指標(biāo)檢測:實驗結(jié)束時,小鼠禁食不禁水過夜。剪尾法采血,測定空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG);腹腔靜脈采血,測血清中三酰甘油(triglycerides,TG),總膽固醇(total cholesterol,TC),高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)。試劑盒檢測血清中FFA濃度。(2)產(chǎn)熱量檢測:實驗結(jié)束前1周,將小鼠放入LabMaster 呼吸代謝分析系統(tǒng)的分析籠內(nèi),適應(yīng)6 h后,記錄12 h白天和12 h黑夜的產(chǎn)熱量。采樣流速為 0.8 L/min, 每30 min采集1次數(shù)據(jù)。(3)病理學(xué)檢查:實驗結(jié)束時,腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠,取腹股溝白色脂肪組織常規(guī)固定1周,石蠟包埋切片后進行HE染色,顯微鏡下觀察并拍照。(4)qRT-PCR:Trizol 法提取心肌組織總RNA,兩步法反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進行擴增,擴增條件為94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,擴增30個循環(huán),最后72 ℃ 延伸10 min。基因引物由上海英杰公司合成[10]。(5)Western blot:取出凍存的脂肪組織粉碎,加入300 μl 含PMSF的 RIPA裂解液裂勻漿,用移液器將裂解液吸至1.5 ml ep管(冰上操作)中。在4 ℃,12 000 g的條件下離心15 min,吸取上清液迅速轉(zhuǎn)移至新的ep管,此即為提取的總蛋白。取30 μg總蛋白上樣后進行電泳,220 nm的條件下轉(zhuǎn)膜2 h,室溫封閉2 h,分別滴加特異性一抗(UCP1,PPARγ,PGC-1α與β-actin)封閉過夜,再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗封閉2 h。化學(xué)發(fā)光劑染色、顯影,采用BandScan 5.0軟件分析膠片灰度。所有實驗至少重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 尿石素A干預(yù)對高脂飲食小鼠體質(zhì)量及代謝的影響 與對照組相比,HFD組小鼠的體質(zhì)量、FPG、TG、TC、FFA和LDL顯著升高(P<0.05);與HFD組比較,UA組老齡鼠的體質(zhì)量、TG、FFA和LDL明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表1)。

表1 尿石素A干預(yù)對高脂飲食小鼠體質(zhì)量及代謝的影響

2.2 尿石素A干預(yù)對高脂飲食小鼠代謝產(chǎn)熱的影響 與對照組比較,HFD組小鼠日間產(chǎn)熱量和夜間產(chǎn)熱量均顯著降低(P<0.05;表2),而尿石素A干預(yù)能明顯升高老齡鼠的日間和夜間產(chǎn)熱量,與HFD組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 尿石素A干預(yù)對高脂飲食小鼠體重及代謝的影響

2.3 尿石素A干預(yù)對高脂飲食小鼠白色脂肪組織形態(tài)的影響 與對照組相比,HFD組小鼠白色脂肪組織細(xì)胞體積增大,而尿石素A干預(yù)能明顯降低高脂飲食老齡鼠白色脂肪細(xì)胞的體積(圖1)。

2.4 尿石素A干預(yù)對HFD組小鼠白色脂肪棕色化基因轉(zhuǎn)錄與表達的影響 如圖2所示,與對照組相比,HFD組小鼠白色脂肪組織棕色化基因PGC-1α轉(zhuǎn)錄表達下調(diào), UCP1、PPARγ、PGC-1α蛋白的表達顯著降低(P<0.05),而尿石素A干預(yù)顯著上調(diào)白色脂肪組織棕色化基因UCP1、PPARγ與PGC-1α轉(zhuǎn)錄與蛋白表達水平(P<0.05,表3)。

圖1 尿石素A干預(yù)對高脂飲食小鼠白色脂肪組織形態(tài)的影響(HE,×200)

圖2 尿石素A干預(yù)對高脂飲食小鼠白色脂肪棕色化蛋白表達的影響

表3 尿石素A對高脂飲食小鼠白色脂肪棕色化基因轉(zhuǎn)錄與表達的影響

3 討 論

肥胖癥是一種多因素疾病,與遺傳、環(huán)境、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)紊亂、炎癥、腸道菌群等因素均有關(guān)系,其發(fā)生機制是能量攝入超過能量消耗。肥胖癥治療的中心環(huán)節(jié)是減少熱量的攝取或增加熱量的消耗。既往研究表明,尿石素A具有抗腫瘤、抗炎和抗衰老等多種生物學(xué)作用[12-15],而且對肥胖癥及其相關(guān)疾病發(fā)揮有益的保護作用,但其具體作用機制尚不清楚[7, 8]。本研究發(fā)現(xiàn),尿石素A通過促進白色脂肪棕色化來增加能量消耗進而防治肥胖癥,但對能量攝入無影響。

哺乳動物的脂肪組織類型主要分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織,白色脂肪組織主要的生理功能是以三酰甘油的形式儲存能量,而棕色脂肪組織主要的生理功能是以非戰(zhàn)栗方式產(chǎn)熱。棕色脂肪的代謝產(chǎn)熱量巨大,是新生兒在寒冷條件下維持體溫的重要方式。但是,成人體內(nèi)棕色脂肪組織含量很少。在一定條件下,白色脂肪組織可以向棕色脂肪組織轉(zhuǎn)化,亦即白色脂肪棕色化,如何促進白色脂肪棕色化是減重研究的重要方向之一[16]。本研究發(fā)現(xiàn),尿石素A干預(yù)能促進肥胖老齡鼠白色脂肪棕色化并降低其體質(zhì)量,可能的機制如下:(1)白色脂肪細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)通?？梢?個大脂滴,而棕色脂肪細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)則有諸多小脂滴。尿石素A干預(yù)明顯減少肥胖小鼠白色脂肪細(xì)胞的體積。(2)UCP1、PPARγ與PGC-1α是棕色脂肪細(xì)胞分化調(diào)控的重要分子[10],UCP1是棕色脂肪細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上的解耦聯(lián)蛋白,當(dāng)H+順濃度梯度沿UCP1返回線粒體基質(zhì)時,使得經(jīng)線粒體呼吸鏈電子傳遞建立的質(zhì)子跨膜電-化學(xué)勢能以熱能的形式釋放出來,而不用于合成ATP。PPARγ是脂肪組織高表達的核受體,與脂肪細(xì)胞分化、棕色脂肪組織形成密切相關(guān)[17]。既往研究表明,PPARγ激動劑羅格列酮能促進寒冷環(huán)境中C57小鼠燃脂產(chǎn)熱[18]。PGC-1α在棕色脂肪組織中高表達,在白色脂肪組織中低表達。在白色脂肪組織中過表達PGC-1α可使其獲得棕色脂肪組織的某些特征,如線粒體增多、脂肪酸氧化增強等[19]。而且,PGC-1α的代謝產(chǎn)物鳶尾素也能促進白色脂肪的棕色化[20]。本研究發(fā)現(xiàn),尿石素A干預(yù)從轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個層面促進UCP1、PPARγ與PGC-1α的表達。(3)因老齡鼠比年輕鼠在高脂飲食條件更容易發(fā)生肥胖[21],因此本研究以18月齡老齡小鼠為研究對象。尿石素A干預(yù)可以減少肥胖老齡鼠的體質(zhì)量,而且與小鼠的進食與排泄量無關(guān)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),尿石素A能促進肥胖小鼠白色脂肪棕色化,可能是防治肥胖癥的一種有效干預(yù)措施。但對于尿石素A促進白色脂肪棕色化的確切作用機制還不十分清楚。既往研究提示,線粒體自噬是維持棕色脂肪組織生理功能所必需的[22, 23],而尿石素A是一種線粒體自噬激活劑[15, 24],尿石素A是否通過調(diào)節(jié)線粒體自噬促進白色脂肪棕色化值得進一步探討。