鄧曉嬌，顏聰，薛建強(qiáng)，潘朝暉

(江蘇龍燈化學(xué)有限公司，江蘇 昆山 215300)

氨基寡糖素(amino-oligosaccharin)也稱為農(nóng)業(yè)專用殼寡糖，是從海洋生物如蝦類、蟹類等的外殼提取而來(lái)的多糖類天然產(chǎn)物，由幾丁質(zhì)降解得殼聚糖后再降解制得的，或由微生物發(fā)酵提取的低毒殺菌劑，其不僅可刺激植物生長(zhǎng)，使農(nóng)作物增產(chǎn)，還有抑制植物病毒的作用，對(duì)小麥花葉病、棉花黃萎病、水稻稻瘟病、番茄疫病等具有良好的防治作用[1-2]。目前已進(jìn)行了大面積推廣應(yīng)用，對(duì)低毒高效農(nóng)藥的發(fā)展具有十分重要的意義。

關(guān)于氨基寡糖素產(chǎn)品中氨基寡糖素含量的測(cè)定，目前主要采用分光光度法[3-4]、離子色譜法等[5-6]。分光光度法是將氨基寡糖素經(jīng)鹽酸水解為氨基葡萄糖，氨基葡萄糖經(jīng)衍生反應(yīng)后用顯色劑顯色，然后在特定波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，但該方法干擾因素多，穩(wěn)定性較差。離子色譜法使用脈沖安培檢測(cè)器和高效陰離子交換柱測(cè)定氨基寡糖素水解產(chǎn)物氨基葡萄糖，但離子色譜價(jià)格高昂，對(duì)企業(yè)適用性較差?；诖耍瑸榱藵M足企業(yè)日常分析需求，降低分析檢測(cè)成本，本文采用高效液相色譜儀建立一種與NY/T 2889—2016[6]中離子色譜法結(jié)果一致、水解時(shí)間更短的氨基寡糖素含量測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC20A 液相色譜儀配PDA 檢測(cè)器[島津(中國(guó))有限公司]；XS 205 型分析天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司]；SK5200 型超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；有機(jī)過(guò)濾器(孔徑0.45μm)。HH-5C 型數(shù)顯恒溫油浴鍋(常州市頂新實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；Smart-S30 實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)(上海和泰儀器有限公司)。

氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)樣(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%，SIGMA 試劑公司)；氨基寡糖素母藥(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥85.0%，濰坊華諾生物科技有限公司)；8%氨基寡糖素可溶液劑(江蘇龍燈化學(xué)有限公司研發(fā)小樣)；乙腈，色譜純；甲醇、三氯甲烷、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，均為分析純；超純水。

1.2 檢測(cè)方法

氨基寡糖素用8 mol/L 鹽酸水解成氨基葡萄糖，水解得到的氨基葡萄糖用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)進(jìn)行衍生，用三氯甲烷萃取除去過(guò)量的PMP 后，衍生物經(jīng)高效液相色譜分離，用PDA 檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法測(cè)定。

1.3 測(cè)定步驟

1.3.1 樣品水解

稱取相當(dāng)于氨基寡糖素0.02 g 的樣品于水解管中，加8 mol/L 鹽酸5.0 mL，混勻，充入高純氮?dú)?，密封。?98±2) ℃油浴中水解4 h，每小時(shí)搖動(dòng)1 次樣品。取出水解管，于流水下冷卻。將水解管中水解液轉(zhuǎn)移至100 mL 燒杯中，用5 mL 超純水洗滌水解管3 次，洗滌液并入100 mL 燒杯中。向燒杯中加入10 mol/L 氫氧化鈉4 mL，用0.3 mol/L 氫氧化鈉或0.3 mol/L 鹽酸調(diào)pH 至7.0。將燒杯中溶液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶，燒杯用5 mL 超純水洗滌3 次，洗滌液并入100 mL 容量瓶中，冷卻用超純水定容至刻度，得到樣品水解溶液，備用。

1.3.2 標(biāo)樣制備

稱取約0.4 g 氨基葡萄糖鹽酸鹽試樣(氨基葡萄糖鹽酸鹽轉(zhuǎn)換成氨基葡萄糖的系數(shù)為0.830 9)于100 mL容量瓶中，用超純水溶解，定容至刻度，得到質(zhì)量濃度約3.3 mg/mL 氨基葡萄糖貯備液。取6 只100 mL容量瓶，分別移取氨基葡萄糖貯備液0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，用超純水定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為0、33、66、132、198、264 mg/L 氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.3.3 衍生和萃取

取不同質(zhì)量濃度的氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.50 mL和各樣品水解溶液0.50 mL 分別置于數(shù)只10 mL 具塞比色管中，每個(gè)比色管中加入0.5 mol/L PMP 甲醇溶液0.50 mL 和0.3 mol/L 氫氧化鈉溶液0.50 mL，混勻，于(70±2)℃水浴衍生60 min。取出，流水下冷卻至室溫，加0.3 mol/L 鹽酸溶液0.50 mL，搖勻。再加4.0 mL 三氯甲烷萃取3 次，取上層水相用0.45μm濾頭過(guò)濾，得到質(zhì)量濃度為0、33、66、132、198、264 mg/L 的氨基葡萄糖-PMP 標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液6 份和樣品的待測(cè)液若干。

1.3.4 色譜分析

色譜柱SB-C18150 mm×4.6 mm，i.d.5μm；流動(dòng)相：乙腈+磷酸二氫鉀緩沖液=15+85(體積比)；流速1.0 mL/min；測(cè)定波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣體積5μL。在上述色譜操作條件下，氨基葡萄糖-PMP 衍生物保留時(shí)間約為17.5 min。

待儀器穩(wěn)定后連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2 針氨基葡萄糖-PMP 標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液標(biāo)的響應(yīng)值相對(duì)變化＜10%后，按照先各標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液后樣品待測(cè)液的順序測(cè)定，以儀器上測(cè)定的氨基葡萄萄糖-PMP標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液的質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，液相色譜吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。氨基葡萄糖標(biāo)樣-PMP 及氨基寡糖素樣品-PMP 的典型液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 氨基葡萄糖標(biāo)樣-PMP 和氨基寡糖素樣品-PMP 的色譜圖

1.3.5 計(jì)算

將樣品峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)樣品待測(cè)液中氨基葡萄糖質(zhì)量濃度C(mg/L)，試樣中氨基寡糖素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω(%)按下式計(jì)算：

式中：ω為氨基寡糖素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)；C 為樣品待測(cè)液的質(zhì)量濃度(mg/L)；m為樣品的實(shí)際稱樣量(g)；100 為樣品的稀釋倍數(shù)；k為校正系數(shù)，氨基寡糖素在降解為氨基葡萄糖過(guò)程中的損失k=1.7(參照NY/T 2889—2016中離子色譜法計(jì)算系數(shù))；10-6為mg/L換算成g/mL 值。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解條件

2.1.1 水解酸度

實(shí)驗(yàn)選用6、8、12 mol/L 的鹽酸在(98±2)℃油浴中對(duì)氨基寡糖素母藥進(jìn)行水解(圖2)。可見(jiàn)，在6 mol/L 鹽酸水解液中，氨基寡糖素水解緩慢。在12 mol/L 鹽酸水解液中，氨基寡糖素水解速度快，但是其水解產(chǎn)物氨基葡萄糖易被破壞。而在8 mol/L鹽酸水解液中樣品水解程度高且水解產(chǎn)物氨基葡萄糖在一段時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定，易于檢測(cè)。

圖2 水解酸度對(duì)氨基寡糖素含量測(cè)定的影響

2.1.2 水解時(shí)間

樣品加8 mol/L 鹽酸溶液5.0 mL 在(98±2)℃油浴中分別水解1、2、3、4、5、6、7、8 h 后測(cè)定氨基寡糖素含量。以水解時(shí)間為橫坐標(biāo)，氨基寡糖素含量為縱坐標(biāo)，繪制關(guān)系圖(圖3)?？梢?jiàn)，樣品水解4～8 h 測(cè)定的氨基寡糖素含量達(dá)到峰值。為更快得到較優(yōu)水解樣品，選擇水解時(shí)間為4 h。

2.1.3 衍生時(shí)間

各選擇1 份水解4 h 的氨基寡糖素可溶液劑和氨基寡糖素母藥的水解液與PMP 衍生試劑在(70±2)℃水浴中衍生，分別衍生30、50、60、70 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4?？梢?jiàn)，(70±2)℃水浴衍生60 min后樣品中的氨基葡萄糖與PMP 能反應(yīng)完全。

圖4 衍生時(shí)間對(duì)氨基寡糖素含量測(cè)定的影響

2.2 線性關(guān)系

氨基葡萄糖鹽酸鹽經(jīng)水解、衍生、萃取、過(guò)濾得到6 份質(zhì)量濃度為0、33、66、132、198、264 mg/L氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)-PMP待測(cè)溶液，每個(gè)待測(cè)液取5μL注入高效液相色譜儀測(cè)量保留時(shí)間和峰面積，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)定2 次，取峰面積平均值，以質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：氨基葡萄糖質(zhì)量濃度在1～264 mg/L 線性相關(guān)性良好，回歸方程y=11 451x-2 318.1，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

2.3 方法精密度

在上述色譜條件下稱取約0.3 g 的氨基寡糖素可溶液劑和0.02 g 氨基寡糖素母藥各7 份，按2.3 節(jié)步驟處理后測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。氨基寡糖素母藥的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.69%，理論相對(duì)偏差1.34%；氨基寡糖素可溶液劑的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.43%，理論相對(duì)偏差1.95%；均符合要求。

表1 分析方法的精密度

2.4 方法回收率

稱取10 份取氨基寡糖素母藥(每份約0.015 g)，均分成2 組：第1 組每份各加3.3 mg 氨基葡萄糖，按2.3 節(jié)步驟水解處理后衍生測(cè)定加標(biāo)回收率；第2組樣品先按2.3.1 節(jié)步驟水解，再加3.3 mg 氨基葡萄糖后衍生測(cè)定加標(biāo)回收率，氨基寡糖素水劑樣品操作同氨基寡糖素母藥。結(jié)果表明：氨基寡糖素母藥和氨基寡糖素可溶液劑的水解加標(biāo)回收率分別為95.1%～98.2%和95.2%～99.4%，水解后加標(biāo)衍生的回收率分別為97.6%～104.1%和98.5%～103.8%。

2.5 與離子色譜法結(jié)果比對(duì)

同一批氨基寡糖素母藥和氨基寡糖素可溶液劑樣品按照NY/T 2889—2016 中離子色譜法分析，其中氨基寡糖素母藥和氨基寡糖素可溶液劑的含量分別為99.6%和8.0%，與本試驗(yàn)中的98.1%和8.3%的結(jié)果差值在5%以內(nèi)，2 種方法測(cè)定結(jié)果一致性高。

3 結(jié)論

本文建立了一種可以簡(jiǎn)單快速分析氨基寡糖素的高效液相色譜檢測(cè)方法，目標(biāo)物在測(cè)試濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好、方法精密度和準(zhǔn)確度高，且水解時(shí)間短，適用于氨基寡糖素產(chǎn)品中有效成分的快速檢測(cè)與分析。