趙燕穎， 韓振琦， 鄒艷平， 李云鵬， 徐 濤， 劉麗艷， 程海濤

1 長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院消化內鏡科， 長春 130021； 2 吉林省一汽總醫(yī)院消化內科， 長春 130011

目前肝癌的復發(fā)率仍較高，如何更好的預防肝癌和開發(fā)新的治療方法是臨床有待于攻克的難題［1］。溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）是一種生物活性磷脂介質，在體內信號轉導過程中引起多種生物學效應，如參與心臟成纖維細胞的生長調節(jié)，促進平滑肌收縮［2］、參與腫瘤細胞生長、侵襲、轉移。研究［3-4］報道LPA 在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本文主要是探討LPA 與肝癌惡性進展作用的相關性以及具體機制，并就LPA 相關的信號通路在肝癌靶向治療中的前景進行討論。

1 資料和方法

1.1 ELISA法測定LPA

1.1.1 研究對象 選取2016 年1 月—2022 年12 月吉林省一汽總醫(yī)院診治的伴有腹腔積液的肝癌患者26例，男16例，女10例，年齡39～70歲。另選取伴有腹腔積液的肝硬化（Child-Pugh B 級18 例，Child-Pugh C 級10例）患者28例（其中酒精性肝硬化患者17例，肝炎肝硬化患者11例），男19例，女9例，年齡38～68歲。同時體檢中心選28例健康人群（男16例，女12例，年齡38～66歲）作為對照組。所有腹腔積液患者中移動性濁音界于鎖骨中線與腋中線的二度者占64.3%，移動性濁音超出鎖骨中線的三度者占35.7%。排除標準：（1）患有除肝癌以外的其他腫瘤患者；（2）已知或可能懷孕者、哺乳期婦女；（3）嚴重心、腎功能異常，及有腦梗死、短暫性腦缺血發(fā)作及外周深靜脈血栓形成者。

1.1.2 LPA測定方法 全部受驗者均于清晨空腹采血取樣2～4 mL，有腹腔積液的患者抽取腹腔積液10 mL。所有標本均于采集后30 min內3000 r/min離心10 min，仔細收集上清，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測血清LPA 含量。LPA≥3.2 μmol/L 設為陽性，＜3.2 μmol/L 設為陰性。

1.2 體外試驗主要儀器設備和試劑 CO2孵箱、蛋白電泳、實時定量PCR 及顯影系統(tǒng)。DMDM 培養(yǎng)基、小牛血清（Gbico 公司）、LPA（MSK 公司）、百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）（Sigma 公司）、結晶紫（Sigma-Aldrich 公司）、小鼠抗人β-actin、P53 抗體（北京中杉金橋）。鼠抗人FAK、RhoA 單克隆抗體購自Abcam 公司，辣根酶標記抗生物素IgG 抗體、Western Blot Luminol Reagent 和PVDF 膜均購自美 國SantaCruz 公司。DAB 顯色試劑盒購自中杉公司。RNA 提取試劑及RT-qPCR 試劑盒購自大連寶生物（TaKaRa）公司。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 細胞培養(yǎng) SMMC7721人肝癌細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所。細胞在DMDM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，青霉素100 mg/L，鏈霉素100 mg/L）中，5%CO2孵箱內37 ℃培養(yǎng)。待細胞生長到鋪滿細胞瓶底面80%左右進行細胞傳代。

1.4 MTT 細胞增殖實驗 按照5×103個細胞/孔將對數(shù)生長期細胞接種于96 孔板，培養(yǎng)至細胞80%融合后分組：空白對照組（只加無血清培養(yǎng)基）、LPA 組（含12.5、25、50 μmol/L LPA 的無血清培養(yǎng)基）、PTX 組（PTX 是LPA 拮抗劑，濃度為100 μg/L）、LPA+PTX 組（100 μg/L PTX和濃度為50 μmol/L的LPA）。

分別于加藥后24、48 和72h，每孔加入15 μL MTT（5 g/L）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入DMSO（150 μL/孔），振蕩10 min后采用酶標儀（570 nm）測定吸光度（A）值。根據(jù)公式計算細胞生存率：細胞生存率=（實驗組A值/空白組A值）×100%。每組設3個平行孔，實驗重復3次。

1.5 細胞侵襲和遷移實驗 取一無菌96孔培養(yǎng)細胞板，每孔加入約100 μL 的Matrigel 膠，置于4 ℃冰箱。約12 h后吸出上清液。用含5%血清的封閉液室溫封閉約30 min。用移液器取1×105細胞接種于之前用Matrigel 膠包被的孔中分組實驗，分組與細胞增殖實驗相同。將細胞培養(yǎng)板置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用移液器輕輕吸出上層培養(yǎng)液。取100 μL含結晶紫溶液加入孔中，室溫靜置15 min染色。洗滌2次后靜置培養(yǎng)板至其干燥。最后用移液器取100 μL 含5%SDS的乙醇滴入培養(yǎng)細胞的孔中，靜置約30 min后，用酶標儀測定吸光值，并定量分析實驗結果。

1.6 qPCR 檢測相關基因的表達 取對數(shù)期生長的SMMC7721 肝癌細胞分組處理：LPA 組（終濃度為50 μmol/L），LPA+PTX 組（50 μmol/L LPA 和100 μg/L PTX），對照組（只加無血清培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，用Trizol 裂解細胞提取細胞總RNA，利用微量分光光度計檢測A260/A280值評價提取RNA 質量與純度，定量后各組取2 μg 總RNA 應用cDNA 合成試劑盒逆轉錄獲得cDNA，用實時定量PCR（real time quantitative PCR，qPCR）檢測RNA 表達水平，均按照試劑盒操作說明書操作。各基因的合成引物分別為：RhoA 上游引 物5'-TTCAGCAAAGACCAAAGATGGA-3'，下 游 引物5'-CACAAGACAAGGCACCCAGA-3'；p53 上游引物5'-GTGGTGGTGCCCTATGAG-3'；下 游 引 物 5'-GGGAGGTAGACTGACCCTTT-3'；FAK 上 游 引 物5'-GCCTGGTGAAAGCTGTCATC-3'；下 游 引 物 5'-GCTTCTGTGCCATCTCAATC-3'；GAPDH 上游引物5'-GGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3'，下 游 引 物5'-CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC-3'。對目的基因的表達進行相對定量分析。

1.7 Western Blot 檢測相關蛋白的表達 取對數(shù)期生長的SMMC7721肝癌細胞分組處理，分組同RT-PCR實驗，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用PBS 洗1次，加4 ℃的裂解液（按1×107個細胞加入100 μL），超聲粉碎細胞，低溫離心后取上清液-80 ℃凍存。為確保蛋白上樣量一致，樣品中蛋白經(jīng)Bradford定量，然后加入2×SDS凝膠加樣緩沖液100 ℃煮沸變性，樣品中蛋白通過12%SDS-PAGE 分離后轉至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉4 ℃過夜；分別加入兔抗人P53，F(xiàn)AK，RhoA 和β-actin 抗體（1∶500），4 ℃過夜；用TBST 洗膜10 min，3次，加入1∶2 000 稀釋的羊抗兔二抗，振搖1 h，TBST 洗膜，DAB 顯色、拍照。分析系統(tǒng)測定各條帶灰度值，計算蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以xˉ±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組LPA 水平比較 （1）肝癌組血漿LPA 水平（4.99±0.55）μmol/L 明顯高于肝硬化組（2.63±0.43）μmol/L 及對照組（1.61±0.39）μmol/L，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。肝硬化組與健康對照組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（2）肝硬化組2例腹腔積液LPA 值較高，但仍低于肝癌組LPA 水平。肝癌組腹腔積液LPA水平（5.19±0.63）μmol/L明顯高于肝硬化組（2.91±0.46）μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 肝癌、肝硬化患者以及正常人群LPA的表達水平Table 1 Expression level of LPA in patients with liver cancer， liver cirrhosis and normal people

2.2 各組SMMC7721細胞增殖情況 對照組、（12.5、25、50 μmol/L）LPA 組、PTX 組 以 及LPA+PTX 組 的SMMC7721細胞24、48 和72 h 的增殖率具體如圖1 所示。LPA 可明顯促進SMMC7721 細胞增殖，細胞增殖率隨劑量和時間增加而增加，尤其中高劑量組增殖率明顯高于對照組，具有時間依賴性和劑量依賴性，隨著給藥劑量和時間的增加，增殖率逐漸增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而PTX 抑制其增殖能力，且具有時間依賴性，對照組和LPA 組細胞增殖率明顯高于PTX 組，各組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。72 h高劑量LPA組的增殖率是對照組的3.6倍，PTX組是對照組的0.6倍，二者聯(lián)合組是對照組的1.2倍。高劑量組LPA 聯(lián)合PTX 組細胞增殖率有所增加，但和對照組無明顯差異（P＞0.05）。說明LPA拮抗了PTX抑制細胞增殖的作用，這再次證明了LPA 有促進腫瘤細胞增殖的能力。

圖1 各組SMMC7721細胞增殖情況Figure 1 The proliferation of SMMC7721 cells in each group

2.3 細胞侵襲和遷移實驗結果 通過細胞侵襲和遷移實驗檢測了LPA 和PTX 對SMMC7721 肝癌細胞侵襲、遷移和黏附能力的影響（圖2）。與對照組相比，加入LPA的SMMC7721細胞黏附能力明顯增加，提示LPA能增加細胞黏附能力。LPA的拮抗劑PTX能明顯降低SMMC7721細胞黏附能力，LPA可增加肝癌細胞的遷襲能力，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但加用較高劑量LPA 和PTX 的聯(lián)合組SMMC7721細胞的黏附能力與對照組比變化不明顯。LPA能增加肝癌細胞黏附能力，PTX 作為LPA 的拮抗劑抑制肝癌細胞的黏附，抑制其遷移。結果表明隨時間增加上述能力增加，各組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。72 h 高劑量LPA 的遷襲率是對照組的3.09倍，PTX 組是對照組的0.4倍，二者聯(lián)合組是對照組的0.99倍。

圖2 各組SMMC7721細胞侵襲、遷移和黏附能力Figure 2 Adhesion ability of SMMC7721 cells in each group

2.4 qPCR 結果 與對照組相比，50 μmol/L 的LPA 作用SMMC7721細胞48 h后，細胞P53基因mRNA相對表達量下降，而RhoA 和FAK 基因mRNA 表達量增加。LPA 組和對照組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同時發(fā)現(xiàn)LPA+PTX 組的P53、RhoA 和FAK 基因表達與對照組比較無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖3）。

圖3 各組SMMC7721細胞P53、FAK、RhoA基因表達情況Figure 3 Expression of P53， FAK and RhoA genes in SMMC7721 cells

2.5 Western Blot 結果 同等內參β-actin 水平下，LPA 組SMMC7721細胞P53蛋白表達水平是對照組的20.9%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），LPA+PTX 組P53 蛋白表達水平有所升高，但仍低于對照組。LPA組SMMC7721 細胞的RhoA、FAK 蛋白表達水平是對照組的161.1%和153.9%，兩組差異均具有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05），LPA+PTX 組RhoA、FAK 蛋白表達水平和對照組無明顯差異。LPA能明顯降低P53蛋白的表達水平，同時增加SMMC7721 細胞的RhoA 和FAK蛋白表達水平（圖4）。

圖4 各組SMMC7721細胞P53、FAK、RhoA蛋白表達情況Figure 4 Expression of P53， FAK and RhoA in SMMC7721 cells

3 討論

LPA 最早是從卵巢癌患者的腹腔積液中分離純化出的［5-6］，LPA 是血清中的正常成分，體液當中如血清、唾液和腫瘤患者腹水中都存在LPA。LPA 及其受體在一些腫瘤中的異常高表達表明LPA 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起一定作用，LPA 可誘導多種細胞增殖，可增加腫瘤細胞浸潤，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［7］。LPA 作為一種多功能的生物活性磷脂分子，能夠參與調控細胞遷移、增殖、分化和凋亡等生物學行為［8］。

本研究通過ELISA 檢測發(fā)現(xiàn)肝癌患者血漿中LPA 水平明顯高于肝硬化患者和正常人群，而且肝癌患者腹腔積液中的LPA 水平明顯高于肝硬化患者腹腔積液中的表達水平，差異均具有統(tǒng)計學意義。上述結果與既往研究結果一致，再次證明了LPA 在肝癌患者中有異常高表達，可作為肝癌腫瘤預測因子和治療靶點［9］。

腫瘤細胞中有廣泛的LPAR1表達，并且能夠通過激活MAPK、Akt和Rho信號通路等方式調節(jié)細胞的增殖和遷移［10］，同時LPAR1 能夠下調腫瘤抑制因子p53的表達情況［11］。LPAR2 可通過激活Rho、Ras、Rac、MAPK、PLC 和PI3K 等信號通路來調節(jié)細胞的遷移和增殖。LPA能夠通過與其緊密連接的受體激活下游多條信號通路，其中RhoA/ROCK信號通路在LPA信號傳導中發(fā)揮著至關重要的作用。有研究［12］報道野生型的p53基因可以促進腫瘤細胞凋亡，但突變的p53基因可能通過激活RhoA 的這條途徑，參與腫瘤細胞生長、增殖及凋亡等生物學行為的調控。FAK是一種位于胞質內的酪氨酸激酶，F(xiàn)AK 涉及到細胞的黏附、播散、遷移和凋亡表達，有研究［13］顯示在多種腫瘤中有FAK的過度表達，包括起源于肝臟、直腸、肺部等腫瘤。FAK可能在肝癌相關通路調控著腫瘤細胞的存活、增殖，介導肝癌細胞與其他促進細胞遷移細胞因子如RhoA 的相互作用過程。FAK 會調控RhoA 的激活，RhoA 可以介導FAK的磷酸化作用，激活細胞遷移信號通路［14-17］。既往研究［18-19］顯示肝癌細胞中RhoA 蛋白的表達量明顯高于正常肝細胞。基于上述論點，本文研究了LPA對肝癌細胞中RhoA、FAK 和野生型P53基因和蛋白的影響，進一步明確LPA 的作用機制。本研究通過RTqPCR 和Western Blot 實驗證明經(jīng)LPA 處理的肝癌細胞中RhoA、FAK基因和蛋白表達明顯增加，同時，LPA可以抑制野生型P53 基因和蛋白的表達，與既往研究［20］結果一致。

PTX 對LPA 有較明顯的阻斷效應，PTX 能拮抗LPA 對上述基因和蛋白的作用。本研究通過MTT 細胞增殖試驗、細胞黏附實驗檢測發(fā)現(xiàn)，加用LPA 抑制劑PTX 后細胞增殖和黏附能力明顯下降，且明顯低于對照組。LPA 和PTX 互相拮抗，LPA 對細胞增殖和黏附、遷移能力有明顯的促進作用，提示LPA 能促進肝癌細胞增殖和黏附、遷移作用，從而誘發(fā)肝癌的發(fā)生和發(fā)展。

倫理學聲明：本研究方案于2021 年經(jīng)由吉林省一汽總醫(yī)院倫理委員會審批，批號：SB-2021-014。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：趙燕穎負責撰寫文章；鄒艷平、李云鵬、徐濤、劉麗艷參與了實驗數(shù)據(jù)的整理和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析；程海濤指導文章撰寫過程；韓振琦負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。