張濤,張瑞,張子侖,李獻(xiàn),祝巖波,劉雨蒙,張雅倫,周巍

(河北省食品檢驗(yàn)研究院,河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(特殊食品監(jiān)管技術(shù)), 特殊食品安全與健康河北省工程研究中心,河北 石家莊,050200)

葉酸(又稱為維生素B9)是一種在人體細(xì)胞分裂增殖及新陳代謝中發(fā)揮重要作用[1-2]的水溶性維生素[3]。動(dòng)物肝臟和綠葉蔬菜含有十分豐富的天然葉酸[4]。葉酸缺乏可引起一系列的不良癥狀,如細(xì)胞性貧血[5-6]、骨關(guān)節(jié)炎、粒細(xì)胞減少[7]。葉酸含量還與新生兒神經(jīng)管畸形有關(guān)[8-10],含量過低可導(dǎo)致新生兒出生缺陷發(fā)生率上升[11],如泌尿道缺陷、肢體縮短缺陷、唇腭裂、先天性心臟病[12-14]。孕婦在懷孕期間一般需要補(bǔ)充葉酸[15-17],缺乏可引起早產(chǎn)[18-19]、流產(chǎn)[20]、妊娠期糖尿病[21]等不良妊娠反應(yīng)。過量補(bǔ)充葉酸同樣會(huì)引起并發(fā)癥[22],影響人體對(duì)鋅的吸收,下一代易代謝異常[23]、患自閉癥[24-25]。因其具有特殊的功能,市場(chǎng)上出現(xiàn)很多添加葉酸的食品,其中最普遍的是嬰幼兒配方乳粉。檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量是否符合國家標(biāo)準(zhǔn)是保障食品安全的重要工作。

目前,葉酸檢測(cè)技術(shù)主要為微生物法、超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法、光學(xué)生物傳感器法[26]。微生物法多用于測(cè)定低葉酸含量的食品;超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測(cè)范圍較小,僅可測(cè)定單一組分的葉酸含量;光學(xué)生物傳感器法被列入美國官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(Association of Official Analytical Chemists,AOAC)的推薦方法。國際食品法典委員會(huì)(Codex Alimentarius Commission,CAC)、歐盟和美國將微生物法作為葉酸檢測(cè)的首選方法和仲裁方法[27],我國在測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量使用微生物法。

我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中生物法檢測(cè)葉酸含量存在檢測(cè)周期長、操作過程繁瑣的缺點(diǎn)。其中測(cè)定用菌株需經(jīng)過提前培養(yǎng)、多次傳代、冰箱保存多個(gè)步驟,易引起菌株的污染、變異[28]。冷凍保存菌株直接使用的方式操作簡(jiǎn)單方便,制備后即用即取可長期保存,在保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ)上降低實(shí)驗(yàn)人員的工作量[27]。目前針對(duì)葉酸檢測(cè)用凍存菌株研究較少,本文在GB 5009.211—2022標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上,通過驗(yàn)證保護(hù)劑對(duì)菌株的使用效果制備定量菌株。為更加便捷快速檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量,本研究制備葉酸檢測(cè)用鼠李糖乳桿菌定量菌株。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

MRS培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基,北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;無水乙醇、甲酸、乙腈,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;SRM 1869葉酸質(zhì)控樣品[含量范圍(223.9±8.6) μg/100 g],美國NIST。

鼠李糖乳桿菌Lactobacillusrhamnosus(ATCC 7469),中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 儀器與設(shè)備

AdVantage Pro真空冷凍干燥機(jī),美國SP Scientific公司;UV-2700紫外分光光度計(jì),日本島津公司;MIR-254低溫恒溫培養(yǎng)箱,日本SANYO公司;ME204 電子天平,美國METTLER TOLEDO公司;3K15 臺(tái)式離心機(jī),日本Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葉酸檢測(cè)用鼠李糖乳桿菌定量菌株制備及檢測(cè)

1.2.1.1 制備過程

將鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于MRS培養(yǎng)基,36 ℃培養(yǎng)24 h;菌苔刮取到滅菌生理鹽水中,振蕩混勻,將麥?zhǔn)蠞岫葍x測(cè)得保護(hù)劑數(shù)據(jù)歸零,保護(hù)劑中滴加菌液,直至麥?zhǔn)蠞岫葹?.5 MCF;向西林瓶滴加50 μL 加入保護(hù)劑的菌懸液,放入真空冷凍干燥機(jī)。待樣品充分干燥后取出,密封壓蓋存放。

1.2.1.2 凍干基質(zhì)篩選

在真空冷凍干燥過程中,為了減少細(xì)胞損傷,人們通常會(huì)使用凍干保護(hù)劑。保護(hù)劑種類繁多,由于菌株本身特性不同因而對(duì)保護(hù)劑種類和使用量具有偏好性。本實(shí)驗(yàn)分別配制 100、150、200 g/L質(zhì)量濃度的脫脂乳粉,對(duì)應(yīng)不同質(zhì)量濃度的蔗糖(50、100、150、200 g/L)按照凍干工藝將試驗(yàn)菌株進(jìn)行冷凍干燥,測(cè)定存活率,比較不同濃度比例的保護(hù)劑效果。凍干存活率按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中:R1,凍干存活率,%;a0,冷凍干燥前活菌數(shù),CFU/mL;a1,冷凍干燥后活菌數(shù),CFU/mL。

1.2.1.3 凍干工藝篩選

真空冷凍干燥技術(shù)是在真空狀態(tài)下,利用升華原理,使凍結(jié)的水分不經(jīng)過冰的融化直接以冰態(tài)升華為水蒸汽而除去的干燥法。由于冷凍干燥機(jī)對(duì)不同物質(zhì)干燥效果不同,現(xiàn)對(duì)凍干工藝進(jìn)行篩選。將50 μL菌懸液滴入加有液氮的西林瓶中,放入冷凍干燥機(jī),按照以下程序設(shè)置:

方法A:設(shè)置程序預(yù)凍-40 ℃ 120 min;冷凍干燥-25 ℃ 360 min,真空度(Vac)130 mTorr,-10 ℃ 120 min,Vac 130 mTorr;最終維持在-20 ℃,Vac 130 mTorr 狀態(tài)。

方法B:設(shè)置程序預(yù)凍-40 ℃ 120 min;冷凍干燥-30 ℃ 360 min,Vac 130 mTorr,-20 ℃ 1 200 min,Vac 130 mTorr;最終維持在-20 ℃,Vac 130 mTorr 狀態(tài)。

方法C:設(shè)置程序預(yù)凍-40 ℃ 120 min;冷凍干燥-35 ℃ 480 min,Vac 130 mTorr -30 ℃ 360 min,Vac 130 mTorr;最終維持在-20 ℃,Vac 130 mTorr 狀態(tài)。

方法D:設(shè)置程序預(yù)凍-40 ℃ 120 min;冷凍干燥-25 ℃ 480 min,Vac 130 mTorr;-10 ℃ 120 min,Vac 130 mTorr;最終維持在-20 ℃,Vac 130 mTorr 狀態(tài)。

1.2.1.4 計(jì)數(shù)方法

將未開啟的凍干菌株放置至室溫,開啟前用酒精擦拭鋁塑蓋和膠塞。放入10 mL無菌水中,稀釋到合適濃度,傾注適量TSA培養(yǎng)基,放置于36 ℃培養(yǎng)箱24 h,計(jì)數(shù)。

1.2.2 穩(wěn)定性研究

1.2.2.1 運(yùn)輸條件模擬實(shí)驗(yàn)

取葉酸檢測(cè)用鼠李糖乳桿菌定量菌株隨機(jī)分成2份,其中一份放入37 ℃培養(yǎng)箱,另一份放入25 ℃培養(yǎng)箱。分別在第0、1、3、5、7、14天計(jì)數(shù),并作3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 貯存條件模擬實(shí)驗(yàn)

取葉酸檢測(cè)用鼠李糖乳桿菌定量菌株隨機(jī)分成2份,其中一份放置于4 ℃冰箱,另一份放置于-20 ℃冰箱,分別在貯存0、1、3、5、7、14、28 d計(jì)數(shù),并作3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。復(fù)蘇率按公式(2)計(jì)算:

(2)

式中:R2,復(fù)蘇率,%;nx,第x天菌量,CFU/mL;n0,第0天菌量,CFU/mL。

1.2.3 均勻性研究

隨機(jī)抽取葉酸檢測(cè)鼠李糖乳桿菌定量菌株10瓶,每瓶中加入1 mL生理鹽水,溶解混勻,使用全自動(dòng)微生物螺旋加樣系統(tǒng)在E50模式下涂布于TSA平板,每個(gè)樣品做2個(gè)平行。(36±1) ℃培養(yǎng)24 h。對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,評(píng)價(jià)均勻性。

1.2.4 質(zhì)控樣品驗(yàn)證

質(zhì)控樣品按照GB 5009.211—2022前處理,將貯存于-20 ℃環(huán)境中28 d葉酸檢測(cè)用鼠李糖乳桿菌定量菌株加1 mL無菌水,混勻,制得菌液加入培養(yǎng)基中混勻使用,對(duì)同一質(zhì)控樣品測(cè)試6次葉酸含量測(cè)試,測(cè)試檢驗(yàn)效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍干基質(zhì)篩選結(jié)果

由表1可知,按照質(zhì)量濃度150 g/L脫脂乳粉、100 g/L蔗糖比例的保護(hù)劑凍存效果最好,存活率為94%,可選為后續(xù)實(shí)驗(yàn)凍干保護(hù)劑。

表1 脫脂乳粉和蔗糖保護(hù)劑凍干存活率Table 1 Lyophilized survival rate of skim milk powder and sucrose protectant

2.2 凍干工藝篩選結(jié)果

按照方法A、B、C、D依次凍存菌球,按照A、B、C方法凍存的菌球,形狀不規(guī)則,外表濕潤,顏色暗淡,不能滿足實(shí)驗(yàn)要求,其中 A、B凍干的小球,因冷凍干燥時(shí)間不夠,水分不能完全析出,在室溫條件下有復(fù)溶現(xiàn)象,按照C方法凍存的小球中間為黏性。而按照方法D所凍菌球形狀為圓形,外表干燥且內(nèi)部為干粉,可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。通過對(duì)不同冷凍條件的篩選,最終確定了凍干工藝為:預(yù)凍-40 ℃ 120 min;冷凍干燥-25 ℃ 480 min,Vac 130 mTorr;-10 ℃ 120 min,Vac 130 mTorr;最終維持在-20 ℃,Vac 130 mTorr 狀態(tài)。

2.3 穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 運(yùn)輸穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知,在37 ℃環(huán)境中葉酸檢測(cè)鼠李糖乳桿菌定量菌株隨著貯存時(shí)間加長菌落數(shù)量有輕微變化,3次平行結(jié)果相差較小,14 d內(nèi)能保持穩(wěn)定。在25 ℃環(huán)境中葉酸檢測(cè)用鼠李糖乳桿菌定量菌株隨著貯存時(shí)間加長菌落數(shù)量變化更小,3次平行結(jié)果相差較小,14 d內(nèi)能保持良好穩(wěn)定性。比較2種溫度最終結(jié)果,25 ℃環(huán)境中保存比37 ℃環(huán)境中保存更接近最初菌落數(shù),所以高溫環(huán)境可采用泡沫箱加冰袋運(yùn)輸,常溫環(huán)境可直接運(yùn)輸。

表2 葉酸檢測(cè)用鼠李糖乳桿菌定量菌株模擬運(yùn)輸 條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 2 Test results of simulated transport conditions for quantitative strains of Lactobacillus rhamnosus for folic acid detection(n=3)

2.3.2 貯存穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知,-20 ℃環(huán)境下貯存28 d復(fù)蘇率為96.84%,樣品穩(wěn)定性良好,根據(jù)以往制備經(jīng)驗(yàn),在-20 ℃條件下可以保存長達(dá)18 個(gè)月;4 ℃環(huán)境下,貯存28 d復(fù)蘇率為89.47%,可以作為短期貯存條件。

表3 葉酸檢測(cè)用鼠李糖乳桿菌定量菌株模擬貯存 條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 3 Test results of simulated storage conditions for quantitative strains of Lactobacillus rhamnosus for folic acid detection (n=3)

2.4 均勻性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)10瓶樣品進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果如表4所示,檢測(cè)結(jié)果相差較小。使用SPSS軟件,采用單因素方差分析方法,對(duì)樣品的均勻性進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果如表5所示,FINV(0.05,9,10)臨界值=3.02,根據(jù) SPSS 軟件計(jì)算的結(jié)果F=0.179

表4 十瓶葉酸檢測(cè)用鼠李糖乳桿菌定量菌株計(jì)數(shù)結(jié)果Table 4 Quantitative strain count results of 10 bottles of Lactobacillus rhamnosus for folic acid detection

表5 葉酸檢測(cè)用鼠李糖乳桿菌定量菌株均勻性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Test results of quantitative homogeneity of Lactobacillus rhamnosus for folic acid detection

2.5 質(zhì)控樣品葉酸含量檢測(cè)結(jié)果

由表6可知,測(cè)同一質(zhì)控樣品6次結(jié)果均在含量范圍(223.9±8.6) μg/100 g內(nèi),平均值為225.11 μg/100 g,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.11%,說明葉酸檢測(cè)用鼠李糖乳桿菌定量菌株重復(fù)性良好,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠,可以滿足嬰幼兒乳粉中葉酸含量的測(cè)定需求。

表6質(zhì)控樣品葉酸含量檢測(cè)結(jié)果Table 6 Results of folate assay for quality control samples

3 結(jié)論

在我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中,微生物法是唯一的測(cè)定嬰幼兒乳粉中葉酸含量的方法。新版國標(biāo)增加微孔板測(cè)定方法,培養(yǎng)體積按比例縮減,節(jié)省實(shí)驗(yàn)品消耗,減少人員工作量,但并未對(duì)菌株的使用做進(jìn)一步優(yōu)化?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)時(shí)間長,步驟繁瑣,極易造成菌株的污染、變異,影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)鼠李糖乳桿菌定量菌株進(jìn)行運(yùn)輸模擬實(shí)驗(yàn)和貯存模擬實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,隨著時(shí)間的延長菌落數(shù)量變化較小,可知其穩(wěn)定性良好;單因素方差分析方法結(jié)果F