陳林,ETTELAIE Rammile,余林,陳維

1(廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院,廣東省植物資源生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州,510006) 2(英國(guó)利茲大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)院,英國(guó) 利茲,LS29JT)3(南方醫(yī)科大學(xué) 附屬花都醫(yī)院,廣東 廣州,510800)

果蔬汁飲料、碳酸飲料、運(yùn)動(dòng)飲料等酸性飲料深受各國(guó)消費(fèi)者喜愛,然而隨著人們健康消費(fèi)意識(shí)提升,成分單一的酸性飲料已無(wú)法滿足消費(fèi)者營(yíng)養(yǎng)需求。大豆蛋白是中國(guó)大宗優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的保健功能。將大豆蛋白添加到酸性飲料中,不僅可提升產(chǎn)品的風(fēng)味,還可改善現(xiàn)有酸性飲料營(yíng)養(yǎng)成分單一的缺陷,滿足消費(fèi)者營(yíng)養(yǎng)均衡的需求。然而大多數(shù)酸性飲料的pH值介于3.0～4.5,大豆蛋白的等電點(diǎn)在pH 4.5附近,大豆蛋白在等電點(diǎn)區(qū)域絮凝沉淀限制了其在酸性飲料中的應(yīng)用[1-2]。國(guó)外已對(duì)大豆蛋白的改性技術(shù)和酸溶特性進(jìn)行了大量深入研究,取得了系列成果,美國(guó)和日本已開發(fā)出具有良好酸溶特性的大豆蛋白產(chǎn)品,廣泛應(yīng)用于各種酸性飲料[3]。但這些技術(shù)基本沒有申請(qǐng)專利,屬于技術(shù)機(jī)密。

酶解改性是利用蛋白水解酶在溫和條件下催化蛋白質(zhì)中特定肽鍵水解斷裂,所生成的小分子肽親水性更強(qiáng),分子柔順性更好,更易與水分子發(fā)生水合作用,因此具有更好的溶解特性[4-6]。酶解改性安全高效,無(wú)氨基酸破壞和有害物質(zhì)產(chǎn)生,故被認(rèn)為是食品蛋白改性的最佳方法[4]。蛋白酶的選擇對(duì)酶解改性的效果至關(guān)重要,目前的研究現(xiàn)狀往往是隨機(jī)選取蛋白酶,然后基于“試錯(cuò)法”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選。然而蛋白酶的種類繁多,從大量蛋白酶中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選,工作量大且存在一定盲目性[5-7]。

隨著現(xiàn)代生物信息學(xué)的快速發(fā)展,各種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)逐步完善,許多蛋白酶的酶切位點(diǎn)也已比較清楚,一種基于已知蛋白質(zhì)氨基酸序列的模擬酶切技術(shù)成為解決當(dāng)前瓶頸的有效手段[8]。PeptideCutter是由瑞士生物信息學(xué)研究所(ExPASy)開發(fā)的蛋白模擬酶切軟件,可通過輸入蛋白氨基酸序列和蛋白酶酶切位點(diǎn),模擬蛋白酶解;輸出結(jié)果包括酶切肽段的氨基酸序列、分子質(zhì)量、酶切位點(diǎn)和水解度等。該軟件還提供了ExPASy開發(fā)的各種在線蛋白分析工具,可用于分析生成肽段的理化性質(zhì)和生物活性,從而預(yù)測(cè)酶解改性的效果,指導(dǎo)選擇適用蛋白酶[9]。如于志鵬等[10]采用PeptideCutter軟件對(duì)5種雞蛋蛋白進(jìn)行模擬酶切,然后利用ExPASy提供的在線工具對(duì)生成肽段的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性和溶解特性進(jìn)行分析預(yù)測(cè),建立了適用水解酶的高通量篩選方法。BLEAKLEY等[11]采用PeptideCutter對(duì)燕麥蛋白進(jìn)行模擬酶切,以生成的寡肽(含有10個(gè)氨基酸以下的肽段)數(shù)量為指標(biāo)建立肽庫(kù),從89種蛋白酶中篩選出4種優(yōu)勢(shì)酶,顯著降低了實(shí)驗(yàn)成本并制備出了高二肽基肽酶抑制活性的酶解產(chǎn)物。值得注意的是利用模擬酶切的方法篩選適用水解酶,首先應(yīng)掌握蛋白的氨基酸序列信息。目前大豆蛋白各組分中,只有7S球蛋白(β-伴大豆球蛋白)的完整氨基酸序列已經(jīng)破譯[12],然而基于模擬酶切指導(dǎo)改善7S酸溶特性的研究國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。因此,本研究以7S為底物蛋白,在PeptideCutter軟件中采用不同酶切位點(diǎn)的蛋白酶對(duì)7S進(jìn)行模擬酶切,然后采用ExPASy在線工具對(duì)生成肽段的酸溶特性進(jìn)行分析預(yù)測(cè),篩選出優(yōu)勢(shì)蛋白酶并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究為高效篩選適用于改善大豆蛋白酸溶特性的蛋白酶提供了新的思路和方法指導(dǎo),也有利于實(shí)現(xiàn)大豆蛋白產(chǎn)品在酸性飲料中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂大豆粕(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)51.3%,干基),山東禹王食品有限公司;蛋白酶K(EC 3.4.21.62,3.0×105U/g)、胰凝乳蛋白酶(EC 3.4.21.1,1.5×106U/g)、胰蛋白酶(EC 3.4.21.4,2.5×105U/g),上海源葉生物科技有限公司;胃蛋白酶(EC 3.4.23.1,6.0×105U/g),北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;嗜熱菌蛋白酶(EC 3.4.24.27,3.5×105U/g)、牛血清蛋白,美國(guó)Sigma-Aldrich公司;電泳預(yù)制膠及相關(guān)試劑,美國(guó)Bio-rad公司;100%酸橙汁,美國(guó)Tropicana公司;其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PeptideCutter模擬酶切軟件,瑞士生物信息學(xué)研究所;HJ-6A多頭磁力攪拌器、DF-101S集熱式磁力攪拌器,金壇市城東新瑞儀器廠;CR22G 高速冷凍離心機(jī),日本日立電器公司;KDN-40A 凱氏定氮儀,上海新嘉電子有限公司;ZYS20-1000超聲波粉碎機(jī),杭州振源儀器有限公司;FA2204B電子天平,上海天美天平儀器有限公司;TIM840自動(dòng)電位滴定儀,美國(guó)Radiometer公司;Mini-protean IV電泳系統(tǒng),美國(guó)Bio-Rad公司;PHS-3C pH計(jì)、L6S紫外可見分光光度計(jì),上海儀電分析儀器有限公司;Zetasizer Nano ZE-90納米粒度及電位分析儀,英國(guó)Malvern公司;Turbiscan MA2000穩(wěn)定性分析儀,法國(guó)Formulaction公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大豆7S球蛋白的制備與純化

參考DEAK等[13]的方法,稍加改進(jìn),過程簡(jiǎn)述如下:低溫脫脂豆粕粉碎過200目篩,所得粉體加入Tril-HCl緩沖液(0.03 mol/L,下同),料液比為1∶15(g∶mL),調(diào)節(jié)pH值至8.5,45 ℃攪拌1 h;離心后(9 000×g,30 min)去渣得蛋白浸提液;在浸提液中加固體NaHSO3至0.3 mmol/L、加CaCl2至0.02 mmol/L,調(diào)pH值至6.4,4 ℃靜置過夜,離心后(6 500×g,30 min)收集上清液為7S球蛋白富集組分;在7S富集組分中加固體NaCl至0.25 mol/L,調(diào)節(jié)pH值至5.5,磁力攪拌1 h,離心后(9 000×g,30 min)收集上清液;兩倍體積冰水稀釋上清液,攪拌1 h,調(diào)pH值至4.8(7S等電點(diǎn)),離心(9 000 ×g,30 min)收集沉淀并溶解于Tris-HCl緩沖液,調(diào)節(jié)pH值至6.2,離心后(9 000×g,30 min,4 ℃)收集上清液,調(diào)節(jié)pH值至7.6得到粗β-伴大豆球蛋白提取液。向提取液中加入固體(NH4)2SO4至飽和度51%,離心后(9 000×g,30 min)收集上清液,加入固體(NH4)2SO4至飽和度100%,所得沉淀用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH 7.6)溶解,透析脫鹽后冷凍干燥得到大豆7S球蛋白,研磨后過40目篩,于密封干燥容器中保藏備用。

1.3.2 大豆7S球蛋白主要成分測(cè)定

水分含量測(cè)定參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》(直接干燥法);灰分測(cè)定參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測(cè)定》(灼燒稱重法);蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》(凱氏定氮法);脂肪含量測(cè)定參照GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》(索氏抽提法)。

1.3.3 大豆7S球蛋白的模擬酶切及優(yōu)勢(shì)蛋白酶的選擇

INCI中文名稱：生育酚（維生素E），英文名稱：Tocopherol，CAS號(hào)：1406-66-2，英文名：Vitamin E。維生素E是抗氧化劑，溶于脂肪和乙醇等有機(jī)溶劑，不溶于水，對(duì)熱、酸穩(wěn)定。

從UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://www.uniprot.org/)搜集大豆7S球蛋白α′、α、β亞基的氨基酸序列及相關(guān)資料(表1),整理后倒入模擬酶切軟件PeptideCutter的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。搜集和總結(jié)國(guó)內(nèi)外報(bào)道用于改善蛋白溶解特性的蛋白酶,然后選用PeptideCutter中提供的39種蛋白酶對(duì)7S中3種亞基分別進(jìn)行模擬酶切,內(nèi)置軟件經(jīng)計(jì)算得出不同酶水解釋放的肽片段數(shù)量、氨基酸序列及水解度。將模擬酶切生成肽段氨基酸序列導(dǎo)入Compute pI/Mw在線分析軟件(https://web.expasy.org/compute_pi/),得到酶切肽段的等電點(diǎn)(isoelectric point, pI)。根據(jù)蛋白等電點(diǎn)與溶解特性的關(guān)系,從生成肽段中挑選pI>pH 6.0或pI

表1 大豆7S球蛋白中α′、α和β亞基的氨基酸 序列及相關(guān)資料Table 1 Amino acid sequences and related information of α′、α and β subunits for soy 7S globulin

1.3.4 大豆7S球蛋白的酶解及水解度(degree of hydrolysis,DH)測(cè)定

將上述制備的7S球蛋白分散到去離子水中配制成50 g/L的分散液,常溫下攪拌2 h。對(duì)7S分散液進(jìn)行超聲波預(yù)處理以提高其酶解敏感性,超聲功率400 W,處理時(shí)間10 min(每處理5 s,停1 s)。預(yù)處理后,采用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)樣品分散液pH穩(wěn)定至酶解最適值,置于恒溫水浴鍋中,調(diào)節(jié)水浴溫度至最適酶解溫度,啟動(dòng)磁力攪拌器,然后加入一定量的蛋白酶進(jìn)行酶解(酶用量為1.0%,質(zhì)量分?jǐn)?shù),蛋白酶/底物蛋白)。酶解過程中采用自動(dòng)電位滴定儀自動(dòng)滴加0.1 mol/L NaOH溶液入樣品分散液,從而控制pH值恒定為最適值。在不同酶解時(shí)間(30～360 min)記錄堿液消耗量,并根據(jù)pH-stat法計(jì)算酶解產(chǎn)物的DH[14]。酶解至終點(diǎn)時(shí),將酶解液置于沸水浴中加熱滅酶15 min。冷卻至室溫后在8 000×g下離心15 min后取上清液,調(diào)節(jié)pH值至7.0后冷凍干燥,研磨過40目篩,然后置于密封干燥容器中保藏備用。樣品命名由底物蛋白和蛋白酶組成。例如7SH-蛋白酶K是指經(jīng)蛋白酶K酶解改性后制備的7S酶解產(chǎn)物。

1.3.5 蛋白質(zhì)溶解性的測(cè)定

將蛋白樣品分散到去離子水中配制成10 g/L的分散液,常溫下攪拌2 h。采用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)樣品分散液pH穩(wěn)定至目標(biāo)pH(3.0～7.0),然后在8 000×g下離心15 min后取上清液。上清液中蛋白含量采用Lowry法[15]測(cè)定,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物做標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)的溶解度(protein solubility,PS)表示為上清液蛋白濃度占總蛋白濃度的百分比。

1.3.6 SDS-PAGE

采用Bio-rad公司的預(yù)制膠進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn),該產(chǎn)品濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%,分離膠為質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%～15%的梯度膠。將樣品溶解于樣品緩沖液(0.062 5 mol/L Tris-HCl buffer (pH=6.8),20 g/L十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulphate, SDS-PAGE),5%(體積分?jǐn)?shù))巰基乙醇,25%(體積分?jǐn)?shù))甘油和0.1 g/L 溴酚藍(lán))中配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的分散液。95 ℃下水浴加熱5 min,離心后(8 000×g,15 min)取上清液。樣品上樣量為10 μL。凝膠電泳在恒壓下進(jìn)行,在濃縮膠中電壓為60 V,進(jìn)入分離膠后增至150 V。凝膠染色及脫色后,在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像處理,采用Quantity-One軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品分子質(zhì)量范圍14.4～97.4 kDa。

1.3.7 蛋白溶液Zeta電位的測(cè)定

1.3.8 酶解改性7S球蛋白在酸性果汁中的穩(wěn)定性測(cè)試

將市售酸橙汁(pH 3.86)分成若干份,加入酶解改性后的7S樣品,添加量為50 g/L,然后在室溫下攪拌2 h。蛋白果汁中加入疊氮鈉(0.2 g/L)抑制微生物生長(zhǎng),并置于4 ℃冰箱中靜置貯藏24 h。貯藏后,采用Turbiscan MA2000穩(wěn)定性分析儀測(cè)定蛋白果汁樣品的背散射光(backscattering coefficient, BS)曲線,用于評(píng)估蛋白果汁的穩(wěn)定性。測(cè)試過程中,光源檢測(cè)器從樣品瓶底部掃描至樣品瓶頂部,掃描范圍為0～45 mm,測(cè)定溫度為25 ℃。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果都是3次測(cè)定的平均值,采用Duncan新復(fù)極差檢驗(yàn)結(jié)果平均值間的顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆7S球蛋白的主要成分及亞基組成

本論文以脫脂豆粕為原料,采用等電點(diǎn)沉淀法制備大豆7S球蛋白,然后采用硫酸銨沉淀法(鹽析)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化,7S產(chǎn)品的得率為12.4%,主要成分含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為:蛋白93.1%,水分5.7%,灰分0.9%,脂肪0.02%。采用SDS-PAGE分析該7S產(chǎn)品的亞基組成,結(jié)果見圖1。通過與文獻(xiàn)報(bào)道的大豆蛋白組分和7S亞基組成[16]進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)本文采用的脫脂豆粕原料(條帶1)含有7S球蛋白(α′-7S、α-7S,β-7S)和11S球蛋白(A1-A5-11S,B-11S),而所制備的7S產(chǎn)品只含有7S球蛋白和少量雜蛋白(主要為α與β亞基之間的蛋白電泳條帶)。通過對(duì)蛋白電泳條帶的光密度進(jìn)行計(jì)算分析,得出該產(chǎn)品中7S球蛋白的純度為85.3%,其中α′亞基占15.2%,α亞基占48.4%,β亞基占21.7%。

M-蛋白標(biāo)準(zhǔn)品;1-脫脂豆粕原料;2-對(duì)照7S;3-7SH-蛋白酶K;4-7SH- 胃蛋白酶;5-7SH-嗜熱菌蛋白酶;6-7SH-胰凝乳蛋白酶;7-7SH-胰蛋白酶圖1 大豆7S球蛋白及其酶解產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE profiles of soy 7S globulin and 7S hydrolysates prepared with various proteases

2.2 目標(biāo)肽庫(kù)的建立和優(yōu)勢(shì)蛋白酶的選擇

本研究利用PeptideCutter軟件對(duì)7S進(jìn)行模擬酶切,然后將生成肽段的氨基酸序列導(dǎo)入Compute pI/Mw在線分析軟件,得到肽段的pI。根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)與溶解特性的關(guān)系,在模擬酶切肽段中選擇pI>pH 6.0或pI胃蛋白酶(47.2)>嗜熱菌蛋白酶(43.1)>胰凝乳蛋白酶(30.7)>胰蛋白酶(22.0)。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),5種優(yōu)勢(shì)蛋白酶建立的目標(biāo)肽庫(kù)中,pIpH 6.0的目標(biāo)多肽數(shù)量。這可能是因?yàn)?S酶解后肽鍵斷裂,所生成的小肽表面電荷分布發(fā)生變化,而7S中酸性氨基酸含量高于堿性氨基酸含量[12],因此模擬酶切后生成肽段中也含有較多的酸性氨基酸,從而使其等電點(diǎn)偏酸性。此外,蛋白酶的酶切位點(diǎn)對(duì)7S酶解產(chǎn)物的等電點(diǎn)也有重要影響。如胰蛋白酶主要識(shí)別酶切P1位是賴氨酸和精氨酸(二者均為堿性氨基酸)的肽鍵。由于末端氨基酸對(duì)肽段等電點(diǎn)影響較大[5],因此胰蛋白酶生成的肽庫(kù)中含有較多的pI>pH 6.0的目標(biāo)多肽。

表2 不同蛋白酶對(duì)7S球蛋白模擬酶切所得目標(biāo)多肽數(shù)量Table 2 The quantities of target peptides produced by in silico enzymatic analysis of 7S globulin using various proteases

2.3 不同蛋白酶對(duì)大豆7S球蛋白的酶解特性

將上述5種優(yōu)勢(shì)蛋白酶分別在各自最優(yōu)酶解條件下(表3)對(duì)7S進(jìn)行酶解,酶解產(chǎn)物DH隨酶解時(shí)間的變化如圖2所示。在酶解反應(yīng)0～180 min內(nèi),5種7S酶解產(chǎn)物的DH不斷增加,然后隨著酶解時(shí)間推移趨于平緩,并在反應(yīng)300 min后DH不再出現(xiàn)顯著變化(P>0.05)。蛋白酶K、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶制備的7S酶解產(chǎn)物的實(shí)際DH分別達(dá)到了27.3%、24.8%、19.6%、13.8%和10.5%。SDS-PAGE分析結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn),上述5種優(yōu)勢(shì)酶可將7S中α′、α和β亞基完全降解,7S酶解產(chǎn)物主要由分子質(zhì)量<3 000 Da的小分子肽組成。這一發(fā)現(xiàn)與模擬酶切預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致,表明5種優(yōu)勢(shì)蛋白酶對(duì)7S的酶解程度都較高。另一方面,實(shí)驗(yàn)測(cè)定的7S酶解產(chǎn)物的DH普遍低于模擬酶切預(yù)測(cè)的DH,這可能是由于7S球蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響,使部分酶切位點(diǎn)被掩蔽,難以與蛋白酶結(jié)合發(fā)生水解作用[6,15]。酶解過程中的產(chǎn)物抑制效應(yīng)也會(huì)影響蛋白酶解反應(yīng)效率,從而導(dǎo)致7S酶解產(chǎn)物實(shí)際水解程度較低[5,17]。

表3 不同蛋白酶對(duì)7S模擬酶切所得DH與實(shí)驗(yàn)測(cè)定DH對(duì)比Table 3 Comparison of in silico predicted DH and experimental determined DH of 7S hydrolysates prepared using various proteases

2.4 不同蛋白酶制備的7S酶解產(chǎn)物的蛋白溶解性

如圖3所示,對(duì)照7S的PS-pH關(guān)系類似一條U型曲線:在pH 7.0時(shí)其PS值最高為79.6%;pH 4.5～5.0是7S的等電點(diǎn)區(qū)域,PS值最低,僅為6.1～6.8%;在pH 3.0～4.5(大部分酸性飲料的pH值),7S的PS值從6.8%(pH 4.5)上升至55.2%(pH 3.0)。酶解改性后,5種7S酶解產(chǎn)物在pH 7.0的PS值都提高到90%左右。與對(duì)照7S球蛋白相比,7S酶解產(chǎn)物主要由小分子肽組成,含有的極性基團(tuán)數(shù)量較多,親水性更強(qiáng),且肽鏈長(zhǎng)度縮短,分子柔順性更好,因此更易于與水分子發(fā)生水合作用而具有更好的溶解特性[5-6]。隨著pH降低,所有7S酶解產(chǎn)物的PS值在酸性條件下也有所下降,但降低的程度明顯小于對(duì)照7S。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,與大分子蛋白不同,小分子肽水合作用較強(qiáng),即使在其等電點(diǎn)區(qū)域靜電排斥作用較弱時(shí),也不易發(fā)生聚集沉淀,因此具有較好的酸溶特性[18]。除胰蛋白酶制備的7S酶解產(chǎn)物的最小PS值(39.4%)仍出現(xiàn)在7S的等電點(diǎn)區(qū)域(pH 4.5～5.0),其他4種7S酶解產(chǎn)物的最小PS值都出現(xiàn)在更低的pH條件。其中7SH-嗜熱菌蛋白酶和7SH-胰凝乳蛋白酶的最小PS值都在pH 4.0,分別為46.2%和33.7%;7SH-胃蛋白酶的最小PS值在pH 3.0,為65.9%;7SH-蛋白酶K的PS值在pH 3.0～5.0時(shí)沒有顯著差異,約為81%,為所有7S酶解產(chǎn)物中最高。上述結(jié)果表明模擬酶切篩選出的5種優(yōu)勢(shì)蛋白酶都可不同程度提高7S在pH 3.0～4.5下的酸溶特性,其中蛋白酶K表現(xiàn)最佳。酶解改性7S酸溶特性的提高有利于改善其在酸性飲料中穩(wěn)定性,從而開發(fā)出營(yíng)養(yǎng)和口感俱佳的酸性蛋白飲料。

圖3 對(duì)照7S球蛋白及其酶解產(chǎn)物的溶解度-pH 曲線(pH 3.0～7.0)Fig.3 Protein solubility profiles of control 7S and its hydrolysates as a function of pH 3.0-7.0

將模擬酶切分析預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果相對(duì)照可以發(fā)現(xiàn),蛋白酶K、胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶不僅在模擬酶切中得到較多的目標(biāo)肽段,而且它們所制備的7S酶解產(chǎn)物的實(shí)際酸溶特性也較高。另一方面,胰凝乳蛋白酶在模擬酶切分析中得到的目標(biāo)多肽數(shù)量比胰蛋白酶多,但是7SH-胰凝乳蛋白酶的酸溶特性低于7SH-胰蛋白酶。這可能是因?yàn)檫@兩種蛋白酶模擬酶切所得目標(biāo)肽段數(shù)量相差不大,而7S的酶解過程比較復(fù)雜,導(dǎo)致預(yù)測(cè)結(jié)果不夠準(zhǔn)確。綜上所述,雖然由于7S酶解過程的復(fù)雜性,基于PeptideCutter模擬酶切的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際情況有所差別,但對(duì)于預(yù)測(cè)酶解產(chǎn)物酸溶特性、篩選優(yōu)勢(shì)水解用酶仍然具有很好的指導(dǎo)作用。

2.5 不同蛋白酶制備的7S酶解產(chǎn)物的Zeta電位

蛋白溶解特性與其表面電荷量密切相關(guān)。7S及其酶解產(chǎn)物的Zeta電位-pH關(guān)系如圖4所示。對(duì)照7S的Zeta電位從30.7 mV(pH 2.0)降低至-36.2 mV(pH 7.0),在pH 4.75處Zeta電位為零,為對(duì)照7S的等電點(diǎn)。將圖3與圖4對(duì)照分析可以發(fā)現(xiàn)在7S等電點(diǎn)區(qū)域,由于蛋白分子表面凈電荷最少、Zeta電位最小,無(wú)法提供足夠的靜電排斥效應(yīng),蛋白分子間會(huì)通過疏水相互作用等次級(jí)相互作用力形成聚集物,導(dǎo)致其PS很低僅為6.1%;而pH值偏離等電點(diǎn)區(qū)域,蛋白分子表面電荷增多、Zeta電位增大,蛋白分子間的靜電排斥作用抑制蛋白-蛋白聚集,宏觀上表現(xiàn)為蛋白質(zhì)的溶解度增加[19]。酶解改性對(duì)7S的Zeta電位-pH關(guān)系有重要影響,且依賴于蛋白酶的種類。5種7S酶解產(chǎn)物的Zeta電位-pH曲線的斜率與對(duì)照7S相比明顯增大,即隨著pH的變化,Zeta電位(絕對(duì)值)變化幅度增大。這可能是因?yàn)?S酶解成小分子肽后,帶電基團(tuán)(如—NH2+、—COO-)數(shù)量增加,使7S酶解產(chǎn)物表面電荷量和Zeta電位增大[18]。5種酶解產(chǎn)物的等電點(diǎn)都向酸性方向發(fā)生了偏移,這與Compute pI/Mw軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。然而值得注意的是,除7SH-蛋白酶K外,其余4種7S酶解產(chǎn)物的等電點(diǎn)基本位于pH 3.0～4.5,而且其PS在等電點(diǎn)區(qū)域仍明顯降低,因此不適于在酸性飲料中應(yīng)用。與之相對(duì)照,7SH-蛋白酶K等電點(diǎn)位于pH 2.61,使其在pH 3.0～4.5帶負(fù)電荷且具有較高的Zeta電位(絕對(duì)值),可提供較強(qiáng)的靜電排斥效應(yīng),從而保持良好的溶解性。

圖4 對(duì)照7S球蛋白及其酶解產(chǎn)物的Zeta電位-pH關(guān)系圖Fig.4 Zeta potential profiles of control 7S and its hydrolysates as a function of pH 1.0-7.0

2.6 酶解改性7S球蛋白對(duì)果汁飲料穩(wěn)定性的影響

Turbiscan通過測(cè)定飲料樣品BS系數(shù)的分布和變化,可檢測(cè)肉眼難以觀察到的相分離、絮凝、沉淀等現(xiàn)象,從而評(píng)估飲料的穩(wěn)定性[20]。圖5-a為靜置貯藏24 h后不同蛋白果汁樣品的BS圖譜,0 mm處為樣品瓶底部,50 mm處為樣品瓶頂部;圖5-b為不同蛋白果汁樣品的實(shí)物圖。本實(shí)驗(yàn)所采用的酸橙汁(pH 3.86)在外觀上呈均勻液狀,其BS系數(shù)在測(cè)定高度內(nèi)沒有明顯波動(dòng),說(shuō)明該果汁中物質(zhì)分布均勻。將對(duì)照7S添加到酸橙汁后,樣品出現(xiàn)了肉眼可見的相分離現(xiàn)象。該樣品的BS曲線底部有1個(gè)凸起峰,意味該區(qū)域反射光增強(qiáng),溶液中出現(xiàn)沉淀;中間曲線波動(dòng)較多,表明溶液中有結(jié)塊或絮凝現(xiàn)象;頂部曲線有1個(gè)較大凸起峰,表明絮凝物漂浮在樣品頂部[20-21]。由此可見,將7S直接添加到酸橙汁中會(huì)引起絮凝沉淀,嚴(yán)重影響飲料的外觀和穩(wěn)定性。與之相對(duì)照,將7SH-蛋白酶K添加到酸橙汁后,樣品在外觀上沒有出現(xiàn)明顯的相分離,其BS曲線底部和中部的波動(dòng)較小,表明由蛋白引起的絮凝沉淀現(xiàn)象明顯減弱;但在BS曲線上部出現(xiàn)1個(gè)凸起峰。推測(cè)其原因,可能是由于酸橙汁中果肉、果膠等物質(zhì)通常帶有負(fù)電荷[2],與7SH-蛋白酶K中少量帶正電荷的酶解多肽結(jié)合,導(dǎo)致形成了絮狀漂浮物。然而7SH-蛋白酶K的pI(pH 2.61)與7S相比向酸性方向偏移,其所含的大部分酶解多肽在酸橙汁中(pH 3.86)都帶負(fù)電荷且具有較高Zeta電位(絕對(duì)值),從而使體系中多肽與多肽之間、多肽與果肉(果膠)之間都因靜電排斥作用而不易發(fā)生聚集。上述結(jié)果表明7S經(jīng)蛋白酶K酶解改性后酸溶特性提高,在酸橙汁中不易引起絮凝沉淀,使蛋白果汁體系的穩(wěn)定性明顯改善。蛋白酶K的酶切位點(diǎn)廣泛、水解作用較強(qiáng)且穩(wěn)定性高,在食品工業(yè)中常被用于降解蛋白生產(chǎn)小分子肽[22]。因此該酶制備的7S酶解產(chǎn)物在酸性飲料中有應(yīng)用前景。

注:a-BS圖譜;b-實(shí)物圖圖5 添加了不同蛋白樣品酸橙汁的Turbiscan BS圖譜和實(shí)物圖Fig.5 BS spectra and visual appearance of orange juices added with different protein samples

3 結(jié)論與討論

利用生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的進(jìn)步,本文以完整氨基酸序列已知的大豆7S球蛋白為底物蛋白,選用39種酶切位點(diǎn)已知的蛋白酶在PeptideCutter軟件中對(duì)7S進(jìn)行模擬酶切,以生成的目標(biāo)肽段(pI>pH 6.0或pI

a)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明,模擬酶切篩選出的5種優(yōu)勢(shì)蛋白酶(蛋白酶K、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶)對(duì)7S的酶解程度都較高,都可不同程度提高7S在pH 3.0～4.5下的PS,其中蛋白酶K表現(xiàn)最佳,這說(shuō)明基于模擬酶切分析預(yù)測(cè)7S酶解產(chǎn)物的酸溶特性對(duì)于篩選優(yōu)勢(shì)水解用酶具有很好的指導(dǎo)作用;但由于7S酶解過程的復(fù)雜性,模擬酶切預(yù)測(cè)的DH偏高,且當(dāng)不同蛋白酶模擬酶切所得目標(biāo)肽段數(shù)量相差不大時(shí),預(yù)測(cè)結(jié)果不夠準(zhǔn)確。

b)蛋白酶K可將7S中α′、α和β亞基完全降解成小分子肽(分子質(zhì)量<3 000 Da),所得7S酶解產(chǎn)物帶電基團(tuán)數(shù)量增多、水合作用增強(qiáng),且等電點(diǎn)與對(duì)照7S(pI=pH 4.75)相比向酸性方向偏移(pI=pH 2.61),使其在pH 3.0～4.5具有較高的Zeta電位(絕對(duì)值),可提供較強(qiáng)的靜電排斥效應(yīng),可能是其酸溶特性提高的主要原因。

c)7S經(jīng)蛋白酶K酶解改性后酸溶特性顯著提高,在酸橙汁中不易引起絮凝沉淀,使蛋白果汁體系的穩(wěn)定性明顯改善。

綜上所述,基于計(jì)算機(jī)模擬酶切指導(dǎo)7S球蛋白酶解改性,不僅大大提高了水解用酶的篩選效率,而且成功制備了具有優(yōu)異酸溶特性的7S酶解產(chǎn)物,在酸性飲料中有應(yīng)用前景。