張凡紅,王靜,孫萬合,譚強(qiáng)飛,贠建民,趙風(fēng)云

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730070)

草菇(Volvariellavolvacea),又名稻草菇、中國蘑菇,是一種生長在熱帶、亞熱帶地區(qū)的高溫型食用菌,是我國主要的栽培食用菌之一[1]。草菇味道鮮美,含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分,具有降血壓、降膽固醇、預(yù)防癌癥等功效[2-3],深受消費者的喜愛。

在生產(chǎn)過程中,草菇菌種退化會導(dǎo)致菌絲活力降低、子實體品質(zhì)和產(chǎn)量減少等現(xiàn)象,是制約草菇發(fā)展的重要因素[4]。低溫保藏法可有效減慢菌絲生長速度、降低基因變異的發(fā)生,是延緩菌種衰退的有效措施[5]。然而草菇不耐低溫貯藏,4 ℃下菌絲在48 h內(nèi)自溶死亡[6]。故相較于其他食用菌,草菇菌種退化現(xiàn)象的發(fā)生更為頻繁。尋找一種有效的退化菌種復(fù)壯方法是草菇產(chǎn)業(yè)亟需解決的難題。

絲氨酸(serine, Ser)是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位,不僅參與生物體的一系列代謝過程,還能夠通過自身及其代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能[7]。在細(xì)胞膜的制造加工、肌肉組織和包圍神經(jīng)細(xì)胞的鞘的合成中,Ser也發(fā)揮著重要作用[8]。GARCIA等[9]發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)液中添加Ser后顯著增加了植物葉片的礦物質(zhì)含量。ZHANG等[10]在水培液中添加Ser后顯著提高了番茄幼苗的生長速度。

課題組前期通過添加20種氨基酸復(fù)壯草菇退化菌種,結(jié)果表明,Ser可有效提高草菇退化菌株的菌絲特性[11]。本文在此研究基礎(chǔ)上,測定草菇退化菌株在外源添加Ser后的生產(chǎn)性狀、營養(yǎng)成分等指標(biāo)的變化,進(jìn)一步明確Ser對草菇退化菌種的影響,為草菇及其他食用菌退化菌種的復(fù)壯研究提供理論參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

草菇V844原種(D0),保藏于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院。

退化菌株(D1～D3):由課題組前期通過連續(xù)組織分離繼代的方式獲得[12]。D1:連續(xù)組織分離繼代6次;D2:連續(xù)組織分離繼代12次;D3:連續(xù)組織分離繼代19次。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

葡萄糖、瓊脂粉、濃硫酸、無水乙醇、苯酚、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁、福林酚、液氮、考馬斯亮藍(lán)G250、KH2PO4、MgSO4、NaCl、Na2CO3、NaOH、Ser,上海源葉生物科技有限公司;棉籽殼、廢棉、麩皮、石灰、石膏,廣東銳一食用菌栽培基地;以上試劑均為分析純,試驗用水均為蒸餾水。

1.2.2 儀器與設(shè)備

YM75L立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海高精密儀器有限公司;SW-CJ-080D超凈工作臺,蘇州安泰技術(shù)有限公司;HWS-600W恒溫恒濕培養(yǎng)箱,常州恒隆有限公司;SPX-1000生化培養(yǎng)箱,常州金壇良友儀器有限公司;AL201-MTL電子分析天平,梅特勒-托利儀器有限公司;DW-86L80超低溫保存箱,浙江捷勝低溫設(shè)備有限公司;SUP-20-J優(yōu)普系列超純水機(jī),山東汀蘭科技有限公司;101-3B烘箱,上海聯(lián)鯨儀器有限公司;LINKS游標(biāo)卡尺,長春市哈辛刃具有限公司;HWS-26電熱恒溫水浴鍋,濟(jì)南歐萊堡生物技術(shù);RE-3000A蒸發(fā)濃縮儀,江蘇穹宇機(jī)械科技有限公司;HE-CS350超聲波清洗機(jī),濟(jì)寧亨達(dá)超聲設(shè)備有限公司;novAA?400P火焰原子吸收光譜儀,德國耶拿分析儀器股份公司;8L0-0031-LA8080全自動氨基酸分析儀,日立(HITECHI)。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

對照組(CK):PDA培養(yǎng)基組成(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為馬鈴薯 20%,葡萄糖 2%,瓊脂粉 2%,KH2PO40.1%,MgSO40.1%。栽培種培養(yǎng)基組成(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為棉籽殼88%,麩皮10%,石膏1%,石灰1%,含水量約65%,pH 8～9。栽培培養(yǎng)基組成(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為廢棉95%,石灰5%,含水量約 65%,pH 9～10。

處理組(Ser):在PDA和栽培種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,添加0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Ser。栽培過程中,將噴灑用水替換成0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Ser水溶液。

1.3.2 草菇菌絲體生理性狀測定

菌落形態(tài):統(tǒng)一活化D0～D3菌株,在第3天時拍照記錄。

菌絲生長速度:參照安學(xué)明等[12]的方法測定。將 D0～D3 菌株統(tǒng)一活化并培養(yǎng)72 h后,在培養(yǎng)皿上通過十字交叉法劃線標(biāo)記草菇菌落直徑,計算菌絲生長速度。

1.3.3 生產(chǎn)性狀的測定

以D0～D3為試驗菌株,參照余昌霞等[13]的方法,進(jìn)行栽培試驗。測定以下指標(biāo):

原基形成時間(d):記錄從栽培開始到第1個原基形成所需的時間。

生產(chǎn)周期(d):記錄從栽培開始到子實體蛋形期所需的時間。

平均單菇質(zhì)量(g):從每個栽培框中隨機(jī)摘取5個蛋形期子實體,分別稱重,計算平均值。

生物學(xué)效率計算[14]如公式(1)所示:

(1)

1.3.4 營養(yǎng)指標(biāo)的測定

水分采用GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》中“第一法 直接干燥法”進(jìn)行測定;灰分采用GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》中“第一法 食品中總灰分的測定”進(jìn)行測定;粗多糖的測定參照溫文娟等[15]的方法;粗蛋白的測定參照楊靜華[16]的方法;粗纖維的測定參照耿丹萌[17]的方法;粗脂肪的測定參照謝福泉等[18]的方法;黃酮的測定參照李劍梅等[19]的方法;多酚的測定參照吳亮亮等[20]的方法。氨基酸采用GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》進(jìn)行測定;礦物質(zhì)含量測定參照張雪紅等[21]的方法,采用火焰原子吸收光譜儀測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計整理采用Excel 2019處理,采用Origin 2018和TBtools作圖,數(shù)據(jù)顯著性分析采用SPSS 26.0處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ser對草菇菌絲體生理性狀的影響

將D0～D3菌株統(tǒng)一活化并培養(yǎng)3 d后,觀察菌落形態(tài)和菌絲生長速度,結(jié)果如圖1所示。隨著菌株繼代次數(shù)的增加,菌落直徑和菌絲生長速度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。添加Ser后,D0～D3菌株的菌落直徑均有不同程度的增加,菌絲生長速度較CK組分別提高了4.67%、4.43%、12.00%和12.18%。Ser處理組的D2、D3菌株的菌絲生長速度顯著高于CK組(P<0.05)。

a-菌絲密度;b-菌絲生長速度圖1 外源Ser對草菇菌絲體的影響Fig.1 Effects of exogenous serine of V.volvacea注:圖中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,n=3;*表示同組內(nèi)差異 顯著(P<0.05)(下同)。

2.2 Ser對草菇生產(chǎn)性狀的影響

對D0～D3菌株進(jìn)行栽培試驗,結(jié)果如圖2所示,D0、D1、D2菌株均可順利出菇,D3菌株僅能形成原基,但不能長成子實體。經(jīng)Ser處理后,D0、D1、D2菌株的子實體數(shù)量有不同程度的增加,不能出菇的D3菌株恢復(fù)了出菇能力。

圖2 草菇栽培Fig.2 V.volvacea cultivation

由圖3可知,和D0相比,D1菌株的生產(chǎn)性狀沒有明顯差異。而D2菌株的平均單菇重和生物學(xué)效率較D0分別降低了10.75%和49.00%,原基形成時間和生產(chǎn)周期較D0分別增加了14.29%和6.25%;D3菌株的原基形成時間較D0延長了28.57%。

a-平均單菇質(zhì)量;b-原基形成時間;c-生產(chǎn)周期;d-生物學(xué)效率圖3 外源Ser對草菇生產(chǎn)性狀的影響Fig.3 Effect of exogenous serine on agronomic traits of V.volvacea

外源添加Ser處理后,對D0、D1菌株的生產(chǎn)性狀影響不顯著。D2菌株的平均單菇重和生物學(xué)效率較CK組分別提高了了16.05%和30.56%,原基形成時間和生產(chǎn)周期較D0分別減少了12.5%和5.88%。Ser處理使不能出菇的D3菌株重新長出子實體,生產(chǎn)周期和生物學(xué)效率分別為16.5 d和5.26%。

2.3 Ser對草菇營養(yǎng)成分的影響

對D0～D3菌株的營養(yǎng)成分含量進(jìn)行測定,結(jié)果如表1所示。隨著繼代次數(shù)的增加,D0～D3菌株的粗多糖、粗蛋白、灰分含量都隨著繼代時間的延長而顯著降低,與D0相比,D3菌株的粗多糖、粗蛋白、灰分含量分別降低了43.36%、14.42%、29.7%。而粗纖維、粗脂肪、水分則隨繼代次數(shù)的增加呈先上升后下降的趨勢。外源添加Ser處理后,D0和D1菌株的各營養(yǎng)成分含量變化不顯著;D2菌株的粗多糖、粗蛋白、粗纖維、灰分含量較CK組分別提高了11.00%、40.69%、6.91%和23.75%;D3菌株較CK組分別提高了20.71%、65.87%、17.36%和42.25%;粗脂肪和水分含量較CK組無顯著變化。

表1 Ser對草菇營養(yǎng)成分的影響 單位:mg/g

草菇菌株的黃酮和多酚含量隨繼代時間的延長呈下降的趨勢。D3菌株的黃酮和多酚含量較D0分別降低了28.00%和15.47%。外源添加Ser后,D0和D1菌株的黃酮和多酚含量較CK組無顯著變化。D2、D3菌株黃酮含量比CK組分別升高了16.66%、15.86%;多酚含量較CK組分別升高了8.94%和9.92%。

2.4 Ser對草菇氨基酸含量的影響

對草菇的氨基酸含量進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖4所示。D0～D3菌株的CK組和Ser組中均檢測到17種氨基酸,其中谷氨酸(glutamate, Glu)含量最高,D0菌株的Glu含量為3.35 g/100 g。隨著繼代次數(shù)的增加,草菇的氨基酸含量均呈下降趨勢,其中,脯氨酸(proline, Pro)含量下降最多;較D0菌株,D3菌株降低了54.84%;精氨酸(arginine, Arg)含量降低最少,較D0菌株,D3菌株降低了15.57%。

圖4 外源Ser對草菇氨基酸含量的影響Fig.4 Effect of exogenous Ser on amino acid content of V.volvacea注:#表示必需氨基酸。

外源添加Ser處理后,D0～D3菌株的各氨基酸均有不同程度的升高。Ser處理組的D0～D3菌株氨基酸總量較CK組分別提高了9.19%、9.71%、13.45%和18.22%。其中,半胱氨酸(cysteine, Cys)的提高幅度最大,D0～D3菌株的Cys含量分別較CK組分別提高了20.93%、42.5%、51.85%和84.21%;甲硫氨酸(methionine, Met)次之,較CK組分別提高了15.63%、16.93%、18.75%和24.34%。D0～D3菌株的Ser含量分別較CK組提高了13.86%、11.22%、16.28%和23.75%。

2.5 Ser對草菇礦物質(zhì)含量的影響

對草菇的礦物質(zhì)含量進(jìn)行檢測,結(jié)果如表2所示。各菌株的礦物質(zhì)含量的大小順序均為K>Ca>Mg>Na>Fe>Cu>Zn>Mn。隨著繼代次數(shù)的增加,繼代菌株對礦物質(zhì)的富集作用逐漸減弱,各礦物質(zhì)含量均隨繼代時間的延長呈下降趨勢。D3菌株的礦物質(zhì)總量較D0降低了15.51%。Zn含量降低最多,D3菌株比D0中的Zn含量降低了87.96%。K含量降低最少,D3比D0菌株中的K含量降低了13.19%。

表2 Ser對草菇礦物質(zhì)含量的影響 單位:mg/kg

經(jīng)Ser處理后,D0～D3菌株中的礦物質(zhì)總量較CK組分別提高了5.74%、6.97%、11.76%和12.92%。D0～D3菌株Ca、Fe、Na含量以及D0、D1菌株的K、Mg含量和CK組相比均無顯著差異(P>0.05)。D2、D3菌株的K、Mg含量較CK組顯著升高(P<0.05),分別升高了12.60%、14.94%和15.87%、13.01%;D2菌株的Mn、Zn含量,較CK組升高了28.66%、144.57%;D3菌株的Cu含量較CK組升高了122.63%。

3 討論

菌種退化現(xiàn)象制約著食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,關(guān)于食用菌退化菌種的復(fù)壯研究報道有很多。王殿振等[22]用組織分離法復(fù)壯北蟲草,有效縮短了北蟲草退化菌株的滿瓶天數(shù)和出草天數(shù),提高了菌種產(chǎn)量。馬宏等[23]采用菌絲尖端分離技術(shù)對退化的香菇菌株進(jìn)行復(fù)壯,使復(fù)壯菌株的出菇時間提前了15 d,子實體產(chǎn)量提高了12.6%。此外,改變培養(yǎng)基配方也是復(fù)壯食用菌退化菌種的重要手段。毛寧等[24]在培養(yǎng)基中添加抗生素對蛹蟲草進(jìn)行復(fù)壯,其菌絲的生長速度約為復(fù)壯前的8倍。程志虹等[25]通過更換培養(yǎng)基碳源,顯著提高草菇的木質(zhì)纖維素分解能力,恢復(fù)了草菇退化菌株的菌絲性狀。馬元偉等[26]在培養(yǎng)基中添加組氨酸和賴氨酸,有效恢復(fù)了綠僵菌和蛹蟲草退化菌株的產(chǎn)孢能力。本文通過在培養(yǎng)基中外源添加Ser,顯著提高了草菇繼代菌株D2的生物學(xué)效率,且使不能出菇的D3菌株恢復(fù)了出菇能力,對草菇退化菌種有較好的復(fù)壯效果。

氨基酸作為有機(jī)氮源,是食用菌合成核酸、碳水化合物、蛋白質(zhì)和酶類的原料。同時,作為一種重要的生長因子,氨基酸對微生物的生長和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生起著重要作用。KAWAGISHI等[27]研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加異亮氨酸對松茸菌絲的生長有顯著促進(jìn)作用;李長喜等[28]發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)料中添加氨基酸后,平菇鮮菇品質(zhì)得到改善,產(chǎn)量比對照增加了31.6%。YAMANAKA等[29]研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加纈氨酸和谷氨酰胺能夠提高櫟松口蘑孢子的形成率。JO等研究[30]發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中添加谷氨酸能夠提高廣葉繡球菌的菌絲生物量和γ-氨基丁酸的產(chǎn)量。本研究表明,外源Ser處理能提高草菇退化菌株菌絲體營養(yǎng)成分的含量,改善其生產(chǎn)性狀。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是生物體正常代謝過程中產(chǎn)生的含氧物質(zhì),參與細(xì)胞生長發(fā)育、信號傳導(dǎo)及各種生化反應(yīng)[31]。但當(dāng)ROS過量積累時,會導(dǎo)致生物體的氧化損傷[32]。一些研究發(fā)現(xiàn),菌種退化與ROS的過度積累有關(guān)[33]。為了避免過量的ROS對機(jī)體造成傷害,生物體內(nèi)形成多糖、酚類、肽類等抗氧化物質(zhì)。在本研究中,外源添加Ser處理后,草菇體內(nèi)的各種氨基酸含量均發(fā)生不同程度的變化。特別是Met和Cys的含量顯著提高,這兩種氨基酸均有較好的抗氧化能力。CAMPBELL等[34]研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加Met能有效降低釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激,減少細(xì)胞損傷。ALI等[35]報道了Cys處理荔枝果皮后,能提高果皮的總酚含量和DPPH自由基清除活性。作為一種功能性氨基酸,Ser能夠進(jìn)入一碳循環(huán),生成一碳單位如甲基等,參與了嘌呤等重要物質(zhì)的合成,也影響著各種氨基酸和其他營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化[36]。本研究中,外源添加Ser后,菌絲體內(nèi)的黃酮、多酚等抗氧化物質(zhì)的含量也顯著提高。這些抗氧化物質(zhì)均能有效清除草菇退化菌株體內(nèi)多余的ROS,這可能是草菇的菌絲生長速度的子實體產(chǎn)量提高的原因。

礦物質(zhì)在生物體代謝活動中起著重要作用,它們有的是酶的活性因子,有的參與激素的生理作用[37]。本研究發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中外源添加Ser后,D0～D3菌株中的各種礦質(zhì)元素含量均不同程度的增加,特別是Mn、Cu、Zn的含量顯著提高。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是酶促系統(tǒng)中重要的酶,也是生物體內(nèi)清除ROS的第一道防線。在草菇中存在Cu/Zn-SOD和Mn-SOD兩類SOD[38]。POURSAEID等[39]研究發(fā)現(xiàn)在平菇栽培時添加Zn有助于提高平菇的菌絲生物量和子實體產(chǎn)量。高昆等[40]研究發(fā)現(xiàn),低濃度的Cu可有效促進(jìn)粉葛幼苗的生長。劉丹陽等[41]研究發(fā)現(xiàn),適當(dāng)濃度的Mn可影響甜菜體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)及膜脂質(zhì)過氧化作用。本研究通過外源Ser提高了草菇退化菌株中Mn、Cu、Zn的含量,可能促進(jìn)了SOD的活力,增強(qiáng)了菌株的ROS清除能力,從而有效恢復(fù)了草菇退化菌株的生產(chǎn)性狀。Ser影響草菇中各營養(yǎng)成分變化的具體機(jī)制,還有待于進(jìn)一步的研究。