薛文娜,周云龍,趙明星*,阮文權(quán)

1(江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)2(江蘇省厭氧生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122) 3(江蘇晨潔再生資源科技有限公司,江蘇 張家港,215600)

餐廚垃圾是指居民在日常生活和消費(fèi)過程中產(chǎn)生的生活廢棄物,是城市固體廢棄物的主要組成。隨著我國人民生活水平的提高和城市化進(jìn)程的發(fā)展,餐廚垃圾約占全國垃圾的10%～60%[1]。餐廚垃圾具有成分復(fù)雜、有機(jī)物含量高、含水率高等特點(diǎn),可以通過微生物將其降解并回收甲烷、氫氣等能源[2]。此外,基于國內(nèi)垃圾分類的普及以及國家“碳達(dá)峰,碳中和”目標(biāo)要求,餐廚垃圾的資源化處理成為重要的處置途徑[3]。厭氧發(fā)酵技術(shù)是一種被廣泛使用的處理方式,可用于餐廚垃圾的處置以及生產(chǎn)高價值附加產(chǎn)品。

由于餐廚垃圾組成復(fù)雜,因此其對厭氧發(fā)酵體系的影響因素較多,如氨氮和揮發(fā)性脂肪酸抑制等[4-5]。隨著研究的深入,更多厭氧發(fā)酵的其他影響因素被發(fā)現(xiàn),近年來有學(xué)者研究了餐廚垃圾中的辣素對厭氧發(fā)酵的影響。DU等[6]研究發(fā)現(xiàn)辣椒素濃度的提高降低了餐廚垃圾厭氧產(chǎn)甲烷,這可能是因?yàn)槔苯匪赝ㄟ^改變關(guān)鍵酶活性,降低細(xì)胞內(nèi)NAD+/NADH比值使得細(xì)胞死亡,對水解、產(chǎn)酸和產(chǎn)甲烷有抑制作用。針對此類抑制效應(yīng),預(yù)處理方法可以緩解辣素的影響,提高復(fù)雜底物的降解率,從而提升甲烷產(chǎn)量。辣素可以分為多種具體成分,包含大蒜素、辣椒素和姜辣素等,其中姜辣素是生姜中所有辣味物質(zhì)的總稱,6-姜酚是姜辣素中的主要代表活性物質(zhì)。但是目前對姜辣素在餐廚垃圾厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷中的影響及其抑制解除的研究還較少。采用預(yù)處理方式解除姜辣素對餐廚垃圾厭氧消化的抑制非常必要。YUE等[7]采用過碳酸鈉/紫外線產(chǎn)生的自由基降解辣椒素,提高脂質(zhì)和餐廚垃圾厭氧發(fā)酵甲烷產(chǎn)量。史進(jìn)程等[8]發(fā)現(xiàn)在25、60 ℃熱處理?xiàng)l件下,可以改變6-姜酚濃度。本文選取熱解、超聲和光催化氧化3種預(yù)處理手段,這些方式具有可操作性強(qiáng)、技術(shù)成熟和效果好等優(yōu)勢。

本文以餐廚垃圾厭氧發(fā)酵為研究對象,研究了不同濃度的姜辣素對餐廚垃圾厭氧發(fā)酵的影響。對比分析了高溫、超聲和TiO2聯(lián)合紫外光催化氧化3種預(yù)處理方法,研究了不同預(yù)處理方式解除姜辣素對餐廚垃圾厭氧發(fā)酵抑制的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

餐廚垃圾中每1 kg餐廚垃圾分別有400 g大米、350 g卷心菜、200 g豬肉和50 g豆腐;所有食材煮熟后按照比例進(jìn)行混合;厭氧顆粒污泥取自無錫市某食品廠的厭氧發(fā)酵池;接種污泥和底物的性質(zhì)如表1所示。由于6-姜酚為姜辣素主要代表成分,本文選取6-姜酚為研究對象,6-姜酚(純度96%),成都普瑞法科技有限公司。

表1 接種污泥和餐廚垃圾的主要特性Table 1 Characterizations of the inoculated sludge and food waste

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 不同濃度姜辣素對餐廚垃圾厭氧發(fā)酵影響實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)在工作容積為400 mL的500 mL血清瓶中進(jìn)行,反應(yīng)溫度為(37±0.5) ℃。實(shí)驗(yàn)開始前,利用葡萄糖馴化取自食品廠的厭氧污泥7 d,底物與接種污泥的比例為1∶1.5(VS比)[9]。每個反應(yīng)瓶中加入8 g VS餐廚垃圾和12 g VS接種污泥,每1 g總VS餐廚垃圾中加入不同量的6-姜辣素(4、8、12、16、20 mg),實(shí)驗(yàn)組分別標(biāo)記為B1、B2、B3、B4、B5。不添加6-姜辣素的試驗(yàn)作為空白組,標(biāo)記為CK。采用NaHCO3和3 mol/L氫氧化鈉或鹽酸溶液將各組的初始pH值調(diào)節(jié)為8.0。

1.2.2 不同預(yù)處理?xiàng)l件下餐廚垃圾厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)中污泥的馴化和接種比同1.2.1節(jié)。由1.2.1節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)B4組濃度有顯著的抑制影響,根據(jù)B4組的比例濃度,每個反應(yīng)瓶中加入6 g VS餐廚垃圾、9 g VS接種污泥和16 mg/g總揮發(fā)性固體姜辣素進(jìn)行解抑制實(shí)驗(yàn)。上述物質(zhì)混合后分別在60 ℃下處理1 h[8]、超聲功率為20 000 Hz下處理1 h[10]、1.25 g/L TiO2和紫外燈聯(lián)合處理1 h[11],這3種預(yù)處理的反應(yīng)瓶分別標(biāo)記為A1、A2、A3,其中對照組標(biāo)記為K1。在反應(yīng)開始前,用NaHCO3和3 mol/L的氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的初始pH值為8.0。

1.3 實(shí)驗(yàn)分析方法

TS、VS采用重量法測定,溶解性化學(xué)需氧量(soluble chemical oxygen demand, SCOD)測定根據(jù)《國家水和廢水監(jiān)測分析方法》[12]。C、N、H、S、O采用元素分析儀測定,pH采用pH計(jì)測定。揮發(fā)性脂肪酸(total volatile fatty acid, TVFAs)濃度采用氣相色譜儀(日本島津GC-2010 PLUS)測定。甲烷產(chǎn)量采用AMPTS測定[13]。蛋白質(zhì)利用凱式定氮法[14]測定,可溶性碳水化合物采用苯酚-硫酸法測定[15]。根據(jù)試劑盒方法測定乙酸激酶(acetokinase,ACK),堿性蛋白酶(alkaline protease,AKP),脫氫酶(dehydrogenase,DHA)活性,通過分光光度法測定輔酶F420活性[16]。反應(yīng)結(jié)束后的污泥胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)采用ZHANG等[17]的方法進(jìn)行提取,利用熒光分光光度計(jì)對松散型EPS(loosely bound EPS, LB-EPS)和緊密型EPS(tightly bound EPS, TB-EPS)進(jìn)行激發(fā)-發(fā)射矩陣(excitation-emission matrix,EEM)光譜分析。掃描速度為12 000 nm/min,電壓為500 V。激發(fā)波長(excitation wavelength,Ex)為200～450 nm,發(fā)射波長(emission wavelength,Em)為250～550 nm,Ex和Em的狹縫和采樣間隔設(shè)置為5 nm,儀器的光譜校正被設(shè)定為自動校正。

1.4 微生物群落分析

取1.2.2節(jié)反應(yīng)結(jié)束后各組的污泥放入不同離心管中,以4 000 r/min的速度旋轉(zhuǎn)5 min。丟棄上清液,剩余的沉淀物保存在無菌離心管中,并保存在干冰上,送到測序公司進(jìn)行分析。利用特異性引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因在V3～V4區(qū)。細(xì)菌的引物為806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 和338F(5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)。古菌引物為MLfF(5′-GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWAC AGC-3′)和MLrR(5′-TTCATTGCRTAGTTWGGRTAG TT-3′),提取樣品基因組后,測定DNA的產(chǎn)率和純度,PCR擴(kuò)增后對產(chǎn)物進(jìn)行純化,利用IlluminaMiseq進(jìn)行高通量測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理方式對甲烷產(chǎn)量變化的影響

如圖1-a所示,在不同姜辣素添加情況下,餐廚垃圾厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣量各有不同。反應(yīng)初期各組產(chǎn)氣量增加,空白組在第20天以后產(chǎn)氣趨于平緩,但是實(shí)驗(yàn)組在第30天后累積產(chǎn)氣量仍然增加。這說明添加姜辣素后,微生物需要一定的時間適應(yīng)環(huán)境體系。當(dāng)姜辣素濃度提高到8 mg/g VS時,餐廚垃圾的最大產(chǎn)甲烷量為578.00 mL/g VS。但是當(dāng)姜辣素濃度提高到16 mg/g VS時,餐廚垃圾的厭氧發(fā)酵受到嚴(yán)重抑制,最終累積甲烷產(chǎn)量僅為164.76 mL/g VS,是空白組的34%。最終的累積產(chǎn)氣量從大到小分別為B2>B1>B3>CK>B4>B5。這表明一定濃度的姜辣素會抑制產(chǎn)甲烷過程,可能是因?yàn)榻彼氐募尤霑绊懳⑸锏娜郝浣M成,降低物質(zhì)傳輸速率,從而降低甲烷產(chǎn)量[6]。

a-不同濃度下累積甲烷產(chǎn)量;b-不同條件下累積甲烷產(chǎn)量圖1 不同濃度姜辣素的甲烷累計(jì)產(chǎn)量和不同預(yù)處理 條件下甲烷累積產(chǎn)量變化Fig.1 Cumulative methane yield at different concentration of gingerol and change in cumulative methane yield under different pretreatment conditions

與對照組相比,預(yù)處理組累積產(chǎn)氣量有明顯提高(圖1-b),這說明實(shí)驗(yàn)組的預(yù)處理方式能夠解除姜辣素對餐廚垃圾厭氧發(fā)酵的抑制。最終的累積產(chǎn)氣量從大到小分別為A2>A3>A1>K1。其中超聲預(yù)處理效果最好,最終累積產(chǎn)甲烷量為111.17 mL/g VS,比對照組提高了3.12倍,提高效果優(yōu)于YUE等[18]的研究結(jié)果,這可能是因?yàn)槌曁幚磉^程中的空化過程會破壞姜辣素的結(jié)構(gòu),減少姜辣素對微生物的抑制,從而促進(jìn)產(chǎn)氣[19]。其次是光催化氧化預(yù)處理組,最終累積產(chǎn)甲烷量為89.17 mL/g VS,比對照組提高了2.22倍,這可能是因?yàn)楣獯呋趸a(chǎn)生的羥基基團(tuán)破壞了姜辣素的化學(xué)鍵。A1組反應(yīng)結(jié)束時的累積產(chǎn)甲烷量為51.67 mL/g VS,是對照組的1.87倍。

2.2 不同預(yù)處理方式對pH、TVFAs和SCOD變化的影響

如圖2-a所示,pH值總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,pH在前期下降是因?yàn)椴蛷N垃圾中的大分子有機(jī)物被微生物降解為小分子有機(jī)物而釋放到液相中,小分子有機(jī)物被產(chǎn)酸菌利用生成揮發(fā)性有機(jī)酸,由于酸量的積累導(dǎo)致溶液中pH下降,K1、A1、A2、A3組的最低pH分別為6.65、6.92、6.94和6.76,由于NaHCO3的緩沖作用pH維持在適宜產(chǎn)甲烷菌生長的范圍(6.5～7.5)。圖2-b為反應(yīng)過程中TVFAs的變化情況,反應(yīng)前10 d總酸濃度迅速提高,在反應(yīng)最后10 d趨于穩(wěn)定。反應(yīng)結(jié)束時各組的最終酸質(zhì)量濃度分別為9.145(K1)、10.56(A1)、10.482(A2)和9.26(A3) g/L。圖2-c為SCOD的變化情況,餐廚垃圾中的大分子有機(jī)物被水解菌降解為小分子有機(jī)物后使得SCOD迅速升高到12 000 mg/L左右,但從第10天后SCOD濃度緩慢下降,這是因?yàn)橛袡C(jī)質(zhì)在被降解利用。在第14天以后,有機(jī)物濃度逐漸上升。在反應(yīng)結(jié)束時,SCOD維持在12 000～15 000 mg/L。

圖2 不同預(yù)處理?xiàng)l件下pH值、TVFAs和SCOD變化情況Fig.2 Change of pH, TVFAs and SCOD under different pretreatment conditions

2.3 不同預(yù)處理方式對可溶性蛋白質(zhì)和碳水化合物變化的影響

整個反應(yīng)過程中蛋白質(zhì)濃度整體呈現(xiàn)上升趨勢(圖3-a),在反應(yīng)開始時蛋白質(zhì)濃度迅速上升,反應(yīng)結(jié)束時實(shí)驗(yàn)組的蛋白質(zhì)濃度都高于對照組。結(jié)束時A1、A2、A3組的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別為1 146.17、1 119.4、872.72 mg/L,而對照組的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為833.01 mg/L。這可能是因?yàn)轭A(yù)處理能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)從固相釋放到液相中。

可溶性碳水化合物的變化如圖3-b所示,反應(yīng)初期有機(jī)物不斷水解,碳水化合物濃度迅速上升,在第12天左右下降到100～150 mg/L,在第15天左右小幅上升。反應(yīng)結(jié)束時K1、A1、A2、A3組碳水化合物質(zhì)量濃度分別為99.52、128.33、172.05、115.31 mg/L,實(shí)驗(yàn)組的濃度比對照組高,這可能是因?yàn)轭A(yù)處理方式促進(jìn)了碳水化合物的水解。ELBESHBISHY等[20]發(fā)現(xiàn)超聲預(yù)處理可以使可溶性蛋白增加約20%,可溶性碳水化合物提高17%,這與本文研究結(jié)果較一致。

2.4 不同預(yù)處理方式對污泥LB-EPS和TB-EPS變化的影響

通過3DEEM分析各組反應(yīng)結(jié)束時污泥中LB-EPS和TB-EPS溶液中有機(jī)物的情況,檢測主要官能團(tuán),熒光強(qiáng)度用于表征溶液中有機(jī)物的分布。根據(jù)報道,有機(jī)物的3DEEM熒光光譜可分為2個區(qū)域,在這些區(qū)域誘導(dǎo)信號的物質(zhì)分別為芳香蛋白物質(zhì)I(Ex/Em:200～240/300～380 nm),可溶性微生物副產(chǎn)物的Ⅱ區(qū)(Ex/Em:250～280/280～380 nm)[21]。如圖4所示,峰A(Ex/Em:200～240/300～380 nm)對應(yīng)芳香蛋白質(zhì)類物質(zhì),峰B(Ex/Em:250～280/280～380 nm)代表可溶性微生物副產(chǎn)物。LB-EPS中的熒光強(qiáng)度峰要強(qiáng)于TB-EPS,這說明與緊密的胞外聚合物相比,松散的胞外聚合物中的有機(jī)物含量更高。A1組的熒光強(qiáng)度最大,這可能是因?yàn)闊峤忸A(yù)處理能有效地刺激微生物分泌胞外聚合物。A2和A3組的熒光強(qiáng)度較弱,這說明超聲和光催化氧化對微生物的影響較小。TAO等[22]研究了大蒜素對餐廚垃圾和活性污泥共發(fā)酵體系的影響,在發(fā)酵液的三維熒光分析中有機(jī)質(zhì)和酪氨酸類有機(jī)物兩個峰的熒光強(qiáng)度分別從1 956和2 010提高到2 816和2 802。但本研究中A1組兩個峰熒光強(qiáng)度僅為500.28和484.08,小于TAO等[22]的研究結(jié)果,這可能是因?yàn)樘幚淼牡孜锝M成差異而引起的。

2.5 不同預(yù)處理方式對酶活性的影響

圖5為反應(yīng)結(jié)束后各體系酶活性情況?？傮w上實(shí)驗(yàn)組的酶活性都高于對照組,這說明預(yù)處理能夠提高細(xì)胞中各種酶的活性,促進(jìn)物質(zhì)的傳輸速度。ACK是發(fā)酵過程中控制乙酸生成的關(guān)鍵酶。乙酸激酶活性分別為對照組的103%(A1)、187.66%(A2)和157%(A3),比對照組都有提高。DHA是指能催化物質(zhì)進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的酶[23],實(shí)驗(yàn)組的脫氫酶活性分別比對照組提高108.45%、179.27%和102.22%。AKP是能夠在堿性條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶,A1、A2、A3組的堿性蛋白酶活性分別為對照組的146.12%、157.89%和103.51%。輔酶F420是一種產(chǎn)甲烷菌酶,主要參與CH4的生成過程[24],實(shí)驗(yàn)組中輔酶F420活性較對照組分別提高了3.0%、45.83%和37.92%,這表明預(yù)處理方式可提高輔酶F420的活性,促進(jìn)甲烷的生成。NEUMANN等[25]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過超聲預(yù)處理后樣品的蛋白酶活性比空白提高1.8～4.3倍,這與本文的結(jié)果較一致。

2.6 不同預(yù)處理方式對微生物菌群變化的影響

如圖6-a所示,細(xì)菌群落在門水平上分布的優(yōu)勢菌以Bacteroidetes、Firmicutes、Synergistota和Actinobacteria為主。對照組污泥中豐度最大的是Bacteroidetes(21.66%)、Firmicutes(22.41%)和Actinobacteria (19.70%)。經(jīng)過預(yù)處理后,污泥中的微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。Bacteroidetes和Actinobacteria是厭氧發(fā)酵過程主要的產(chǎn)酸菌,對碳水化合物具有降解作用,其相對豐度的提高也會導(dǎo)致?lián)]發(fā)性脂肪酸濃度的提高,A1組相比對照組Firmicutes和Chloroflexi的豐度增加,Chloroflexi能夠降解餐廚垃圾中的多糖和單糖,并能夠促進(jìn)乙酸的生成從而為產(chǎn)甲烷菌提供底物。LI等[26]研究表明,Chloroflexi參與厭氧發(fā)酵過程,有利于促進(jìn)水解發(fā)酵的進(jìn)行。A2組中Caldatribacteriota和Proteobacteria豐度增加,Proteobacteria的類型多樣,不僅能利用葡萄糖、丙酸和丁酸等小分子化合物,而且能在水解酸化中利用有機(jī)物產(chǎn)生乙酸為產(chǎn)甲烷菌提供底物。A3組的Firmicutes豐度較高,Firmicutes可以分泌多種胞外酶降解大分子物質(zhì),如蛋白質(zhì)和脂類等。因此,Firmicutes相對豐度的提高加快了有機(jī)物的降解,為產(chǎn)甲烷菌提供營養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組和對照組的微生物群落結(jié)構(gòu)差異說明預(yù)處理可以改變微生物結(jié)構(gòu),促進(jìn)甲烷的生成。

圖6-b為反應(yīng)結(jié)束后各體系污泥中古菌群落在屬水平上的變化。優(yōu)勢菌是Methanothrix、Methanobacterium、Methanolinea,其中,Methanothrix屬于嗜乙酸型產(chǎn)甲烷菌,Methanobacterium和Methanolinea屬于嗜氫型產(chǎn)甲烷菌。與對照組接種污泥相比,實(shí)驗(yàn)組中的Methanothrix在厭氧發(fā)酵體系內(nèi)有所變化,分別提高了6.0%、8.0%、1.0%,說明預(yù)處理手段能夠提高嗜乙酸型產(chǎn)甲烷菌的生長。然而,與對照組相比,Methanobacterium由41%下降到18%～24%。此外,與實(shí)驗(yàn)組相比,對照組Methanolinea的相對豐度較小,這表明經(jīng)過預(yù)處理后能促進(jìn)微生物從嗜氫型產(chǎn)甲烷菌向嗜乙酸型產(chǎn)甲烷菌演替,LI等[27]認(rèn)為,Methanobacterium可以利用H2和CO2轉(zhuǎn)化為CH4。而與K1相比,實(shí)驗(yàn)組2種嗜氫型產(chǎn)甲烷菌的相對豐度較低,這表明預(yù)處理可以促進(jìn)嗜乙酸型產(chǎn)甲烷菌的富集,從而加快乙酸向CH4的轉(zhuǎn)化。

a-細(xì)菌門水平相對豐度;b-古菌屬水平相對豐度
圖6 細(xì)菌門水平和古菌屬水平的相對豐度
Fig.6 Relative abundances of bacterial phylum and archaeal genus

3 結(jié)論

研究表明姜辣素濃度大于16 mg/g總揮發(fā)性固體時,對餐廚垃圾厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷有影響。姜辣素的預(yù)處理對解除餐廚垃圾厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣抑制具有較好的效果。其中超聲預(yù)處理后餐廚垃圾的產(chǎn)氣量最高,是對照組的4.12倍。光催化氧化預(yù)處理下的產(chǎn)氣量為對照組的3.22倍,熱解預(yù)處理效果最差,最終產(chǎn)氣量是對照組的1.87倍。與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組的可溶性有機(jī)物含量較高,預(yù)處理可以促進(jìn)有機(jī)質(zhì)的釋放。預(yù)處理還提升了ACK、AKP、DHA和輔酶F420的活性。預(yù)處理可以改變微生物群落結(jié)構(gòu),促進(jìn)Firmicutes、Chloroflexi和Proteobacteria菌的生長,同時產(chǎn)甲烷古菌從嗜氫型向嗜乙酸型演替。本文研究結(jié)果可為餐廚垃圾厭氧發(fā)酵的抑制解除提供借鑒,但本研究為批式反應(yīng),后續(xù)需要在連續(xù)處理情況下,深入研究姜辣素對餐廚垃圾的影響及其解除方式。