張雷淵,張春強(qiáng),李慧,楊海鶯,李小燕,佟恩杰,陳文波*,謝和*

1(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院,山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心,貴州 貴陽(yáng),550025) 2(中糧麥芽(大連)有限公司,遼寧 大連,116200)3(中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院,北京,102209)

麥芽是啤酒釀造的主要原料,其制備從原料大麥開(kāi)始,包括浸麥、發(fā)芽和干燥3個(gè)環(huán)節(jié)。工業(yè)制麥對(duì)原料大麥的需求量巨大,多數(shù)情況下制麥企業(yè)需要從全球不同國(guó)家和地區(qū)進(jìn)口大麥原料,如俄羅斯、德國(guó)、法國(guó)、烏克蘭、澳大利亞等。大麥產(chǎn)區(qū)分布廣泛,覆蓋范圍從接近北極圈的斯堪的維納半島到赤道附近的埃塞俄比亞和南美洲,從低于水平面的死海到安第斯山和喜瑪拉雅山,從濕潤(rùn)溫暖的西歐到北美、非洲和澳大利亞的部分干燥區(qū)域等[1]。

不同產(chǎn)區(qū)大麥的微生物組成千差萬(wàn)別。大麥表面被纖維質(zhì)的谷殼包裹,成為眾多細(xì)菌、酵母和絲狀真菌的理想“棲息地”[2]。在制麥過(guò)程中,這些微生物會(huì)持續(xù)生長(zhǎng)繁殖,并影響大麥的發(fā)芽性能以及麥芽和最終啤酒的品質(zhì)。與細(xì)菌相比,真菌對(duì)制麥的影響會(huì)更明顯,因?yàn)橹汽溸^(guò)程中所需的水解大麥淀粉、蛋白質(zhì)和半纖維素等高分子物質(zhì)的酶,除了來(lái)源于大麥,還可由大麥籽粒表面的真菌提供[3]。目前,大麥原料中微生物具體的種屬與胞外酶活之間的關(guān)系尚不清楚。另外,真菌污染也會(huì)降低大麥的發(fā)芽率、引發(fā)啤酒酵母超前絮凝和啤酒噴涌等問(wèn)題[4-5]。因此,控制真菌污染一直是制麥行業(yè)的研究熱點(diǎn)。

近年來(lái),高通量分子測(cè)序技術(shù)因其具有測(cè)序深度大、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn),已在不同食品領(lǐng)域的微生物群落分析中得到廣泛應(yīng)用[6]。本研究采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù),并結(jié)合可培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)真菌分離技術(shù)對(duì)制麥過(guò)程中的真菌進(jìn)行分析;同時(shí)結(jié)合理化指標(biāo)分析和可培養(yǎng)真菌的產(chǎn)酶情況,揭示制麥過(guò)程真菌菌群結(jié)構(gòu)演替規(guī)律及其對(duì)麥芽品質(zhì)的影響,以期為工業(yè)制麥過(guò)程微生物的控制及制麥工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大麥:La Trobe(澳大利亞產(chǎn)區(qū))。

1.1.2 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和WL培養(yǎng)基,北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;YPD培養(yǎng)基(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖20,瓊脂20,調(diào)節(jié)pH至 6.0,于121 ℃、20 min條件滅菌后備用。

1.1.3 試劑

乳酸酚棉藍(lán)染液,北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;E×Taq酶、dNTPs Mixture、10×Buffer I,TaKaRa公司;真菌DNA提取試劑盒,北京天根生化科技有限公司;羧甲基纖維素鈉、酪蛋白、可溶性淀粉、剛果紅(分析純),上海滬試公司;木聚糖,阿拉丁試劑有限公司;NaCl、葡萄糖、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、K2HPO4、KCl、NaNO3、FeSO4(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VB-7101-3/4微型制麥系統(tǒng),德國(guó)SEEGER公司;S1000 TM PCR儀,美國(guó)Bio-Rad公司;Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái),美國(guó)Illumina公司;Scope A1正置相差顯微鏡,德國(guó)ZEISS公司;IPP260低溫培養(yǎng)箱,德國(guó)Memmert公司;Scan1200自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀,法國(guó)Interscience公司;AC2-4S1生物安全柜,新加坡ESCO公司;SQ510C高壓蒸汽滅菌鍋,日本YAMATO公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制麥流程及樣品采集

麥芽制備流程如下所示:

原料大麥→浸麥(15 ℃、30 h,浸麥度43%～44%)→發(fā)芽(15 ℃、96 h)→排潮(45～55 ℃、6 h)→干燥(65～85 ℃、11 h,降低水分至3%～5%)→除根(成品麥芽)

利用多點(diǎn)采樣法分別對(duì)不同制麥工藝階段的樣品進(jìn)行無(wú)菌取樣,用于優(yōu)勢(shì)真菌的分離鑒定及真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析。大麥原料樣品編號(hào)為M1、浸麥結(jié)束樣品編號(hào)為M2、發(fā)芽24 h樣品編號(hào)為M3、發(fā)芽結(jié)束樣品編號(hào)為M4、排潮結(jié)束樣品編號(hào)為M5、成品麥芽編號(hào)為M6。

1.3.2 菌種的分離與純化

稱取樣品25 g,置于盛有225 mL滅菌生理鹽水及玻璃珠的三角瓶中,于振蕩培養(yǎng)箱中150 r/min振搖30 min,制得1∶10稀釋度的樣品勻液。將此樣品依次進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-6。取各梯度樣品稀釋液1 mL均勻涂布在孟加拉紅培養(yǎng)基和YPD平板培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)3～5 d。菌落計(jì)數(shù)后,根據(jù)菌落形態(tài)、大小及顏色等特點(diǎn),挑選不同的單菌落劃線接種至WL培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基中。重復(fù)此純化過(guò)程至少3次。將所得單菌落接種于YPD培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基試管斜面,培養(yǎng)結(jié)束后,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 真菌的形態(tài)觀察

將保存的絲狀真菌接種于PDA培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)7 d;酵母菌接種于WL培養(yǎng)基上培養(yǎng),28 ℃培養(yǎng)2～3 d。根據(jù)菌落生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài),挑取單個(gè)酵母菌落制成水浸片,用于菌體形態(tài)觀察;挑取絲狀真菌菌落用乳酸酚棉藍(lán)染液染色,用于菌絲及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.4 真菌的分子生物學(xué)鑒定

取單個(gè)酵母菌落和單個(gè)絲狀真菌菌落,接種于液體培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)3～7 d。取1 mL菌液,4 000 r/min離心10 min后,棄去上清液,收集菌體沉淀,使用真菌DNA提取試劑盒提取菌株DNA。使用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所得基因組DNA的濃度和純度。使用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增真菌的ITS區(qū)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后送至北京新時(shí)代眾合科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)序獲得的有效序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)同源序列比對(duì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果,導(dǎo)出同源性≥98%的菌株ITS基因序列區(qū)。借助MEGA 11.0軟件,采用鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 真菌多樣性測(cè)定

采用E.Z.N.A.?soil DNA kit試劑盒提取樣品中的微生物總DNA。使用引物ITS3F(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對(duì)總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系與程序參照文獻(xiàn)[7]。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。采用美吉云計(jì)算平臺(tái)分析,對(duì)序列進(jìn)行操作分類單位(operational taxonomic unit,OTU)聚類,對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋,比對(duì)UNITE 8.0數(shù)據(jù)庫(kù),基于分類學(xué)信息,在不同分類學(xué)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)分析。測(cè)序原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),SRA登錄號(hào)為PRJNA907033。

1.3.6 蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和纖維素酶活性檢測(cè)

使用透明圈法檢測(cè)所得菌株產(chǎn)胞外蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和纖維素酶的能力。以3點(diǎn)接種法將活化的菌株接種到相應(yīng)篩選培養(yǎng)基上,25 ℃培養(yǎng)3～7 d后觀察菌落周圍透明圈的出現(xiàn)情況[8-11]。

1.3.7 產(chǎn)酶菌株對(duì)麥芽品質(zhì)的影響驗(yàn)證

將產(chǎn)酶菌株孢子懸液噴灑在浸麥結(jié)束后的大麥上,進(jìn)入發(fā)芽環(huán)節(jié)。接種方法參照趙志超等[12]的描述并稍作修改:選取產(chǎn)胞外酶能力較強(qiáng)的菌株接種到PDA培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)至孢子長(zhǎng)出。將其沖洗到已滅菌的培養(yǎng)基中并調(diào)整孢子濃度至106個(gè)/mL,30 ℃萌發(fā)6 h。按照2%(mL/100 g)的接種量將孢子萌發(fā)液均勻噴灑在浸麥結(jié)束的大麥上進(jìn)行發(fā)芽。麥芽浸出率和糖化力的測(cè)定參照QB/T 1686—2008中規(guī)定的方法。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

所有檢測(cè)試驗(yàn)重復(fù)3次,使用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和分析。利用R軟件(v3.5.3)和Origin 2018軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 制麥過(guò)程中酵母及絲狀真菌數(shù)量變化情況

不同制麥階段樣品中的可培養(yǎng)酵母和絲狀真菌的數(shù)量如圖1所示。原料大麥(M1)自身攜帶一定數(shù)量的酵母和絲狀真菌,其數(shù)量分別為1.4×104、7.1×103CFU/g。隨著制麥過(guò)程的進(jìn)行,酵母和絲狀真菌均出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。這與制麥過(guò)程中水分和溫度的變化密切相關(guān)[13]。發(fā)芽結(jié)束時(shí)(M4)樣品中酵母和絲狀真菌數(shù)量達(dá)到峰值,分別為6.2×107、3.2×105CFU/g。隨著溫度的上升和水分含量的下降,排潮階段(M5)樣品中微生物的數(shù)量下降。在成品麥芽(M6)中酵母和絲狀真菌數(shù)量分別為2.1×105、1.1×104CFU/g,約為制麥過(guò)程中微生物峰值的1/3。

圖1 制麥過(guò)程中酵母及絲狀真菌數(shù)量變化情況Fig.1 Amount changes in yeast and filamentous fungi during malting

2.2 制麥過(guò)程中可培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)真菌的分離與鑒定

2.2.1 制麥過(guò)程中可培養(yǎng)真菌的分離與純化

從制麥工藝的6個(gè)階段樣品中共分離得到174株真菌,包括酵母及酵母樣真菌93株、絲狀真菌81株。酵母及酵母樣真菌菌落表現(xiàn)為表面光滑、不透明和黃油質(zhì)的平坦菌落;蠟狀、不透明,乳白色至奶油白;奶油質(zhì)地和粉紅色或紅色等。菌落直徑為1～4 mm,小部分菌落直徑小于1 mm。光學(xué)顯微鏡下酵母菌的細(xì)胞形態(tài)主要有球形、近球形、卵圓形、橢圓形、檸檬形等形狀,直徑為1.5～5 μm。生長(zhǎng)于PDA培養(yǎng)基上的絲狀真菌,菌落形態(tài)為放線狀皺紋或中心有臍狀突起,質(zhì)地絨狀,略帶絮狀,也有茸毛狀、絮狀菌落,菌落顏色為淺黃色、褐色、灰色等。部分真菌菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 制麥過(guò)程中部分可培養(yǎng)真菌菌落及顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Colony and microstructure photos of some fungi from malting

2.2.2 可培養(yǎng)真菌的分子鑒定

根據(jù)菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)對(duì)分離得到的真菌進(jìn)行初步分組,將菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)相類似的菌株劃分為一組。選取菌落形態(tài)差異較大的代表菌株進(jìn)行ITS-rRNA基因序列測(cè)序分析,共測(cè)序78個(gè)菌株。如表1所示,ITS基因序列一致性比對(duì)結(jié)果表明,78株真菌的ITS基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中2個(gè)門(Basidiomycota和Ascomycota)10個(gè)目的25個(gè)模式菌株ITS序列的一致性均大于98%。其中,絲狀真菌有10種,酵母狀真菌有15種。絲狀真菌主要分離自大麥原料樣本,這可能與大麥原料水分過(guò)低,不適合酵母類微生物生長(zhǎng)相關(guān)[14]。浸麥之后,大麥水分增加明顯,促進(jìn)了酵母快速繁殖和真菌休眠孢子萌發(fā)。因此,在浸麥結(jié)束和發(fā)芽初期(M2和M3)樣品中的真菌以酵母為主,特別是擔(dān)子菌門的酵母。這與擔(dān)子菌門酵母在低于20 ℃的環(huán)境中生長(zhǎng)良好密切相關(guān)[13-15]。與浸麥和發(fā)芽初期不同,發(fā)芽結(jié)束樣本(M4)至成品麥芽(M6)中的優(yōu)勢(shì)真菌為子囊菌,與LAITILA等[14]的研究結(jié)果一致。

以25株代表菌株的ITS-rRNA序列(GenBank登錄號(hào)為ON008181-ON008205)及與其相似度最高的模式菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖3所示,所得菌株與GenBank內(nèi)相應(yīng)同源性參考菌株聚為一支,且大多數(shù)菌株與同源性參考菌株聚為一支的支持率為100%,顯示分離菌株與模式菌株存在很強(qiáng)的親緣關(guān)系。

圖3 基于ITS-rRNA序列構(gòu)建的可培養(yǎng)真菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the culturable fungi based on the ITS-rRNA gene sequences

2.3 制麥過(guò)程中真菌菌群的Alpha多樣性分析

制麥過(guò)程中真菌菌群的Alpha多樣性分析結(jié)果如表2所示。每個(gè)樣品的Coverage值均達(dá)到0.999,表明各樣品文庫(kù)的覆蓋率高,測(cè)序結(jié)果足夠體現(xiàn)樣品中真菌菌群多樣性的真實(shí)情況。發(fā)芽24 h樣品(M3)的Shannon指標(biāo)達(dá)到最高值1.58,意味著真菌的物種多樣性在此階段最高。Chao和Ace是用來(lái)評(píng)價(jià)菌群豐富度的指標(biāo),數(shù)值越大,豐富度越高[16]。Chao和Ace指數(shù)均呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)。在原料大麥(M1)中,Ace和Chao的數(shù)值分為52.5和54.0,均高于發(fā)芽結(jié)束的樣品(M4),說(shuō)明大麥原料中的真菌豐富度非常高。因此,有學(xué)者將大麥種子視為一個(gè)珍貴的天然菌種庫(kù)[17]。浸麥后樣品(M2)的Ace和Chao值分別降低至30.6和32.0,這可能是浸麥操作洗掉了大麥表面附著的真菌所致。隨后,真菌的豐富度呈現(xiàn)上升趨勢(shì),直至最終成品麥芽(M6),Ace和Chao的值達(dá)到55.0和53.0的水平。這表明較高的焙焦溫度未降低成品麥芽中真菌的豐富度。這與BIANCO等[18]的研究結(jié)果一致。

2.4 制麥過(guò)程中真菌菌群的Beta多樣性分析

制麥過(guò)程6個(gè)不同階段樣品中真菌OTUs的聚類分析和主成分分析結(jié)果如圖4所示。基于OTUs的聚類分析顯示了不同樣本中真菌菌群結(jié)構(gòu)的相似性或差異關(guān)系[19]。如圖4-A所示,大麥(M1)菌群?jiǎn)为?dú)為一支。浸麥結(jié)束后,大麥水分含量上升,酵母和休眠孢子萌發(fā),真菌菌群相似性增加,因此,浸麥結(jié)束樣品(M2)和發(fā)芽24 h樣品(M3)真菌菌群聚為一支。發(fā)芽結(jié)束后,樣品中真菌的種類和數(shù)量達(dá)到峰值。隨后的排潮和焙焦環(huán)節(jié)因溫度較高,不利于真菌種類和數(shù)量的增加,樣品中的真菌群落具有較高相似度。因此,發(fā)芽結(jié)束樣品(M4)、排潮結(jié)束樣品(M5)和成品麥芽(M6)聚為一支。

A-聚類分析;B-主成分分析圖4 制麥過(guò)程6個(gè)不同階段樣品中真菌OTUs的 聚類分析及主成分分析Fig.4 Cluster analysis and principal component analysis on fungus OTUs from the 6 different stages of malting

如圖4-B所示,對(duì)制麥過(guò)程樣品進(jìn)行主成分分析,以樣品點(diǎn)之間的距離來(lái)衡量其真菌群落結(jié)構(gòu)組成的相似或差異程度。分析發(fā)現(xiàn),大麥原料(M1)與各個(gè)樣品距離相對(duì)較遠(yuǎn),即真菌群落差異較大;浸麥結(jié)束樣品(M2)和發(fā)芽24 h樣品(M3)距離較近,發(fā)芽結(jié)束樣品至成品麥芽(M4、M5、M6)聚在一起,與圖4-A聚類分析結(jié)果相一致。聚類分析與主成分分析結(jié)果相互佐證,進(jìn)一步表明制麥前期樣品(M2和M3)與制麥后期樣品(M4～M6)真菌群落差異明顯,但各相鄰樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)差異性不明顯,即進(jìn)入制麥后真菌群落結(jié)構(gòu)的變化是一個(gè)逐步演替的過(guò)程。

2.5 制麥過(guò)程中真菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性分析

為深入揭示制麥過(guò)程中真菌菌群在各分類學(xué)水平上的組成情況,對(duì)不同制麥階段樣品中真菌菌群結(jié)構(gòu)的門水平和屬水平的特征進(jìn)行分析(圖5)。在門水平上,所有樣品中真菌群落共包含2個(gè)門(圖5-A)。其中,子囊菌門為大麥原料樣品(M1)中的優(yōu)勢(shì)菌門,其相對(duì)豐度為81.79%,隨后呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),并保持在95.33%～97.82%的相對(duì)豐度,為整個(gè)制麥過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌門。擔(dān)子菌門在浸麥(M2)和發(fā)芽24 h(M3)階段為優(yōu)勢(shì)菌門,浸麥階段相對(duì)豐度達(dá)到98.17%,隨后呈下降趨勢(shì)。

A-門水平;B-屬水平圖5 不同制麥階段真菌群落結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Community structure of the fungi from different stage in the malting process

從不同制麥階段的樣品中共鑒定出57個(gè)真菌屬,其中未被分類的酵母目(unclassified_o_Saccharomycetales)、線黑粉酵母屬(Filobasidium)、鏈格孢屬(Alternaria)等13個(gè)真菌屬平均相對(duì)豐度≥1%,為優(yōu)勢(shì)菌屬(圖5-B)。大麥原料(M1)中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)真菌屬為Alternaria,相對(duì)豐度為68.03%,浸麥結(jié)束(M2)后下降至1.3%,可能是由于浸麥水的沖洗,或是浸麥溫度相對(duì)較低不適于該屬的真菌生長(zhǎng)所致。Filobasidium是浸麥結(jié)束(M2)和發(fā)芽前期(M3)樣品中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬,在大麥原料中該屬的相對(duì)豐度僅為6.99%,但在浸麥結(jié)束和發(fā)芽前期分別上升至84.51%和69.79%。浸麥階段和發(fā)芽初期為制麥過(guò)程中濕度條件最大的2個(gè)階段,推測(cè)Filobasidium的生長(zhǎng)可能和環(huán)境較高的濕度有關(guān)[20]。發(fā)芽結(jié)束(M4)、排潮結(jié)束(M5)和成品麥芽(M6)階段的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬是unclassified_o_Saccharomycetales,并一直保持著較高的豐度。

2.6 制麥過(guò)程中可培養(yǎng)真菌產(chǎn)胞外酶分析

將分離得到的真菌接種至蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶及纖維素酶篩選培養(yǎng)基上,考察各菌株產(chǎn)胞外酶的情況,結(jié)果如表3所示。使用透明圈法篩選到了7株產(chǎn)蛋白酶的真菌、6株產(chǎn)淀粉酶的真菌、7株產(chǎn)木聚糖酶的真菌和12株產(chǎn)纖維素酶的真菌菌株。至少產(chǎn)1種胞外酶的真菌共有16株,其中,6株真菌具有同時(shí)產(chǎn)3種胞外酶的能力,2株真菌具有同時(shí)產(chǎn)4種胞外酶的能力。

表3 制麥過(guò)程中可培養(yǎng)真菌產(chǎn)胞外酶的能力Table 3 The ability of the culturable fungi from malting to produce extracellular enzymes

2.7 產(chǎn)酶菌株對(duì)麥芽品質(zhì)的影響

糖化力是指麥芽中酶分解自身胚乳淀粉的能力。浸出率是指每百克無(wú)水麥芽中可溶性物質(zhì)的含量,在一定程度上反映了大麥籽粒發(fā)芽過(guò)程中干物質(zhì)的損耗情況[21]。在制麥過(guò)程中接種產(chǎn)酶菌株后,麥芽糖化力和浸出率的變化情況如圖6所示。結(jié)果表明,接種產(chǎn)胞外酶的菌株后,麥芽的糖化力均有所提升,以接種PAT-Y265(R.mucilaginosa)菌株的提升最為顯著,這可能是因?yàn)樵摼戤a(chǎn)生的胞外淀粉酶提高了麥芽糖化力。由圖6-B可知接種產(chǎn)胞外酶菌株也提升了麥芽的浸出率,特別是PAT-Y265(R.mucilaginosa)、PAT-M17(C.halotolerans)和PAT-M25(T.barcinensis)對(duì)麥芽浸出率的提升最為明顯,達(dá)到了顯著的水平。這可能是因?yàn)樗鼈兎置诘陌饫w維素酶、蛋白酶、木聚糖酶促進(jìn)了麥芽胚乳細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)等生物大分子的水解[22],進(jìn)而提高了麥芽的浸出率。產(chǎn)胞外酶菌株接種麥芽的結(jié)果再次表明,合理控制制麥過(guò)程中的真菌組成有助于提升麥芽糖化力、浸出率等品質(zhì)指標(biāo)。

A-糖化力;B-浸出率圖6 產(chǎn)酶菌株對(duì)麥芽糖化力和浸出率的影響情況(P<0.05)Fig.6 Effect of extracellular enzyme producing strains on malt diastatic power and malt extract (P<0.05)

3 結(jié)論

本研究利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法,對(duì)制麥過(guò)程中不同階段樣品的真菌群落進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,制麥過(guò)程中酵母菌數(shù)量遠(yuǎn)高于絲狀真菌,且酵母菌和絲狀真菌呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。利用分離培養(yǎng)法在不同制麥階段采集的樣品中分離到174株真菌,形態(tài)學(xué)及ITS-rRNA序列分析結(jié)果表明,這些真菌屬于2門、17屬、25種。其中,絲狀真菌主要分離自大麥原料,在浸麥結(jié)束和發(fā)芽初期的樣品中主要分離到擔(dān)子菌門酵母,而發(fā)芽結(jié)束到成品麥芽樣品中以子囊菌酵母為優(yōu)勢(shì)菌群。利用平板篩選法對(duì)制麥過(guò)程中可培養(yǎng)真菌的蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和纖維素酶4種水解酶活性進(jìn)行篩選,結(jié)果表明制麥過(guò)程中真菌群落對(duì)麥芽水解酶系有一定貢獻(xiàn)作用。此外,選取了5株產(chǎn)胞外酶能力較高的菌株并將其應(yīng)用到制麥過(guò)程中,所得成品麥芽的糖化力和浸出率均有所提升,進(jìn)一步說(shuō)明這些微生物在制麥過(guò)程中具有促進(jìn)麥芽溶解的作用。

對(duì)樣品的高通量測(cè)序結(jié)果表明,在浸麥結(jié)束(M2)時(shí)真菌物種豐富度最低,隨后呈上升趨勢(shì)。聚類分析與主成分分析結(jié)果相互佐證,制麥前期樣品(M2和M3)與制麥后期樣品(M4～M6)的真菌群落有明顯差異,但各相鄰樣本的真菌群落結(jié)構(gòu)差異性不明顯,說(shuō)明進(jìn)入制麥后真菌群落結(jié)構(gòu)的變化是一個(gè)逐步演替的過(guò)程。從制麥樣品中共檢出2真菌門、58真菌屬。門水平上,大麥原料(M1)及制麥后期(M4～M6)樣本以Ascomycota為優(yōu)勢(shì)門,而Basidiomycota為浸麥結(jié)束(M2)和發(fā)芽前期(M3)樣本中的優(yōu)勢(shì)門,此結(jié)果與平板分離培養(yǎng)結(jié)果一致。制麥過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌屬主要有unclassified_o_Saccharomycetales、Filobasidium和Alternaria等13屬。

本研究利用分離培養(yǎng)結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)揭示了制麥過(guò)程中豐富的真菌群落多樣性及其演替情況,這些真菌在制麥生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色,對(duì)麥芽產(chǎn)品的質(zhì)量有著重要影響,其具體功能性及安全性有待深入研究。此外,通過(guò)對(duì)制麥過(guò)程中真菌群落的分析,在豐富了制麥微生物資源的同時(shí),也為麥芽質(zhì)量控制以及麥芽食品安全控制提供了重要的理論依據(jù)。