汪佳麗 徐少華 付 琦 劉 濤

廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬?lài)?guó)際壯醫(yī)醫(yī)院心胸血管外科，廣西南寧 530201

大動(dòng)脈炎（takayasu arteritis，TA）是一種慢性肉芽腫性血管炎，主要累及主動(dòng)脈及其主要分支，如頸動(dòng)脈、椎動(dòng)脈、頭臂動(dòng)脈、鎖骨下動(dòng)脈等動(dòng)脈[1]，主要癥狀包括關(guān)節(jié)和肌肉疼痛、全身不適、發(fā)燒、盜汗。約10%患者表現(xiàn)為血管炎癥狀，如胸背部、頸部疼痛、腹痛等[2]。其治療方法包括藥物和手術(shù)治療，藥物治療分為誘導(dǎo)緩解期和維持期，治療藥物主要包括糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）以及非GC類(lèi)免疫抑制劑。在誘導(dǎo)緩解期，主要的治療方法是將GC與免疫抑制劑聯(lián)合使用；在維持期，將GC逐漸減量維持，但未詳細(xì)說(shuō)明具體劑量[3]。

中醫(yī)將TA歸于“血痹”“瘀證”“無(wú)脈癥”等范圍，黃芪桂枝五物湯出于《金匱要略》，為東漢醫(yī)家張仲景所著[4]；《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治第六》篇述：“血痹陰陽(yáng)俱微，寸口關(guān)上微，尺中小緊，外證身體不仁，如風(fēng)痹狀，黃芪桂枝五物湯主之。”其病機(jī)為氣血虛弱，腠理不固，外受風(fēng)寒，陽(yáng)氣受阻，血行不暢[5]。臨床研究表明，黃芪桂枝五物湯對(duì)于緩解TA的相關(guān)癥狀具備獨(dú)特效用[6]，但其作用機(jī)制暫不明確。本研究探討了黃芪桂枝五物湯治療TA的作用機(jī)制，為黃芪桂枝五物湯的應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 方劑靶點(diǎn) 用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)黃芪桂枝五物湯中組成進(jìn)行檢索，以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18為條件，獲得活性成分預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)，再利于UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得黃芪桂枝五物湯藥物基因集。

1.1.2 TA疾病靶點(diǎn) 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)搜索TA疾病相關(guān)靶點(diǎn)，得到疾病相關(guān)基因集。

1.2 方法

1.2.1 “藥物-成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò) 將1.1.1和1.1.2中數(shù)據(jù)導(dǎo)入CytoScape軟件，通過(guò)“藥物-成分-靶點(diǎn)”可視化展示。

1.2.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) STRING數(shù)據(jù)庫(kù)由交集基因?qū)?，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)并利用CytoScape軟件可視化展示。

1.2.3 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析 將交集基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(kù)行GO與KEGG富集分析，選取前20個(gè)條目使用微生信氣泡圖展示。

1.2.4 分子對(duì)接 以度中心性（degree centrality，DC）值排列，選取排名前4的活性成分和基因行分子對(duì)接，計(jì)算結(jié)合能；運(yùn)用AutoDockTools將兩者對(duì)接，利用PyMol軟件對(duì)結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 活性成分

黃芪桂枝五物湯共76個(gè)活性化學(xué)成分，部分見(jiàn)表1。

表1 黃芪桂枝五物湯活性藥物成分

2.2 交集基因

UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)由464個(gè)黃芪桂枝五物湯藥效靶點(diǎn)導(dǎo)入，得到160個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)基因，GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)搜索TA共726個(gè)靶點(diǎn)基因，運(yùn)用Venny取交集基因，得到44個(gè)黃芪桂枝五物湯治療TA的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 黃芪桂枝五物湯治療TA預(yù)測(cè)靶點(diǎn)圖

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

利用CytoScape軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)可視化，見(jiàn)圖2。根據(jù)DC值排序，排列較前為quercetin、kaempferol、beta-sitosterol等，數(shù)值各為208、69、59。證明上述為黃芪桂枝五物湯治療TA的主要活性成分，發(fā)揮著重要作用。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)

將交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。將STRING數(shù)據(jù)庫(kù)得到的文件導(dǎo)入CytoScape軟件，篩選核心蛋白，見(jiàn)圖4。白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白蛋白（albumin，ALB）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）等為篩選出的核心蛋白，在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI可視化

2.5 GO與KEGG富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集基因行富集分析，GO富集分析得到GO條目共402個(gè)，其中340個(gè)生物過(guò)程（biological process，BP）；28個(gè)細(xì)胞組分（cellular component，CC）；34個(gè)分子功能（molecular function，MF）。KEGG通路富集得出105條通路。利用P值排序，選取前20個(gè)條目運(yùn)用微生信工具以氣泡圖可視化，見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，黃芪桂枝五物湯對(duì)TA的治療主要涉及白介素-17（interleukin-17，IL-17）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號(hào)通路等，可能通過(guò)對(duì)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)節(jié)、脂多糖的反應(yīng)等發(fā)揮治療作用。

圖5 GO、KEGG富集分析圖

2.6 分子對(duì)接

選取排名前四的關(guān)鍵活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，見(jiàn)表2。表中關(guān)鍵活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)中結(jié)合能≤-5 kJ/mol占比93.8%，預(yù)測(cè)該活性成分與靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，證明黃芪桂枝五物湯關(guān)鍵活性成分可對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)的調(diào)控發(fā)揮作用。見(jiàn)圖6。

圖6 關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接可視化

表2 關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接的結(jié)合能

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門(mén)新興學(xué)科，是藥理學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物信息學(xué)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)綜合運(yùn)用的結(jié)果[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種新方法，通過(guò)了解中藥配伍多成分、多通路和治療多靶點(diǎn)[8]，能夠證明中藥對(duì)疾病的治療作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展始終與中醫(yī)藥研究息息相關(guān)[9]，并為中醫(yī)藥發(fā)展帶來(lái)新生機(jī)。

目前臨床對(duì)于TA的治療，主要以GC以及非GC類(lèi)免疫抑制劑等藥物及手術(shù)治療為主，但其存在耐藥及其他副作用，而新興的靶向治療仍缺乏足夠的證據(jù)支持[10]。不同的是，中醫(yī)講究整體和辨證施治，在治療TA上展現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如龐鶴教授[11]應(yīng)用黃芪桂枝五物湯治療周?chē)芗膊　?/p>

本研究表明槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、毛蕊異黃酮可能是黃芪桂枝五物湯治療TA的關(guān)鍵活性成分。槲皮素治療炎癥性疾病機(jī)制是通過(guò)抑制炎癥因子的生成和細(xì)胞基質(zhì)的降解，其抗炎作用是通過(guò)調(diào)控相關(guān)炎癥信號(hào)等通路[12]。山奈酚是一種黃酮醇，被證實(shí)屬天然抗炎化合物之一，在關(guān)節(jié)炎、癌癥、心血管疾病和其他疾病的發(fā)病過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用，并與降低炎癥相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[13]。β-谷甾醇可以通過(guò)降低血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的血管細(xì)胞黏附分子-1、細(xì)胞間黏附分子-1以及E-選擇素的表達(dá)水平，阻止炎性中性粒細(xì)胞的移行、浸潤(rùn)從而減輕細(xì)胞炎性反應(yīng)[14]。毛蕊異黃酮為一種異黃酮植物雌激素，是從中藥黃芪中提取的有效活性成分之一[15]。毛蕊異黃酮有促進(jìn)血管新生、抗氧化等作用，通過(guò)轉(zhuǎn)錄學(xué)和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法，發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮通過(guò)VEGF和FGF信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)其中Src，Raf，絲裂原活化蛋白激酶激酶1/2（protein kinase 1/2，MEK1/2）和磷脂酰肌醇3酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）起著不可代替的作用[16]。

IL-6調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、急性期和造血，并通過(guò)機(jī)體對(duì)感染的免疫反應(yīng)發(fā)揮重要作用；TNF具有抗感染、促進(jìn)機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)等重要作用；VEGFA的體外活性是促進(jìn)動(dòng)脈、靜脈和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。

KEGG通路富集結(jié)果主要有IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等，涉及脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)節(jié)等功能發(fā)揮治療作用。NF-κB在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用；IL-17是T細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的早期觸發(fā)因子，并通過(guò)促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的釋放來(lái)增強(qiáng)炎癥反應(yīng)；IL-17結(jié)合受體后，可通過(guò)MAP激酶途徑和NF-κB發(fā)揮生物效應(yīng)。所以黃芪桂枝五物湯治療TA的機(jī)制可能是通過(guò)減輕血管炎癥，疏通血管，恢復(fù)血流速度，也就是“溫經(jīng)益氣，和血通痹”的作用，充分闡明了中醫(yī)理論中“通則不痛”。

分子對(duì)接結(jié)果顯示結(jié)合能≤-5 kJ/mol占93.8%，證實(shí)了山奈酚、β-谷甾醇、槲皮素、毛蕊異黃酮在治療TA中的重要作用。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，闡述了黃芪桂枝五物湯對(duì)TA的治療是通過(guò)槲皮素 、山奈酚、β-谷甾醇、毛蕊異黃酮等成分作用于IL-6、TNF、ALB、VEGFA等基因靶點(diǎn)，從而影響“IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路”等通路發(fā)揮作用，為進(jìn)一步研究中藥治療TA提供參考。但此課題只對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步驗(yàn)證，由于數(shù)據(jù)庫(kù)收錄信息的不完整、相關(guān)數(shù)據(jù)更新滯后等因素影響，該研究存在一定的局限性，故開(kāi)展實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證應(yīng)是下一步研究的重點(diǎn)。