郝志慧 連 薇 代前龍 何 飛

大理大學基礎醫(yī)學院 云南省高校細胞生物學重點實驗室，云南大理 671000

乳腺癌是一類由于基因突變、激素紊亂等多種原因導致乳腺上皮細胞發(fā)生癌變的惡性腫瘤。三陰性乳腺癌作為乳腺癌的一種病理亞型，具有預后差、高侵襲性、高轉移性和高復發(fā)率的臨床特征。

澳洲茄堿是一種甾體生物堿，從天然草本植物龍葵中提取，具有廣泛的抗腫瘤、抗氧化和抗炎特性。研究證實澳洲茄堿具有治療糖尿病腎病足細胞損傷的潛力[1]，并可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/叉頭框轉錄因子3a（forkhead box 3a，FoxO3a）信號通路減輕七氟醚誘導的神經毒性[2]。國內外對于澳洲茄堿與腫瘤相關的研究表明，澳洲茄堿在胰腺癌[3]、肺腺癌[4]、膀胱癌[5]、急性單核細胞白血病[6]、肝細胞癌[7-8]、胃癌[9-10]、神經膠質瘤[11]的治療中有效。但目前尚未報道對于澳洲茄堿在乳腺癌特別是三陰性乳腺癌中的作用研究。

本研究旨在證實澳洲茄堿對三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞的生長抑制作用，并探索其作用機制。為臨床上三陰性乳腺癌的治療提供新的藥物應用方案，具有重要的應用參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

MDA-MB-468人乳腺癌細胞（CL-0290B）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；澳洲茄堿（SS8630）購自北京索萊寶科技有限公司，溶解于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），首次配制成10 mmol/L濃度，后續(xù)實驗依據所需藥物濃度進行稀釋。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和處理 MDA-MB-468人乳腺癌細胞用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法檢測澳洲茄堿對MDA-MB-468細胞活力的影響 將細胞以2000個/孔的濃度均勻種植到96孔板中過夜培養(yǎng)，分別用濃度為0、10、20、30、40、50 μmol/L的澳洲茄堿進行處理，另一對照組用0.3%DMSO處理，培養(yǎng)至24、48 h。加入CCK-8培養(yǎng)2 h后測定其450 nm處吸光度，分析不同處理時間和不同藥物濃度作用下的細胞增殖能力及細胞活力。細胞活力＝（A藥物-A空白）/（A對照-A空白）。A藥物：藥物處理組吸光度，A空白：空白組吸光度，A對照：對照組吸光度。

1.2.3 劃痕實驗觀察澳洲茄堿對三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞遷移能力的影響 將細胞以2×105個/孔的濃度均勻種植到6孔板中。用10 μl槍頭直線劃傷單層細胞，形成均勻劃痕。用上述不同濃度的澳洲茄堿處理，分別于24、48 h在顯微鏡下拍攝細胞發(fā)生運動遷移的情況，并用Image J測量兩邊緣細胞之間的距離。

1.2.4 克隆形成實驗檢測澳洲茄堿對三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞克隆形成能力的影響 將細胞以1000個細胞/孔的濃度接種于6孔板中。用不同濃度的澳洲茄堿分別處理24、48 h后換液，培養(yǎng)7 d（中間每2～3天換液）。用4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫染液染色。用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌細胞數次，晾干后于顯微鏡下拍照。

1.2.5 Western blotting檢測三陰性乳腺癌MDAMB-468細胞中磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路相關蛋白及P53蛋白的表達水平 分別用含藥物濃度0、40、50 μmol/L的培養(yǎng)基處理細胞，24 h后提取細胞總蛋白。使用10%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）凝膠進行蛋白電泳。應用超敏ECL化學發(fā)光試劑盒顯色。Image J分析各個條帶的灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（）表示，兩兩比較采用Graphpad Prism軟件進行t檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 澳洲茄堿對三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞活力的影響

CCK-8法檢測結果顯示，與對照組比較，不同濃度的澳洲茄堿均可抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞增殖、降低細胞活力，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05），且其抑制作用具有濃度依賴性，見圖1。

圖1 澳洲茄堿對三陰性乳腺癌MDAMB-468細胞活力的影響（，n=3）

2.2 澳洲茄堿對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-468運動遷移能力的影響

劃痕實驗結果顯示，與對照組比較，不同濃度的澳洲茄堿均可抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞遷移運動能力。其形態(tài)學結果觀察以及劃痕愈合率數據對比分析顯示，與對照組比較，澳洲茄堿40、50 μmol/L的處理組劃痕愈合率上具有顯著差異，見圖2。

圖2 澳洲茄堿對MDA-MB-468細胞遷移的影響（，n=3）

2.3 澳洲茄堿對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-468克隆形成能力的作用

對細胞克隆形成實驗顯微鏡下結果觀察可知：與對照組比較，不同濃度的澳洲茄堿均可減弱三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞的克隆形成能力。且高濃度處理組（40、50 μmol/L）具有顯著差異，見圖3。

圖3 澳洲茄堿對MDA-MB-468細胞克隆形成能力的影響

2.4 澳洲茄堿對三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞的PI3K-AKT信號通路相關蛋白表達量的影響

形態(tài)學實驗結果均提示高濃度（40、50 μmol/L）澳洲茄堿對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-468抑制作用顯著。Western blotting檢測結果顯示澳洲茄堿可下調PI3K-AKT通路相關蛋白PI3K、AKT的表達量（P< 0.05），見圖4。

圖4 澳洲茄堿對MDA-MB-468細胞中PI3K、AKT蛋白表達的影響（，n=3）

2.5 澳洲茄堿對三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞的P53抑癌基因蛋白表達量的影響

對細胞的藥物處理方法及蛋白提取流程同PI3K-AKT通路相關蛋白。結果顯示澳洲茄堿可以下調MDA-MB-468細胞P53蛋白的表達量（P< 0.05），見圖5。

圖5 澳洲茄堿對MDA-MB-468細胞中P53蛋白表達的影響（，n=3）

3 討論

澳洲茄堿是一類糖苷生物堿，近年來被應用于抗腫瘤的研究。研究發(fā)現，澳洲茄堿可引起胰腺癌細胞[3]和肺腺癌細胞[4]中的鐵死亡；可誘導細胞周期停滯影響膀胱癌細胞的活力[5]；可上調AMPK/FoxO3a通路抑制急性單核細胞白血病的體外和體內進展[6]；可通過miR-375-3p和lncRNA CCAT1之間的相互調控抑制肝細胞癌HepG2的生長[7]。目前關于澳洲茄堿對三陰性乳腺癌作用的研究未見報道，考慮到其廣泛的抗腫瘤作用，因此研究了其對三陰性乳腺癌的生長抑制作用及其相關作用機制。

PI3K-AKT信號通路在細胞代謝、細胞生長、細胞增殖、細胞凋亡和血管生成等基本細胞活動中起主要作用，并在多種腫瘤中存在異常激活。高聚偉等[12]基于網絡藥理學探討了澳洲茄堿的抗腫瘤機制，發(fā)現澳洲茄堿具有“多靶點-多通路”作用機制，參與多個生物學過程和信號通路，其中PI3K-AKT是其核心信號通路之一。基于該通路在細胞活動中的廣泛作用及其在腫瘤細胞中的重要影響，本研究首先應用不同濃度的澳洲茄堿處理MDA-MB-468細胞，分別對藥物處理24、48 h的細胞進行了CCK-8檢測、劃痕實驗和克隆形成實驗，后續(xù)應用Western blotting分子實驗對該通路相關蛋白表達量進行驗證。細胞實驗結果發(fā)現與對照組比較，澳洲茄堿可顯著降低MDA-MB-468細胞的增殖和運動遷移能力，抑制細胞的克隆形成能力。高濃度組（>40 μmol/L）較低濃度組（10 μmol/L）的抑制效果更加顯著，證實了澳洲茄堿的抑癌效果具有濃度依賴性。

在澳洲茄堿對于其他腫瘤的作用研究中，Liang等[3]的研究采用了50 μmol/L的澳洲茄堿，對兩種胰腺癌細胞系（PANC-1、CFPAC-1）進行了克隆形成實驗和Transwell，結果證實在該濃度下的澳洲茄堿能夠抑制細胞的克隆形成和遷移能力。Li等[9]研究應用同樣方法檢測了澳洲茄堿對SGC-7901胃癌細胞增殖的作用，發(fā)現澳洲茄堿以劑量依賴性方式顯著抑制了SGC-7901細胞的體外增殖。Zhang等[10]研究應用克隆形成實驗證實了澳洲茄堿可抑制胃癌細胞增殖并降低其克隆形成能力。Wang等[11]研究證實澳洲茄堿可以抑制神經膠質瘤細胞的遷移和克隆形成，抑制膠質瘤的生長。在乳腺癌中，PI3K突變和AKT激活將導致激素治療耐藥性[13]。Ma等[14]研究發(fā)現KAT7通過上調PI3KAKT信號通路促進乳腺癌的放射耐藥性。在中藥與腫瘤治療的研究中，郭利培等[15]研究發(fā)現中藥成分吳茱萸堿可能通過抑制PI3K-AKT信號通路活性來抑制鼻咽癌細胞增殖。劉楠等[16]研究驗證了紅花多糖能夠顯著降低MDA-MB-435細胞中PI3K、AKT蛋白的表達水平，有效抑制細胞生長和促進凋亡。本研究同樣驗證了澳洲茄堿對MDAMB-468細胞中PI3K-AKT通路的作用，結果顯示PI3K和AKT蛋白的表達量均受到顯著抑制。

P53是一種抑癌基因，Pham等[8]研究表明澳洲茄堿可通過P53依賴性途徑和P53非依賴性途徑誘導肝細胞癌HCC細胞系的凋亡。P53基因在乳腺癌中呈高表達，與乳腺癌患者病理分期、組織學分級等病理特征呈正相關。本研究結果顯示澳洲茄堿能夠顯著抑制P53蛋白的表達，且50 μmol/L處理組的抑制作用較40 μmol/L更加明顯，有劑量相關性。

綜上所述，本研究證實了澳洲茄堿能夠抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞的增殖、運動遷移和克隆形成能力，并初步驗證了澳洲茄堿抗三陰性乳腺癌的作用機制可能與抑制PI3K-AKT信號通路及降低P53蛋白的表達水平有關。在后續(xù)的研究中仍需進一步驗證：澳洲茄堿與PI3K-AKT通路抑制劑以及鉑類腫瘤化療藥物聯合應用是否能夠起到協同促進作用。從而在更少的藥物用量和更低的化療副作用下產生有效的抗癌效果，為將來澳洲茄堿可能應用于乳腺癌的臨床治療提供理論參考。