趙盈 田明

目前認為炎癥是癌癥的標志,在腫瘤發(fā)生的不同階段起著決定性作用,IL-33是IL-1細胞因子家族的成員,壞死細胞的被動釋放是細胞外IL-33出現(xiàn)的主要機制[1]。IL-33可能充當細胞受損或機械損傷后在細胞外釋放的警報信號,以提醒免疫系統(tǒng)細胞或組織受損[2]。研究顯示,IL-33通過促進固有淋巴樣2型細胞(ILC2)的活化和增殖及誘導Th2細胞的產(chǎn)生等機制加劇肝臟的纖維化,可導致腫瘤細胞增殖和炎性介質的產(chǎn)生,包括IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等釋放[3,4]。NF-κB蛋白復合物被認為是炎癥反應的主要調節(jié)劑,其長期或失控的激活是炎性疾病的標志,并且可以通過激活炎癥和增殖等相關基因來促進腫瘤發(fā)生[5]。本研究探討IL-33是否通過NF-κB信號通路介導肝癌細胞分泌驗證因子,從而影響肝癌細胞增殖和遷移。

材料與方法

一、主要試劑與器材

LO2、MHCC97H、LM3、HepG2、SMCC7721、Hep3B細胞株購自上海ATCC細胞庫,RPMI1640、DMEM、胰蛋白酶及胎牛血清購自美國Gibco公司,細胞培養(yǎng)瓶、板和皿均購自美國Corning公司,人重組IL-33購自美國PeproTech公司,NF-κB、p-NF-κB、IκB、p-IκB抗體及二抗購自美國Santa Cruze公司,IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18ELISA試劑盒購自美國R&D有限公司,EdU細胞增殖試劑盒購自上海碧云天生物有限公司,CCK8試劑盒購自日本Dongjun有限公司,反轉錄和擴增試劑盒購自日本TakaRa公司。熒光定量PCR(RT-PCR)引物由上海生工有限公司合成。多功能酶標儀購自德國Berthold Technologies公司,垂直電泳儀購自BioRad公司,PCR儀購自美國ABI公司。

二、細胞培養(yǎng)

將幾種細胞系分別培養(yǎng)于37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2細胞培養(yǎng)箱內,培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI1640及DMEM培養(yǎng)基,0.25%胰蛋白酶消化傳代,倒置光學顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)。

三、CCK8 法測定HepG2 細胞活力

取對數(shù)生長期HepG2 細胞,制備單細胞懸液,以5×104個/mL細胞接種于96 孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h 后加入IL-33(10 ng/mL),培養(yǎng)24 h及48 h后,每孔加入10 μL的CCK8溶液,4 h后終止培養(yǎng),酶標儀讀取450 nm下的吸光度(A)值,根據(jù)公式計算細胞活力。細胞活力*(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(未加藥)-A(空白)]×100。實驗重復3次。

四、EdU實驗觀察HepG2 細胞增殖

取對數(shù)生長期HepG2細胞,制備單細胞懸液,以5×104個/mL 的細胞接種于96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h后加入IL-33(10 ng/mL),培養(yǎng)24 h后,按照EdU試劑盒說明書進行檢測,每組設置5個復孔。

五、RT-PCR檢測不同肝癌細胞中IL-33的表達

收集IL-33處理24 h組與對照組的HepG2 細胞,按試劑盒說明書提取總mRNA,再根據(jù)試劑盒說明書進行逆轉錄和擴增。GAPDH 上游引物:5′-GTTCGACAGTCAGCCGCATC-3′,下游引物:5′-GGAATTTGCCATGGGTGGA-3′;IL-33上游引物:5′-TTATGAAGCTCCGCTCTGGC-3′,下游引物:5′-CCAAAGGCAAAGCACTCCAC-3′,結果以2-ΔΔCT表示。

六、蛋白質印跡檢測IL-33對HepG2 細胞NF-κB信號通路的影響

收集IL-33處理24 h組與對照組的HepG2 細胞提取蛋白,經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,按照恒流電流350 mA轉移至PVDF 膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后,加1∶1 000稀釋的NF-κB、p-NF-κB、IκB、p-IκB一抗4℃孵育過夜,封閉液漂洗后加入1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育2 h,漂洗后ECL檢測,曝光、顯影。采用圖像分析系統(tǒng)檢測各條帶的吸光度,以目的條帶與內參吸光度的比值作為相對表達量。實驗重復3次。

七、Transwell小室和劃痕實驗檢測IL-33對HepG2 細胞遷移的影響

培養(yǎng)HepG2細胞,長至50%～60%,IL-33處理繼續(xù)培養(yǎng)24 h;用胰酶消化細胞,將混懸有細胞的培養(yǎng)基種入上小室內,下小室加入含10%血清的培養(yǎng)基,繼續(xù)在孵育箱中培養(yǎng)24 h。吸去每個小室內培養(yǎng)液,加4%多聚甲醛固定10 min(液體覆蓋底部)。每個小室加入雙蒸水洗滌2 min,換新鮮雙蒸水再次洗滌2 min。按5×結晶紫染色液∶稀釋液=1∶4配制結晶紫溶液,吸去洗滌液,加入結晶紫染色10 min(可根據(jù)染色結果和要求調整時間),蒸餾水洗滌充分(不要擦去小室底部細胞),顯微鏡下觀察細胞遷移情況、拍照。

培養(yǎng)HepG2細胞于六孔板內,長至50%～60%,用槍頭垂直于小孔劃一道線,光學顯微鏡下觀察0 h時劃痕情況,顯微鏡下拍照。IL-33處理繼續(xù)培養(yǎng)觀察24 h后劃痕情況,顯微鏡下拍照。

八、統(tǒng)計學分析

結 果

一、不同肝癌細胞中IL-33 mRNA相對表達情況

IL-33 mRNA相對表達情況分別為LO2(1.01±0.01)、MHCC97H(1.08±0.05)、LM3(1.76±0.21)、HepG2(3.88±0.35)、SMCC7721(2.24±0.43)和Hep3B(2.13±0.30),差異有統(tǒng)計學意義(F=19.621,P=0.001)。

二、HepG2細胞中NF-κB、p-NF-κB、IKB、p-IKB的蛋白相對表達情況

IL-33處理24 h組中NF-κB磷酸化蛋白及IKB磷酸化蛋白相對表達水平均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 HepG2細胞中NF-κB、p-NF-κB、IKB、p-IKB的蛋白相對表達情況(±s)

三、HepG2細胞中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18因子情況對比

IL-33處理24 h組中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18因子水平高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 HepG2細胞中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18表達情況對比(±s)

四、HepG2細胞增殖及活力情況對比

IL-33處理24 h組細胞增殖為(1.41±0.08)、24 h細胞活力為(135.69±6.88)%、48 h細胞活力為(176.34±25.69)%,均高于對照組的(0.86±0.04)、(98.65±1.05)%、(119.89±10.86)%,差異有統(tǒng)計學意義(t=13.750、9.218、3.506,P=0.017)。

五、HepG2細胞侵襲和遷移情況對比

Transwell小室和劃痕實驗結果發(fā)現(xiàn),IL-33處理24 h組細胞侵襲數(shù)量(256.38±10.11)個、遷移相對距離(0.74±0.05),高于對照組的(185.63±23.54)個、(0.45±0.12),差異有統(tǒng)計學意義(t=4.783,P=0.005;t=3.864,P=0.012)。

討 論

腫瘤微環(huán)境浸潤的炎性免疫細胞為腫瘤細胞提供了有利的炎性微環(huán)境,促進腫瘤細胞的血管生成、轉移侵襲[6-8]。IL-33是IL-1細胞因子家族的成員,是IL-1受體家族的抑制致瘤性2(ST2)受體的唯一配體[9]。IL-33合成后,胞質IL-33易位至細胞核,與染色質結合,IL-33的N末端結構域包含一個核定位序列和一個染色質結合結構域,是其核易位的關鍵[10]。IL-33 通過其ST2激活PLD/SPHK-NF-κB 和MAPK-ERK/P38/JNK 等信號通路誘導了多種炎癥性疾病的病理過程,引發(fā)TH2型免疫應答,刺激TH2型細胞因子的分泌,參與了過敏性疾病、組織損傷修復、炎癥及腫瘤等多種疾病生理過程。NF-κB是存在于細胞內的一種重要核轉錄因子,具有調節(jié)炎癥、胚胎發(fā)育、組織損傷和修復等生物行為相關基因表達的功能。研究表明,NF-κB是一大家族,由NF-κB 1 (P50及其前體P105)、NF-κB 2(P52及其前體P100)、P65(Rel A)、Rel B和c-Rel組成[6]。正常情況下,NF-κB在細胞內是以非活性的三聚體狀態(tài)存在,三聚體由NF-κB兩成員單體、抑制因子IKB(分為IKB和IKBβ兩個亞單體)結合而成。在細胞因子、內毒素或活性氧簇等因素刺激下,IKK(IKB激酶)就會磷酸化IKB的絲氨酸殘基(特殊位點上),后者被泛素化并被26S的蛋白酶體降解[11]。IKB一旦被降解,不再受限制的NF-κB就獲得活性移位至細胞核內,結合到相應的DNA序列,進而啟動靶基因的轉錄。而NF-κB信號傳導的激活,將進一步增強局部炎癥的發(fā)生[12]。

IL-33已被證明是急慢性肝衰竭、肝硬化以及慢性乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染的誘導因子[13]。但是,尚不清楚釋放的IL-33在HCC發(fā)展中的功能。研究中IL-33 mRNA在幾種肝癌細胞中均高表達(LM3、HepG2、SMCC7721和Hep3B),使用外源性IL-33細胞因子處理肝癌細胞HepG2,發(fā)現(xiàn)IL-33誘導HepG2細胞中NF-κB信號傳導的激活,促進HepG2細胞中炎癥因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18)釋放,促進肝癌細胞增殖和遷移。

綜上所述,IL-33可以促進肝癌細胞的增殖和遷移,同時影響細胞的炎癥水平并激活NF-κB 信號通路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。