杜玉玲，張 穎，盧世豪，葛 東，祖長清，趙達(dá)卓*

1.延邊朝鮮族自治州動物疫病預(yù)防控制中心，吉林延吉 133000；2.琿春市動物疫病預(yù)防控制中心，吉林琿春 133300；3.敦化市官地鎮(zhèn)綜合服務(wù)中心，吉林敦化 133700

口蹄疫（FAM）是一種由口蹄疫病毒引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病。主要影響偶蹄類動物，如牛、羊、豬等。口蹄疫會導(dǎo)致患病動物的生產(chǎn)性能下降，不僅對養(yǎng)殖業(yè)造成重大威脅，還會嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展。

口蹄疫作為一種嚴(yán)重危害牲畜健康的疫病，一旦發(fā)生將給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失。為了有效應(yīng)對口蹄疫的流行和控制，口蹄免疫抗體檢測成為一種非常重要的手段。尤其是在2017 年吉林省全面建成免疫無口蹄疫區(qū)，各地區(qū)易感動物的免疫質(zhì)量是保證免疫無口蹄疫區(qū)正常運行的關(guān)鍵，也是免疫無口蹄疫區(qū)的一個重要指標(biāo)，而免疫質(zhì)量的評價主要依賴于實驗室免疫抗體檢測評價，由口蹄疫參考實驗室生產(chǎn)的液相阻斷免疫吸附試驗診斷試劑盒成為實驗室檢測口蹄疫免疫抗體的主要方法和試劑，同時該診斷方法為了減少實驗時間，在傳統(tǒng)方法上進(jìn)行了改良，為了檢驗兩種試劑盒在實際檢測工作中的效果和差別，指導(dǎo)現(xiàn)地充分利用好人力和物力資源，做好免疫無口蹄疫區(qū)工作，通過春秋兩季對延邊州8 個縣（市）采取分層抽樣策略，各層中分別進(jìn)行簡單隨機抽樣概率，對免疫過口蹄疫O型、A 型二價疫苗21 d 后的共計320 份牛血清，進(jìn)行O 型、A 型免疫抗體檢測，在成本、準(zhǔn)確性和操作難易度等方面對比分析傳統(tǒng)型和改進(jìn)型檢測盒的性能，致力于為獸醫(yī)工作者提供準(zhǔn)確、可靠、更加適用于基層的免疫抗體檢測盒，以進(jìn)一步提高口蹄疫的防控效果。

1 材料與方法

1.1 免疫疫苗

強制免疫口蹄疫二價滅活苗。

1.2 血清樣品

延邊州8 個縣（市）320 頭免疫過牛口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗21 d 以上的牛血清。

1.3 檢測試劑盒

口蹄疫O 型、A 型抗體液相阻斷ELISA 檢測（改進(jìn)型）試劑盒（FAM-O-ELISA 改進(jìn)型、FAM-A--ELISA 改進(jìn)型），口蹄疫O 型、A 型抗體液相阻斷ELISA 檢測（傳統(tǒng)型）試劑盒（FAM-O-ELISA 傳統(tǒng)型、FAM-A-ELISA 傳統(tǒng)型）。

1.4 檢測步驟

對于采集的320 份牛血液樣本在4 ℃條件下，2 000 轉(zhuǎn)/min，離心5 min 后取上清液，按檢測盒使用說明操作（見表1）。

表1 檢測步驟與時間

1.5 結(jié)果判定

根據(jù)試劑盒的判斷標(biāo)準(zhǔn)實驗結(jié)果符合成立條件后，計算臨界值，即OD 值450 nm 計算病毒抗原阻斷1/2 的值。被檢樣品的檢測OD 值大于臨界值，該樣本抗體為陰性；被檢樣品檢測OD 值小于等于臨界值，該樣本抗體為陽性。梯度稀釋被檢樣本中，陽性孔的最高稀釋倍數(shù)即為該被檢樣本的抗體效價。牛的抗體效價≥1:128，99%以上保護。

2 結(jié)果

2.1 檢測步驟與時間

由表1 可見，F(xiàn)AM -液相阻斷- ELISA 傳統(tǒng)型檢測盒操作步驟有六步，需要移板一次，需要包被過夜，洗板三次，僅固定等待時間（操作時間不計）耗時225 min。FAM -液相阻斷- ELISA 改進(jìn)型檢測盒操作步驟為四步，直接在反應(yīng)板上稀釋，不需要移板，不需要過夜，洗板兩次，固定時間75 min。相比較之下，F(xiàn)AM -液相阻斷- ELISA 傳統(tǒng)型檢測盒操作步驟多，繁瑣，耗時長，F(xiàn)AM -液相阻斷-ELISA 改進(jìn)型檢測盒操作步驟相對簡單、方便，所需檢測時間更短，僅為FAM -液相阻斷- ELISA 傳統(tǒng)型檢測盒操作時間的1/3 左右。

2.2 檢測抗體合格率

使用FAM -液相阻斷- ELISA 傳統(tǒng)型檢測盒檢測O 型、A 型口蹄疫抗體合格率分別為84.3%、80%；使用FAM -液相阻斷- ELISA 改進(jìn)型檢測盒檢測O型、A型口蹄疫抗體合格率分別為76%、74.3%（見表2）。傳統(tǒng)型檢測盒抗體陽性率高于改進(jìn)型檢測盒，敏感性更高。

表2 改進(jìn)型和傳統(tǒng)型檢測盒檢測抗體合格率統(tǒng)計表

2.3 改進(jìn)型和傳統(tǒng)型檢測盒符合率

使用FAM-液相阻斷- ELISA 傳統(tǒng)型檢測盒檢測O 型、A 型的合格樣本中各有6 份、18 份樣本為FAM-液相阻斷- ELISA 改進(jìn)型檢測盒的不合格樣品，兩者檢測結(jié)果相差較大，符合率達(dá)90%和94.38%,見表3。

表3 改進(jìn)型和傳統(tǒng)型檢測盒檢測符合率

3 討論

3.1 檢測結(jié)果分析

兩種檢測試劑檢測到的標(biāo)準(zhǔn)均能達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)，但FAM -液相阻斷- ELISA 改進(jìn)型檢測盒檢測結(jié)果滿足不了免疫無口蹄疫區(qū)保護率達(dá)到80%的要求，在免疫無疫區(qū)評定上存在明顯差異。

從表1 可以看出FAM -液相阻斷- ELISA 傳統(tǒng)型檢測盒檢測O 型、A 型抗體陽性率均高于FAM -液相阻斷- ELISA 改進(jìn)型檢測盒，說明口蹄疫液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒敏感性更高。

從表2 可以看出FAM -液相阻斷- ELISA 傳統(tǒng)型檢測盒O 型、A 型抗體和FAM-液相阻斷- ELISA改進(jìn)檢測盒符合率均在90%以上。

3.2 試劑性能討論

FAM -液相阻斷-ELISA 改進(jìn)型實驗比FAM -液相阻斷 -ELISA 傳統(tǒng)型實驗的操作步驟少，實驗用時少，更節(jié)省時間，兩種口蹄疫抗體檢測試劑盒各有優(yōu)缺點。FAM -液相阻斷- ELISA 傳統(tǒng)型實驗檢測方法具有特異性強、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點，相對于改進(jìn)型存在操作步驟繁瑣，耗時長的缺點。而改進(jìn)型檢測試劑盒具有操作簡便、用時短、成本低等優(yōu)點，但也存在與傳統(tǒng)型敏感性低的不足。為此在實際工作中，要根據(jù)試驗需求等實際情況進(jìn)行選擇，避免因為檢測試劑選擇造成的工作失誤和增加不必要物資與勞動力的浪費。

在兩種試劑檢測操作中，人員、儀器、耗材、環(huán)境均為統(tǒng)一，最大可能地減少了外界因素造成的誤差，存在的弊端本次實驗僅對牛的口蹄疫免疫效果進(jìn)行了比較，沒有全面覆蓋易感動物。同時春秋兩季延邊地區(qū)牛的飼養(yǎng)方式有所不同，可能造成免疫牛只的機體免疫應(yīng)答敏感性不同，但該項對實際檢測結(jié)果的判定不存在干擾性。