黃志云 孫維廣* 黎爾納 萬(wàn)安鳳 鄒宇曉 高建勝

1.廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司，廣東 廣州 510288；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610

中藥渣是中藥提取后的固體廢棄物，隨著中藥產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，中藥渣的排放量也日益上升，據(jù)統(tǒng)計(jì)，中藥渣的年排放量可達(dá)3000萬(wàn)噸。在生產(chǎn)中該類廢棄物往往直接排放，造成資源浪費(fèi)的同時(shí)，對(duì)生態(tài)環(huán)境有較大的破壞[1-3]。

夏桑菊顆粒源自清代著名溫病學(xué)家吳鞠通《溫病條辨》的經(jīng)典名方“桑菊飲”，主要由夏枯草、桑葉和野菊花配伍而成。現(xiàn)代研究表明夏枯草含有三萜類、多糖類、黃酮類、甾體類與有機(jī)酸類化合物等成分，具有降血糖、降血壓、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、抗炎抗菌及抗病毒等藥理作用[4]。桑葉中含酚類及黃酮類、生物堿類、氨基酸、多糖和甾類化合物，具有降血糖、抗炎、抗菌、抗病毒、抗衰老及抗癌等生物活性[5]。野菊花含有揮發(fā)油、黃酮類、多糖類、有機(jī)酸類、氨基酸以及微量元素等化學(xué)成分，有抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤活性、抗氧化等生理活性[6]。由組方及其生理活性可知，夏桑菊藥渣在某意義來(lái)說(shuō)也是一種“中藥抗生素”。

夏桑菊顆粒生產(chǎn)時(shí)，為了保證產(chǎn)品質(zhì)量均一穩(wěn)定，需要“水提”物質(zhì)進(jìn)行“醇沉”處理，醇沉后的上清液作為生產(chǎn)原料，醇沉物為廢棄物，但廢棄物中卻含有豐富的多糖、多酚和黃酮類物質(zhì)等成分。我司每年產(chǎn)生約幾千噸夏桑菊藥渣，傳統(tǒng)的填埋處理方式經(jīng)濟(jì)價(jià)值低，而且造成藥效成分浪費(fèi)。本文擬采用生產(chǎn)夏桑菊顆粒過(guò)程中的“水提醇沉”物為原料，經(jīng)生物酶解處理后獲得夏桑菊低聚糖，考察其對(duì)益生菌的增殖作用，并優(yōu)化酶解工藝，為未來(lái)將夏桑菊藥渣開發(fā)成高價(jià)值的“減抗替抗”動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)制劑提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 THZ-D型臺(tái)式恒溫振蕩器(江蘇省太倉(cāng)市華美生化儀器廠)；HWS26型電熱恒溫水浴鍋、DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.2 材料 夏桑菊醇沉渣由廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司提供，利用苯酚-硫酸法檢測(cè)其多糖濃度約為80 mg/mL。果膠酶(1000 U/mg)、纖維素酶(400 U/mg)、半纖維素酶(2 U/mg)、淀粉酶(4 U/mg)、葡聚糖酶(50 U/mg)、木聚糖酶(6000 U/mg)、甘露聚糖酶(50 U/mg)、糖化酶(100 U/mg)購(gòu)于廣州市齊云生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

植物乳桿菌 (Lactobacillusplantarum，GIM1.191)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides，GIM1.774)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei，GIM1.411)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，ATCC53103)、青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis，ATCC15703)保藏于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所蠶桑南藥與微生物資源加工利用研究室。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖濃度的測(cè)定 稱取干燥至恒重的葡萄糖500 mg，取少量蒸餾水溶解，并定容到500 mL，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用苯酚-硫酸比色法，分別吸取 0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容到25 mL，得到不同濃度的葡萄糖稀釋液，分別取1.00 mL稀釋液于10 mL試管中，各加入質(zhì)量濃度為5%的苯酚溶液1 mL，再迅速加入濃硫酸5 mL，充分震蕩搖勻，室溫靜置冷卻30 min，在490 nm下測(cè)吸光值。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取適當(dāng)稀釋的夏桑菊多糖溶液 1 mL 于 10 mL 試管中，以1 mL蒸餾水作為空白對(duì)照，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作進(jìn)行顯色，于490 nm處測(cè)定吸光值，并計(jì)算多糖含量。結(jié)果顯示，本試驗(yàn)所用夏桑菊醇沉渣中多糖濃度為80 mg/mL。

2.2 不同生物酶酶解制備的夏桑菊低聚糖促益生菌生長(zhǎng)活性的測(cè)定 夏桑菊低聚糖制備：往夏桑菊醇沉渣中分別添加8種生物酶(果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、糖化酶)，使其酶活力達(dá)到1000 U/mL，50 ℃酶解3 h，得到生物酶解制備的夏桑菊低聚糖，滅酶(沸水浴10 min)后121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻后于4 ℃儲(chǔ)存待用。

夏桑菊低聚糖促益生菌生長(zhǎng)活性的測(cè)定：分別將夏桑菊低聚糖和商品化益生元(IMO、GOS)添加到MRS液體培養(yǎng)基，使其質(zhì)量終濃度達(dá)到10 mg/mL。向培養(yǎng)基中接種1%過(guò)夜培養(yǎng)的益生菌菌液，37℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按下公式計(jì)算增殖率。

益生菌增殖率=低聚糖與益生菌菌共培養(yǎng)后菌落數(shù)/空白對(duì)照組菌落數(shù)×100%

結(jié)果顯示，不同生物酶對(duì)多糖的降解效果不同。圖1-A中，利用半纖維素酶制備的夏桑菊低聚糖對(duì)植物乳桿菌的促增殖效果最好，增殖率為(156±9.8)%，其次為果膠酶，增殖率為(141±12.3)%，兩組與陰性對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.05)。圖1-B中，利用木聚糖酶制備的夏桑菊低聚糖對(duì)腸膜明串珠菌的促增殖效果最好，增殖率為(168±13.8)%，其次為葡聚糖酶，增殖率為(153±14.3)%，兩組與陰性對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.05)。圖1-C中，利用葡聚糖酶制備的夏桑菊低聚糖對(duì)干酪乳桿菌的促增殖效果最好，增殖率為(213±17.3)%，其次為果膠酶，增殖率為(189±15.7)%，兩組與陰性對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.05)。圖1-D中，利用葡聚糖酶制備的夏桑菊低聚糖對(duì)鼠李糖乳桿菌的促增殖效果最好，增殖率為(265±14.5)%，其次為半纖維素酶，增殖率為(226±27.3)%，兩組與陰性對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.05)；優(yōu)于未酶解的夏桑菊多糖(151±4.2)%和商品化益生元低聚異麥芽糖(173±8.3)%、低聚半乳糖(182±9.2)%。圖1-E中，利用葡聚糖酶制備的夏桑菊低聚糖對(duì)青春雙歧桿菌的促增殖效果最好，增殖率為(176±15.3)%；其次為果膠酶，增殖率為(169±14.3)%，兩組與陰性對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.05)。

注：柱形圖中相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

綜上，8種不同酶酶解制備的夏桑菊低聚糖對(duì)5種益生菌都具有較好的促增殖作用，其中利用葡聚糖酶制備的夏桑菊低聚糖對(duì)鼠李糖乳桿菌的增殖效果最好，后續(xù)將以此菌為增殖效果為指標(biāo)，優(yōu)化葡聚糖酶生物酶解夏桑菊低聚糖工藝參數(shù)。

2.3 夏桑菊低聚糖濃度對(duì)其促鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)活性的影響 將夏桑菊低聚糖添加到MRS液體培養(yǎng)基中，使其質(zhì)量終濃度分別達(dá)到40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL。向培養(yǎng)基中接種1%過(guò)夜培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌菌液，37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)算增殖率。結(jié)果顯示，低聚糖質(zhì)量終濃度在2.5～40 mg/mL范圍內(nèi)，鼠李糖乳桿菌的增殖率隨濃度的增大呈先上升后平緩下降的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量終濃度為 10 mg/mL 時(shí)增殖率達(dá)到最大值(273±16.4)%，如圖2。

圖2 夏桑菊低聚糖濃度對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率的影響圖

2.4 夏桑菊低聚糖生物酶解制備工藝的單因素優(yōu)化 以鼠李糖乳桿菌增殖率為指標(biāo)，添加低聚糖質(zhì)量終濃度為10 mg/mL，選擇不同酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間，研究其對(duì)夏桑菊低聚糖酶解工藝的影響。實(shí)驗(yàn)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 生物酶解工藝參數(shù)

2.4.1 不同酶添加量制備的夏桑菊低聚糖對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率的影響 如圖3所示，葡聚糖酶添加量在500～2500 U/mL時(shí)制備的夏桑菊低聚糖，鼠李糖乳桿菌的增殖率呈先增后減的趨勢(shì)。酶添加量為1500 U/mL時(shí)，鼠李糖乳桿菌的增殖率達(dá)到了(320±17.2)%，而酶添加量大于 1500 U/mL 時(shí)，增殖率開始逐漸降低。

圖4 酶解溫度對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率的影響

圖5 不同酶解時(shí)間對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率的影響

2.4.2 不同酶解溫度制備的夏桑菊低聚糖對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率的影響 葡聚糖酶添加量 1500 U/mL，夏桑菊低聚糖對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖隨著溫度變化先增后降，酶解溫度50 ℃時(shí)增殖率最高，為(329±15.6)%。

2.4.3 不同酶解時(shí)間制備的夏桑菊低聚糖對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率的影響 酶解時(shí)間為2～6 h，增殖率先直線上升后慢速下降，并在4 h時(shí)達(dá)到最高值(364±16.4)%。綜上，從益生活性考慮，選取葡聚糖酶添加量1500 U/mL、酶解溫度50 ℃和酶解時(shí)間4 h為較優(yōu)酶解方案。

3 討論

生物酶解法在中藥提取中有廣泛應(yīng)用[7-10]。其原理為：通過(guò)選用一些恰當(dāng)?shù)拿割惻c藥用植物細(xì)胞使細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中的纖維素、半纖維素、果膠等物質(zhì)降解破壞細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生局部疏松、膨脹、崩潰等變化，減小細(xì)胞壁、細(xì)胞間質(zhì)等傳質(zhì)屏障對(duì)有效成分從胞內(nèi)向提取介質(zhì)擴(kuò)散的傳質(zhì)阻力，從傳質(zhì)角度促使有效成分提取率提高[11]。

在考察夏桑菊低聚糖濃度對(duì)其促鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)活性的影響試驗(yàn)中，當(dāng)?shù)途厶琴|(zhì)量終濃度在2.5～40 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，鼠李糖乳桿菌的增殖率隨濃度的增大呈先上升后平緩下降的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量終濃度為10 mg/mL時(shí)增殖率達(dá)到最大值，質(zhì)量終濃度繼續(xù)增大時(shí)，增殖率隨濃度增大而降低，可能是因?yàn)闈舛冗^(guò)高，從而導(dǎo)致滲透壓過(guò)高，細(xì)胞破裂，增殖率降低。

在考察不同酶添加量制備的夏桑菊低聚糖對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率的影響試驗(yàn)中，葡聚糖酶添加量在500～2500 U/mL時(shí)制備的夏桑菊低聚糖，鼠李糖乳桿菌的增殖率呈先增后減的趨勢(shì)。酶添加量為1500 U/mL時(shí)，鼠李糖乳桿菌的增殖率達(dá)到最大值，而酶添加量大于1500 U/mL時(shí)，增殖率開始逐漸降低。這可能是因?yàn)榈途厶堑慕Y(jié)構(gòu)影響其活性作用的發(fā)揮，具有一定分子量的低聚糖才具有促生長(zhǎng)活性，過(guò)度酶解的低聚糖小片段，其促增殖活性不佳[12]。

在考察不同酶解溫度制備的夏桑菊低聚糖對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率的影響的試驗(yàn)中，酶解溫度在30～70 ℃時(shí)制備的夏桑菊低聚糖，鼠李糖乳桿菌增殖率呈先增后減趨勢(shì)，溫度50℃時(shí)增殖率最大。因?yàn)槊傅幕钚耘c反應(yīng)溫度有關(guān)，且存在最適溫度。制備的低聚糖對(duì)鼠李糖乳桿菌的促生長(zhǎng)作用并不是隨著酶解溫度的升高而呈直線上升趨勢(shì)，而是在適宜溫度值時(shí)鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)活性存在較優(yōu)值。

在考察不同酶解時(shí)間制備的夏桑菊低聚糖對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖率的影響試驗(yàn)中，酶解時(shí)間為 2～6 h，增殖率先直線上升后慢速下降，并在4 h時(shí)達(dá)到最高值(364±16.4)%，這種情況可能是，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，葡聚糖酶與糖鏈作用的機(jī)會(huì)更完全，產(chǎn)生更多的活性低聚糖，促進(jìn)鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)繁殖；隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物的組成發(fā)生改變，不利于鼠李糖乳桿菌的增殖。

實(shí)驗(yàn)中，8種不同生物酶酶解制備的夏桑菊低聚糖對(duì)5種益生菌都具有較好的促增殖作用，其中利用葡聚糖酶制備的夏桑菊低聚糖對(duì)鼠李糖乳桿菌的增殖效果最好；從益生活性考慮，選取葡聚糖酶添加量1500 U/mL、酶解溫度50 ℃和酶解時(shí)間4 h為較優(yōu)酶解方案。綜上，研究提供的技術(shù)方案可為未來(lái)夏桑菊藥渣的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。