徐美余, 張 瑤, 鄧征宇, 何 秀, 羅成瑩, 鄧先余, 林連兵*, 王 峰*

(1.昆明理工大學 生命科學與技術學院, 云南 昆明 650500; 2.云南省高校飼用抗生素替代技術工程研究中心, 云南 昆明 650500)

志賀氏菌(Shigella)屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的志賀氏菌屬(Shigella),革蘭染色陰性,為人類傳播細菌性痢疾中最普遍的食源性病原菌,嚴重危害人類健康。受衛(wèi)生條件限制,志賀氏菌病主要發(fā)生在發(fā)展中國家,Jain等[1]和Shang等[2]研究發(fā)現(xiàn),急性腸胃炎和腹瀉樣本中志賀氏菌的檢出率高達4.2%。研究表明主要由志賀氏菌引起的重癥潰瘍性結(jié)腸炎表現(xiàn)為嚴重的菌群失調(diào)。志賀氏菌食物中毒是指由志賀氏菌所致的細菌性食物中毒,志賀氏菌侵襲人類腸道黏膜組織并釋放大量內(nèi)毒素引起癥狀,可導致腸道感染引起人尤其是幼兒腹瀉,潛伏期一般10～14 h,其毒力主要依賴于Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的效應因子[3]。志賀氏菌引起的腹瀉是一種主要的公共衛(wèi)生威脅,可通過糞口傳播于人與人之間,感染的高發(fā)率主要發(fā)生在5歲以下兒童,且志賀氏菌對抗生素已產(chǎn)生較強耐藥性,尤其是對阿莫西林和四環(huán)素耐藥性極高[4-5]。噬菌體(Bacteriophage或Phage)是種類極其豐富的一類細菌病毒,噬菌體通常在充滿細菌群落的地方廣泛分布,感染力強,常以指數(shù)數(shù)量級增殖[6]。在形態(tài)上可分為絲狀噬菌體、有尾和無尾的二十面體噬菌體和有脂質(zhì)包膜的噬菌體[7]。噬菌體具有明顯的宿主特異性,相對容易分離,并可進行遺傳修飾。噬菌體是細菌的天然捕食者,裂解性噬菌體感染后可殺滅宿主菌。研究表明,利用噬菌體制備抗菌劑,可安全高效治療耐藥性細菌感染,例如,Alvi等[8]發(fā)現(xiàn)噬菌體對感染多重耐藥銅綠假單胞菌的小鼠有治療效果。其還可用于治療小牛腹瀉以及嚴重的兒童痢疾,能取得良好效果且具有很好的安全性[9-10]。另外,研究顯示,噬菌體可替代抗生素應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中[11]。上述研究表明,噬菌體在農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)中具有良好的應用前景。自上世紀四十年代在臨床實踐中引入抗生素以來,抗生素在防治人類和動物細菌感染疾病中發(fā)揮著重要作用[12]。但近年來由于抗生素的使用不規(guī)范,各種耐藥菌株,如泛耐藥性“超級細菌”在全球不斷出現(xiàn),對全球公共衛(wèi)生和國民健康造成嚴重威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織預測,如果沒有新的抗菌劑被發(fā)現(xiàn),到2050年人類將會回到青霉素之前的時代。因此,探索新的抗生素替代品,研發(fā)抗生素替代技術迫在眉睫[13]。作為可侵襲、裂解細菌的天然武器,對于抗生素耐藥細菌導致的感染,基于噬菌體的治療策略是一個很好的選擇。本研究從廣西富鳳雞場病雞腸道黏膜中分離出26株志賀氏菌。以其中的多重耐藥性志賀氏菌BS26作為宿主菌,分離純化得到一株新型的裂解性噬菌體PSF26,并研究其生物學特性,以期為耐藥性志賀氏菌的噬菌體治療及飼用抗生素替代實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 實驗肉雞源自廣西富鳳雞場,黏膜取自病雞腸道、糞便取自健康肉雞。宋內(nèi)志賀氏菌(Shigellasonnei)CMCC(B)51592、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)CMCC(B)51105、大腸埃希菌(Escherichiacoli)CMCC(B)44102、福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)CMCC(B)51572、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853和BNCC139675、大腸埃希菌(Escherichiacoli)O157、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)CMCC(B)50335、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)1606BL1486、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)CMCC(B)63501、無乳鏈球菌(Streptococcusmastitidis)SAM12和沙門氏菌(Salmonella)CMCC(B)50094均為昆明理工大學生命科學與技術學院噬菌體與腸道微生物課題組保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基:NaCl 10 g,蛋白胨10 g,酵母粉5 g,去離子水1 000 mL;LB半固體培養(yǎng)基:在LB液體培養(yǎng)基基礎上加7.5 g/L瓊脂;LB固體培養(yǎng)基:在LB液體培養(yǎng)基基礎上加15 g/L瓊脂;PBS緩沖液:A液為NaH2PO431.2 g,1 000 mL容量瓶定容,B液為Na2HPO471.63 g,1 000 mL容量瓶定容;取A液28 mL、B液72 mL混合,加入100 mL去離子水稀釋,用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7.4;SM緩沖液:NaCl 5.8 g,MgSO42.0 g,1 mol/L Tris-HCl (pH 7.5) 50 mL,2%明膠5 mL,加去離子水至1 000 mL。

1.1.3 主要試劑與儀器設備 細菌基因組提取試劑盒(DP201101X),天根生化科技(北京)有限公司;志賀氏菌選擇瓊脂培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;細菌通用引物27F和1492R;2×TaqMaster Mix緩沖液;磷鎢酸;0.22 μm濾膜(天津市津騰實驗設備有限公司);DNase I、RNase A(上海翊圣生物科技有限公司);空白藥敏紙片(直徑6.0 mm,厚度1.0 mm);PEG8000(Bio Froxx公司)。高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F160A,上海一恒科學儀器有限公司);恒溫培養(yǎng)搖床(THZ-100, 上海一恒科學儀器有限公司);高速冷凍離心機(TGL-23,四川蜀科儀器有限公司);透射電子顯微鏡(JEM-1400,上海鑄金分析儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 志賀氏菌的分離鑒定 在超凈工作臺刮取病雞腸道黏膜溶于無菌水,梯度稀釋至10-5,取100 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃倒置培養(yǎng)12 h。分別挑取不同形態(tài)單菌落于LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,采用四分體劃線法在LB固體培養(yǎng)基上劃線,37 ℃倒置培養(yǎng)12 h,得到純化的單菌落。將純化的單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600約為0.8),按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明提取細菌DNA。使用細菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′- GGTTACCTTGTTACGACTT -3′)對分離株進行16S rRNA基因擴增。PCR反應體系(20 μL): 2×TaqMaster Mix緩沖液10 μL, DNA模板1 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL, ddH2O 7 μL。PCR反應條件:94 ℃ 1 min; 94 ℃ 50 s, 56 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min, 30個循環(huán);72 ℃ 10 min, 4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物5 μL,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將檢測后PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測定16S rRNA基因序列,測序結(jié)果在NCBI中進行BLAST比對分析。通過Mega X構(gòu)建志賀氏菌菌株BS26的遺傳進化樹。

1.2.2 志賀氏菌耐藥性測定 將菌株BS26培養(yǎng)至對數(shù)期,取100 μL BS26菌液于4 mL的EP管中,倒入滅菌后不燙手的LB半固體培養(yǎng)基,迅速混勻后倒至LB固體培養(yǎng)基平板上;用鑷子夾取藥敏紙片貼于LB半固體培養(yǎng)基表面,37 ℃倒置培養(yǎng)12 h;觀察藥敏紙片周圍是否出現(xiàn)抑菌圈,并測量抑菌圈的直徑(d)大小。抑菌圈直徑d>20 mm為高度敏感;10 mm

1.2.3 噬菌體的分離純化 從健康肉雞糞便中分離噬菌體,將50 g健康的肉雞糞便和10 mL 26株志賀氏菌分離株加入300 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)液經(jīng)13 000 r/min離心10 min,用0.22 μm濾膜過濾得到上清即為混合噬菌體液。噬菌體裂解菌體后溶液中的蛋白含量會增高,可以采用考馬斯亮藍染色檢測蛋白含量的方法分離噬菌體。在26株志賀氏菌分離株菌液中分別加入100 μL噬菌體液,并以等量ddH2O為對照,37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h,然后10 000 r/min離心1 min后取上清液,按照V樣品∶V考馬斯亮藍染色液∶VddH2O=1∶1∶3測定OD595。相比于對照組,將OD595上升10%的噬菌體用于純化鑒定。以菌株BS26為宿主,利用雙層平板法對噬菌體進行純化。取100 μL噬菌體液、900 μL ddH2O混合均勻進行梯度稀釋,將100 μL稀釋后的噬菌體液與100 μL宿主菌加入4 mL EP管中,然后倒入4 mL冷卻至約50 ℃的LB半固體培養(yǎng)基,混勻后迅速倒入LB固體培養(yǎng)基中。37 ℃倒置培養(yǎng)12 h;選擇分布均勻且完整的噬菌斑,接種到對數(shù)期的宿主菌菌液中,在37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)5～8 h使噬菌體增殖;將培養(yǎng)后的混合液13 000 r/min離心10 min后取上清液,上清液用0.22 μm濾膜過濾,分裝于滅菌后的EP管中。重復上述步驟,直到得到單一種類的噬菌體,將純化后的噬菌體液放入4 ℃冰箱備用。

1.2.4 噬菌體形態(tài)觀察 ① 噬菌體濃縮:將1 L噬菌體液17 000 r/min離心15 min取上清液,然后加入DNase I、RNase A (終質(zhì)量濃度均為1 μg/mL),37 ℃恒溫水浴鍋中消化3 h,再加入NaCl(終濃度為1 mol/L),NaCl溶解后冰上放置2 h;然后17 000 r/min離心15 min取上清液,加入PEG8000 (終質(zhì)量分數(shù)為10%),溶解后于4 ℃冰箱放置12 h;所得溶液于16 000 r/min離心20 min后收集沉淀,用12 mL SM緩沖液溶解,放置室溫1 h;使用12 mL氯仿抽提1次,以除去PEG8000,之后10 000 r/min離心15 min后收集水相,采用雙層平板法測定濃縮噬菌體液的效價并將樣品保存于4 ℃冰箱[14]。② 透射電鏡觀察:吸取20 μL用PEG沉淀法制備的濃縮噬菌體液滴在復膜銅網(wǎng)上,室溫自然沉淀15 min;在樣品未完全干燥時,用2%磷鎢酸(pH=7.0)滴染2 min,吸取多余的染液。常溫放置2 min后,使用JEM-1400透射電子顯微鏡進行觀察,將BS26對應的噬菌體,命名為PSF26。

1.2.5 噬菌體的生物學特性研究 ① 宿主譜鑒定:為了測定噬菌體PSF26的宿主范圍以及宿主特異性,用26株志賀氏菌分離株BS1～BS26,以及13株標準菌株作為宿主,采用雙層平板法對純化后的噬菌體PSF26進行敏感性試驗。取100 μL待測菌液于4 mL EP管中,然后倒入4 mL冷卻至約50 ℃的LB半固體培養(yǎng)基,混勻后迅速將混合物倒入LB固體培養(yǎng)基中;吸取10 μL噬菌體液,滴在雙層瓊脂平板的上層,放置于超凈工作臺中風干后,倒置37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。觀察是否有透明噬菌斑出現(xiàn)。每組各三個平行重復。② 噬菌體PSF26最佳感染復數(shù)(Multiplicity of Infection, MOI)測定:將宿主菌株BS26接種于LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8,梯度稀釋后利用平板涂布法進行計數(shù);對噬菌體液進行梯度稀釋,將宿主菌液和噬菌體液按照感染復數(shù)為0.001、0.01、0.1、1、10、100的比例混合;使混合液的總體積為5 mL,少于5 mL則用LB液體培養(yǎng)基補足;之后于37 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)4 h,將培養(yǎng)后的混合液13 000 r/min離心15 min后取上清液,用0.22 μm濾膜過濾;取不同感染復數(shù)的上清液100 μL進行梯度稀釋,并通過雙層平板法驗證噬菌體的效價。驗證后效價最高的一組即為噬菌體PSF26的最佳感染復數(shù)。每組各三個平行重復。③ 一步生長曲線:噬菌體的一步生長曲線是定量描述噬菌體生長規(guī)律的實驗曲線。具體操作如下:將宿主菌BS26接種于LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8;以噬菌體PSF26的最佳感染復數(shù)加入噬菌體PSF26,并放置于37 ℃吸附15 min;之后11 000 r/min離心10 min后留沉淀,用LB液體培養(yǎng)基輕輕吹打混勻,離心留沉淀。沉淀中加入LB液體培養(yǎng)基30 mL,37 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng);每隔15 min取樣 一次,直到150 min停止取樣。通過雙層平板法驗證不同時間點噬菌體的效價。每組各三個平行重復。④ 噬菌體抗菌效果評估:采用空白藥敏紙片法評估噬菌體PSF26對宿主菌BS26的抗菌效果。在平板中倒入適量LB固體培養(yǎng)基,用于制備雙層瓊脂平板的下層培養(yǎng)基,風干凝固后備用。取100 μL BS26對數(shù)期菌液于4 mL EP管中,在EP管中倒入4 mL左右LB半固體培養(yǎng)基,上下顛倒混勻后迅速將混合物倒入準備好的LB固體培養(yǎng)基中,放置空白藥敏紙片,以LB液體培養(yǎng)基為空白對照,在空白藥敏紙片上滴加30 μL噬菌體原液(1011pfu/mL),37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h,并觀察透明圈。每組各三個平行。將宿主菌株BS26接種于LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8;以噬菌體PSF26的最佳感染復數(shù)加入噬菌體PSF26,并建立無噬菌體的陰性對照,37 ℃吸附15 min后,37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng),每隔1 h,以LB液體培養(yǎng)基為空白對照,測600 nm處的OD值。每組各三個平行。⑤ pH和熱穩(wěn)定性分析:為了評估噬菌體PSF26在不同酸堿度下的穩(wěn)定性,使用NaOH與HCl溶液調(diào)節(jié)SM緩沖液pH值。pH值梯度設置為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。取100 μL噬菌體液與900 μL不同pH的SM緩沖液混合均勻,37 ℃恒溫孵育2 h,通過雙層平板法驗證不同pH值時噬菌體的效價。為了評估噬菌體PSF26的穩(wěn)定性,溫度梯度設置為4、20、30、40、50、60、70、80 ℃。取PBS緩沖液900 μL于1.5 mL EP管中,將EP管于不同溫度下預處理30 min。在各EP管中加入100 μL噬菌體液,繼續(xù)于不同溫度下培養(yǎng)1 h。通過雙層平板法驗證不同溫度下噬菌體的效價。每組各三個平行重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 志賀氏菌的分離鑒定

本研究共分離到26株菌株,并分別命名為BS1～BS26。在NCBI中利用BLAST在線工具對細菌的16S rRNA基因序列進行相似性比對,BS1～BS26均為志賀氏菌分離株[15]。遺傳進化樹結(jié)果表明BS26與ATCC 29903親緣關系最近,鑒定為福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)。菌株BS26的分子量大小為1 500 bp (圖1)。

圖1 菌株BS26的鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of Shigella BS26A:菌株BS26的16S rRNA基因擴增圖;1:D2000 plus DNA Ladder (100～5 000 bp);2:BS26;B:菌株BS26的系統(tǒng)發(fā)育樹A:Amplification of 16S rRNA gene of Shigella BS26;1:D2000 plus DNA Ladder (100-5 000 bp);2:Shigella BS26;B: Phylogenetic tree of Shigella BS26

2.2 志賀氏菌耐藥性測定

耐藥性實驗結(jié)果顯示菌株BS26對氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素、磺胺甲噁唑、阿莫西林完全耐藥,無抑菌圈出現(xiàn)(表1)。其對慶大霉素、氨曲南、頭孢噻肟、頭孢曲松等抗生素較為敏感,抑菌圈直徑均大于20 mm。但對阿米卡星、鏈霉素、頭孢他啶等只有中低度敏感,抑菌圈直徑在10～20 mm內(nèi)。此結(jié)果表明志賀氏菌株BS26已經(jīng)出現(xiàn)多重耐藥性,如果任由抗生素繼續(xù)濫用,后續(xù)耐藥性可能會更加嚴重。這也表明探索、發(fā)展新的可以替代抗生素的對治療細菌感染方法的緊迫性和重要性。

表1 志賀氏菌BS26耐藥性試驗Table 1 Drug resistance test of Shigella BS26

2.3 噬菌體的分離純化

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組在加入噬菌體液12 h后,實驗組的菌液與對照組相比明顯變澄清,使用考馬斯亮藍法染色后發(fā)現(xiàn)在較為澄清的菌液中,蛋白質(zhì)含量OD595相較于對照組出現(xiàn)明顯升高(表2)。挑取OD595明顯升高且菌液變澄清的菌種進行雙層驗證試驗,經(jīng)過多次純化后共得到26株噬菌體。將菌株BS26對應的噬菌體命名為噬菌體PSF26。

表2 實驗組與對照組蛋白含量OD595對比Table 2 Comparison table of protein content OD595 between experimental group and control group

用雙層平板法對噬菌體PSF26進行純化后,噬菌斑呈透明圓形且大小均一,邊緣清晰,無暈環(huán)。說明噬菌體PSF26純化成功(圖2)。

圖2 噬菌體PSF26的純化結(jié)果Fig.2 Purification results of phage PSF26

2.4 噬菌體的形態(tài)特征

通過透射電鏡觀察(圖3),噬菌體PSF26的頭部是二十面體結(jié)構(gòu),直徑約為61 nm;具有非收縮性可彎曲的尾部,長約140 nm;尾部有尾鞘,具有收縮性,根據(jù)形態(tài)將其歸為有尾噬菌體目(Caudovirales),長尾噬菌體科(Siphoviridae)[16]。

圖3 噬菌體PSF26的電鏡照片F(xiàn)ig.3 Electron micrograph of phage PSF26

2.5 噬菌體的生物學特性分析

2.5.1 噬菌體PSF26宿主譜分析 采用雙層平板法對純化后的噬菌體PSF26進行敏感性試驗。如表3所示,在待測的26株志賀氏菌分離株BS1～BS26和13株標準菌株中,噬菌體PSF26在志賀氏菌分離株BS8、BS9、BS13、BS26的雙層平板中出現(xiàn)清晰且透明的噬菌斑,直徑大小約為20 mm,而13株標準菌株及其余志賀氏菌分離株均無噬菌斑形成。該結(jié)果表明,噬菌體PSF26對志賀氏菌存在一定的宿主特異性,但其對其中的福氏志賀氏菌和宋內(nèi)志賀氏菌分離株均有裂解作用。

表3 噬菌體PSF26的宿主譜分析Table 3 Host spectrum analysis of phage PSF26

2.5.2 噬菌體PSF26最佳感染復數(shù) 如圖4所示,在感染復數(shù)為0.1時,噬菌體PSF26的效價最高,達2.20×109pfu/mL。因此,可確定噬菌體PSF26的最佳感染復數(shù)為0.1。

圖4 噬菌體PSF26最佳感染復數(shù)Fig.4 The optimal multiplicity of infection (MOI) of phage PSF26

2.5.3 一步生長曲線的測定 在感染宿主菌BS26后的75 min內(nèi),噬菌體PSF26的效價變化不明顯,表明此時間范圍為其潛伏期;在感染后75～90 min內(nèi)噬菌體的效價急劇升高,表明其爆發(fā)期約為15 min;之后趨于平穩(wěn),表明噬菌體PSF26的裂解期時長為90 min,裂解量為(58±17) pfu/cell; 在90 min后進入穩(wěn)定期(圖5)。

圖5 噬菌體PSF26的一步生長曲線Fig.5 One-step growth curve of phage PSF26

2.5.4 抑菌圈分析 噬菌體PSF26在LB固體培養(yǎng)基上的抑菌效果如圖6所示,可見邊緣清晰的圓形抑菌圈,抑菌圈直徑為(11.33±1.53) mm,和對照相比(6 mm),顯著性P值小于0.05(圖6A)。進一步分析噬菌體PSF26的抑菌時間曲線,和對照相比,噬菌體PSF26從3 h起開始發(fā)揮作用,肉眼可以觀察到試管變澄清,添加噬菌體PSF26后,菌株BS26生長速度明顯低于對照組(圖6B)。

圖6 噬菌體PSF26對菌株BS26的抑菌效果Fig.6 Bacteriostatic effect of phage PSF26 on Shigella BS26A:噬菌體PSF26對菌株BS26的抑菌平板圖;a:LB液體培養(yǎng)基對照;b1、b2、b3:噬菌體PSF26對菌株BS26的抑菌圈直徑的三個平行;B:噬菌體PSF26對菌株BS26的抑菌時間曲線A: Bacteriostatic plate diagram of phage PSF26 against Shigella BS26; a is the LB liquid medium control;b1, b2 and b3 represent three parallel diameters of bacteriostatic circle of phage PSF26 against Shigella BS26; B: Bacteriostasis time curve of phage PSF26 against Shigella BS26

2.5.5 pH和熱穩(wěn)定性分析 噬菌體PSF26的效價在pH 2～3 (極酸)和13 (極堿)時為0,表明噬菌體在這些pH條件下處于失活狀態(tài);在pH 5～8時,噬菌體處于高活性狀態(tài);在pH為8～10時,噬菌體效價稍有降低,但幅度較小,依然可以維持在較高數(shù)量級。這些結(jié)果表明,噬菌體PSF26在較寬的pH范圍內(nèi)依然可以保持抗菌活性,說明其對酸堿有一定的耐受性(圖7A)。如圖7B所示,溫度為4～40 ℃時,噬菌體PSF26活性較高,其效價維持在較高的數(shù)量級;溫度為40～80 ℃時,噬菌體效價逐漸降低,至80 ℃時效價為0,完全喪失活性。因此,噬菌體PSF26的適宜作用溫度為4～40 ℃,這也是常規(guī)環(huán)境溫度和大部分細菌的適宜生長溫度。

圖7 噬菌體PSF26的pH (A) 和熱穩(wěn)定性 (B) 分析Fig.7 pH (A) and thermal stability (B) analysis of phage PSF26

3 討 論

志賀氏菌為典型的食源性可致腸道感染病原體,對養(yǎng)殖業(yè)和人體健康具有很大的危害性[17]。本研究從養(yǎng)雞場病雞腸道中分離得到26株志賀氏菌,通過志賀氏菌分離株致病性評估,發(fā)現(xiàn)菌株BS26可導致肉雞出現(xiàn)腹瀉癥狀[15],通過篩選、純化得到一株裂解性噬菌體PSF26,鑒定證明噬菌體PSF26屬于有尾噬菌體目,長尾噬菌體科。純化濃縮后的噬菌體液效價為1.65×1011pfu/mL,高于近期報道的噬菌體BLCC16-001(2.0×1010pfu/mL)[18]和噬菌體vB-Sau S-SAP3 (109pfu/mL)[19]效價,表明噬菌體PSF26對病原菌裂解效果較好。同時,相比于腸出血性大腸埃希菌O157噬菌體(爆發(fā)時間為30 min)、鼠傷寒沙門氏菌噬菌體(爆發(fā)時間為180 min)、福氏志賀氏菌噬菌體(爆發(fā)時間45 min)[20-21],噬菌體PSF26的爆發(fā)時間為15 min,具有爆發(fā)時間短的優(yōu)勢。

噬菌體PSF26對志賀氏菌分離株BS8、BS9、BS13、BS26均有裂解作用(其中BS9為宋內(nèi)志賀氏菌,BS8、BS13及BS26為福氏志賀氏菌),但不能裂解其他種類細菌,說明該噬菌體對志賀氏菌具有較強的宿主專一性,這與噬菌體vB-EcoP-E21具有一定的相似性[22]。該結(jié)果也表明,噬菌體PSF26在實踐應用中,可具有良好的靶向性,不會對周圍環(huán)境中其他益生性細菌造成殺滅,從而具有很好的安全性[23]。

通過對噬菌體PSF26的抑菌特性進行探究,發(fā)現(xiàn)噬菌體PSF26對多重耐藥性志賀氏菌BS26的抑菌圈直徑為(11.33±1.53) mm,其抑菌效果優(yōu)于噬菌體EW3-f4 (抑菌圈直徑9.75 mm)[24]。在液體培養(yǎng)基中,以未加入噬菌體PSF26的菌株BS26培養(yǎng)物為對照,通過測定OD600值評估噬菌體PSF26對菌株BS26的生長抑制作用,發(fā)現(xiàn)添加低濃度噬菌體PSF26后,菌體生長速度降低,明顯低于對照組?；诖?針對食源性志賀氏菌污染,可進一步探索噬菌體PSF26作為新型生物抗菌劑的應用價值。

環(huán)境耐受性是噬菌體生產(chǎn)應用過程中的重要考量因素之一。本研究中,噬菌體PSF26在pH 5.0～8.0范圍內(nèi)效價高于108pfu/mL,相比于其他噬菌體,如烈性青枯菌噬菌體(pH 7.0效價最高為106pfu/mL)[25],噬菌體PSF26具有很好的酸堿耐受性。在0～40 ℃范圍內(nèi)噬菌體PSF26效價可達109pfu/mL,80 ℃時,噬菌體PSF26才完全失活,相比于雞糞中分離的噬菌體PNJ1809-36 (60 ℃即完全失活),噬菌體PSF26也表現(xiàn)了良好的溫度耐受性[26]。

據(jù)統(tǒng)計,我國珠江流域排放阿莫西林濃度已高達3 384 ng/L,生態(tài)環(huán)境尤其是養(yǎng)殖業(yè)抗生素污染觸目驚心,亟需嚴控[27-28]。噬菌體作為一類能特異性識別并感染細菌的病毒,專一性地以細菌為宿主進行復制和繁殖,一般對人和動物無害,成為對抗耐藥性細菌感染的“天然武器”[29-30]。本研究系統(tǒng)分析了噬菌體PSF26的生物學特性,發(fā)現(xiàn)其具有爆發(fā)期短、裂解量高和耐受性強等特點,證實了其在防控耐藥性志賀氏菌中具有良好的應用潛能,為今后雞尾酒治療策略制定、飼用抗生素替代和動物源性耐藥志賀氏菌防控提供參考。