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        毛木耳不同生長(zhǎng)期菌棒微生物群落研究

        2023-12-06 02:29:12李小林
        微生物學(xué)雜志 2023年5期

        葉 雷, 張 波, 李小林*, 譚 偉*

        (1.四川省食用菌研究所, 四川 成都 610066;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源學(xué)院,四川 成都 611130)

        毛木耳(AuriculariacorneaEhrenb.)是木耳科(Auriculariaceae)、木耳屬(Auricularia)的大型真菌,曾用學(xué)名A.polytricha[1],主要分黃背木耳和白背木耳,主產(chǎn)四川、山東、江蘇等地,據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì),四川是我國(guó)毛木耳最大產(chǎn)地,2019年鮮耳產(chǎn)量92.15萬(wàn)t,占全國(guó)毛木耳總產(chǎn)的54.74%[2]。我國(guó)毛木耳栽培模式為“熟料袋栽蔭棚出耳”[3],栽培基質(zhì)以常壓蒸汽滅菌(溫度98~102 ℃,滅菌12~15 h)為主,有研究顯示常壓滅菌條件下菌棒中依然存在“污染源”。葉禮奎[4]報(bào)道食用菌栽培中細(xì)菌、病毒、霉菌和蟲害是主要污染源,滅菌后的基質(zhì)中仍然存在細(xì)菌芽胞,并作為培養(yǎng)料的第一污染源。黃毅[5]對(duì)金針菇菌棒細(xì)菌污染的研究顯示:菌包的真菌性污染是顯著的,肉眼可見的,而細(xì)菌性污染易被忽視且具有隱形性,損失是巨大的。陳俏彪等[6]研究表明,食用菌基料采取常壓滅菌生產(chǎn)時(shí),細(xì)菌芽胞不能完全殺死能引起培養(yǎng)料的污染。那么在毛木耳栽培基質(zhì)中存在哪些微生物?它們對(duì)毛木耳菌棒、子實(shí)體等的影響如何?四川省食用菌研究所毛木耳研究課題組采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)毛木耳不同出耳階段菌棒微生物群落進(jìn)行了研究,以明析毛木耳菌棒中微生物群落情況,為毛木耳高效栽培提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 供試材料 供試菌株為上海1號(hào),四川主栽品種,經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為毛木耳(Auriculariacornea);所用有機(jī)原料新鮮無(wú)霉變,均為正品;料袋規(guī)格為折徑17.5 cm×長(zhǎng)47 cm×厚0.004 cm,聚乙烯材質(zhì),一端開口。

        1.1.2 培養(yǎng)基 母種培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基);原種和栽培出耳培養(yǎng)基(以干料計(jì),質(zhì)量分?jǐn)?shù),%):木屑33,玉米芯30,米糠20,高粱殼10,玉米粉2,石灰4,石膏1。原料參數(shù)要求參見黃忠乾等[3]。

        1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 E.Z.N.A.?Soil DNA Kit (OMEGA Bio-Tek, Norcross, Georgia, USA);凝膠回收試劑盒(AP-GX-250, AXYGEN公司);熒光試劑(Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit,上海諾寧生物科技有限公司);AMPure XP 磁珠(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司);Q5高保真DNA聚合酶(NEB公司);MiSeq Reagent Kit V3 (600 cycles)。Illumina (Miseq, Illumina公司);TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit(FC-121-4003,Illumina);PCR儀(ETC 811, 東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司);定量?jī)x器Microplate reader(FLx 800, BioTek);離心機(jī) (5427R, 德國(guó)艾本德股份公司);-80 ℃ 冰箱(DW-HL 528S, 中科美菱);渦旋振蕩器米歐(mix-28+, 廣州圍古潤(rùn)儀器有限公司);拌料機(jī)、裝袋機(jī)、滅菌器、液體菌種發(fā)酵和接種成套設(shè)備(連云港國(guó)鑫食用菌成套設(shè)備有限公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 代料栽培方法 按照栽培基質(zhì)配方準(zhǔn)確稱量栽培組分,并采用工廠化制袋成套設(shè)備進(jìn)行拌料、裝袋、滅菌和接種。培養(yǎng)料充分混勻且含水量為62%;裝料重為2.3 kg/袋(濕料,菌棒長(zhǎng)一致);裝袋完成后機(jī)械對(duì)料袋開口端扎絲直接封口;采用常壓滅菌,設(shè)定參數(shù)100 ℃維持14 h;滅菌完成后菌棒出鍋采用制冷機(jī)進(jìn)行強(qiáng)冷,待菌棒中間溫度25~28 ℃時(shí),采用液體接種機(jī)對(duì)滅菌冷卻料袋接種菌種50 g/袋(接種2孔),并用無(wú)菌無(wú)紡布封口;菌棒放置在25 ℃控溫培養(yǎng)房無(wú)光培養(yǎng)至菌絲滿袋,完成后熟培養(yǎng)15 d后篩選菌絲潔白、無(wú)菌皮、無(wú)雜點(diǎn)的菌棒上架出耳(出耳棚事先消毒處理)。菌棒腹面均勻劃開三個(gè)口,呈“V”字型,口徑1.5 cm,朝下,后續(xù)養(yǎng)菌5 d,控制環(huán)境空氣濕度85%~95%,光照200~300 lx,溫度自然,進(jìn)行菌袋的催耳和出耳管理[3]。獲得第一潮干耳103 kg/1 000袋。

        1.2.2 樣本采集 對(duì)菌棒樣本分4個(gè)階段采集,菌絲滿袋后熟(記為0 d)、原基形成(記為20 d)、原基分化開片(記為35 d)和子實(shí)體邊緣微卷成熟(記為50 d),并分別編號(hào)為ful、pri、ope和mat(圖1)。每個(gè)時(shí)期3個(gè)生物學(xué)重復(fù),分細(xì)菌和真菌群落兩大組樣本進(jìn)行測(cè)定,共計(jì)24個(gè)樣本。菌棒樣本采集時(shí),隨機(jī)選擇菌棒,首先用0.1%的酸性高錳酸鉀進(jìn)行菌棒表面的消毒,用75%的酒精棉球擦拭菌棒表面消毒,然后將預(yù)處理的菌棒用無(wú)菌塑料膜包裹放入無(wú)菌的超凈工作臺(tái)上,按照無(wú)菌操作流程,在開“V”字型出耳口的腹面的背面位置,用手術(shù)刀將菌棒表面塑料袋劃開,用鑷子隨即夾取料袋中部培養(yǎng)料和菌絲體的混合物放入無(wú)菌EP管中作為樣本,立即將樣本用液氮冷凍15 min,然后-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

        圖1 各采樣期菌棒和子實(shí)體形態(tài)Fig.1 Morphology of artificial bed-log and fruiting body at different sampling periodsA:菌絲滿袋后熟期(ful);B:原基形成期(pri);C:原基分化開片期(ope);D:子實(shí)體邊緣微卷成熟期(mat)A: The mycelium full of bags (ful); B: Prophase of fruiting body formation (pri); C: Fruiting body stretch period (ope); D: Maturation stage of fruiting body (mat)

        1.2.3 總DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序 采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit提取樣本總DNA,瓊脂糖(0.8%)凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)對(duì)提取DNA進(jìn)行定量分析。采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3~V4高變區(qū)和真菌ITS1區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增引物和反應(yīng)條件參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行[7-9]。采用瓊脂糖(0.2%)凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,凝膠回收試劑盒進(jìn)行目標(biāo)條帶的切膠回收。測(cè)序文庫(kù)制備采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit。使用Illumina MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測(cè)序[7,10]。

        1.2.4 下機(jī)數(shù)據(jù)分析 對(duì)高通量測(cè)序的下機(jī)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量篩查(窗口大小為10 bp,步長(zhǎng)為1 bp),去除嵌合體等疑問序列,使用QIIME軟件進(jìn)行OTU(Operational Taxonomic Unit)歸并劃分(以97%的相似度),針對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫(kù),采用Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)[11],真菌18S rRNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)采用Silva數(shù)據(jù)庫(kù)[12]去除劣質(zhì)數(shù)據(jù)[13]。后續(xù)結(jié)合相關(guān)軟件構(gòu)建稀釋曲線,進(jìn)行多樣性分析、群落組成分析、細(xì)菌菌群代謝功能預(yù)測(cè)等[14]。細(xì)菌和真菌測(cè)序原始數(shù)據(jù)以FASTQ格式保存,并上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)分別為PRJNA 780 254、PRJNA 780 257。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 測(cè)序質(zhì)量分析

        對(duì)高通量測(cè)序下機(jī)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后,獲得細(xì)菌16S rRNA有效序列503 724條,真菌有效序列712 728條。進(jìn)一步對(duì)序列長(zhǎng)短進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果細(xì)菌測(cè)定多數(shù)樣本的序列分布在400~450 bp。在97%相似水平下進(jìn)行OTU劃分,ful、pri、ope和mat期樣本的細(xì)菌OTU種類分別為1 054、734、767和1 030;真菌OTU種類分別為154、117、130和107,對(duì)共有OTU進(jìn)行分析,制作Venn圖,結(jié)果所有樣本間細(xì)菌共有OTU為249個(gè)(圖2A),真菌為88個(gè)(圖2B)。進(jìn)一步制作稀釋曲線,結(jié)果隨著樣本測(cè)序深度增加曲線的切線斜率趨于零,表明樣本測(cè)序深度能很好的反映樣本微生物多樣性(圖2C、2D)。細(xì)菌物種注釋分屬25門54綱85目134科199屬;真菌物種注釋隸屬于5門9綱15目12科19屬。

        圖2 共有OTU的Venn圖和物種稀釋曲線Fig.2 Venn diagram of shared OTU and Rarefaction curveA和B分別為細(xì)菌和真菌的Venn圖; C和D分別為細(xì)菌和真菌的稀釋曲線A and B are Venn diagrams of bacteria and fungi respectively; C and D are the rarefaction curves of bacteria and fungi respectively

        2.2 毛木耳子實(shí)體不同生長(zhǎng)期菌棒物種多樣性指數(shù)

        在進(jìn)行多樣性指數(shù)計(jì)算前,對(duì)OTU豐度矩陣中的全體樣本,根據(jù)90%的最低測(cè)序深度統(tǒng)一進(jìn)行“拉平處理”,以避免測(cè)序深度導(dǎo)致的樣本間多樣性差異,更為客觀地反映不同樣本間菌群的Alpha和Beta多樣性差異,提高分析可靠性。使用QIIME軟件計(jì)算樣本的Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)(表1),以反映其Alpha多樣性。稀釋曲線(圖2C)的平均高低順序?yàn)閙at>ful>ope>pri,表明mat期樣本細(xì)菌多樣性更豐富,pri期樣本細(xì)菌多樣性更低。稀釋曲線(圖2D)的平均高低順序?yàn)閒ul>ope>pri>mat,表明ful期樣本真菌多樣性更豐富,mat期樣本真菌多樣性更低。對(duì)多樣性指數(shù)進(jìn)行分析,結(jié)果在0.05水平上細(xì)菌均表現(xiàn)差異不顯著。Chao1和ACE指數(shù)越大,表明群落的豐富度越高,說(shuō)明mat期細(xì)菌群落豐富度高,ope期時(shí)更低;真菌在ful期顯著高于mat期,而在pri和ope期差異不顯著,說(shuō)明在ful期有更高的多樣性。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)很好地反映群落均勻度,值越高表明群落的多樣性越高,說(shuō)明pri期有更高的細(xì)菌群落多樣性;ful期真菌群落多樣性顯著高于其他時(shí)期(表1)。

        表1 多樣性指數(shù)Table 1 Diversity index

        2.3 毛木耳子實(shí)體不同生長(zhǎng)期菌棒群落組成分析

        2.3.1 門分類水平下菌群結(jié)構(gòu)分析 在門分類水平下,毛木耳不同生長(zhǎng)期菌棒細(xì)菌相對(duì)豐度最高的前4個(gè)分別為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes),且以變形菌門為主要優(yōu)勢(shì)門。變形菌門在mat期中相對(duì)豐度最高為77.4%(百分?jǐn)?shù)為相對(duì)豐度),其次為pri期(57.5%)、ful期(55.1%)和ope期(45.4%);厚壁菌門以ope期(51.3%)最高,其次為ful期(36.4%)、pri期(24.7%)和mat期(13.4%);放線菌門以pri期(4.5%)最高,其次為ful期(3.5%)、mat期(2.0%)和ope期(0.6%);擬桿菌門以樣本mat期(5.5%)最高,其次為ful期(2.0%)、pri期(1.5%)、ope期(1.4%)(圖3A)。可見在毛木耳ful、pri和mat期均以變形菌門為最具優(yōu)勢(shì)菌門,在ope期以厚壁菌門為最具優(yōu)勢(shì)菌門。擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)是菌棒真菌相對(duì)豐度最高的2個(gè)門,在所有時(shí)期的樣本中,擔(dān)子菌門為最主要的真菌門,其相對(duì)豐度達(dá)99.29%~99.95%。子囊菌門在ful期相對(duì)豐度最高為0.58%,其他時(shí)期低于0.11%(圖3B)。

        圖3 門分類水平下細(xì)菌(A)和真菌(B)菌群組成及相對(duì)豐度Fig.3 Composition and relative abundance of bacterial (a) and fungal (b) community based on phylum level

        2.3.2 屬分類水平下菌群結(jié)構(gòu)分析 在屬分類水平下,各時(shí)期菌棒細(xì)菌相對(duì)豐度最高的前10個(gè)屬及分布:賴氨酸芽胞桿菌屬(Lysinibacillus)在ope期相對(duì)豐度最高(36.42%);假單胞菌屬(Pseudomonas)在pri期相對(duì)豐度最高(35.85%);不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)在mat期相對(duì)豐度最高(35.85%、14.92%);土壤芽胞桿菌屬(Solibacillus)在pri期相對(duì)豐度最高(14.85%);貪銅菌屬(Cupriavidus)在ful期相對(duì)豐度最高(5.98%);嗜糖假單胞菌屬(Pelomonas)在mat期相對(duì)豐度最高(4.84%);鏈球菌屬(Streptococcus)在ful期相對(duì)豐度最高(4.82%);厭氧芽胞桿菌屬(Anoxybacillus)在ope期相對(duì)豐度最高(3.77%);雷爾氏菌屬(Ralstonia)在mat期相對(duì)豐度最高(2.50%)。即,ful期主要以賴氨酸芽胞桿菌屬(25.71%)和不動(dòng)桿菌屬(14.38%)相對(duì)豐度最高;pri期以假單胞菌屬(35.85%)和土壤芽胞桿菌屬(14.85%)相對(duì)豐度最高;ope期以賴氨酸芽胞桿菌(36.42%)和假單胞菌屬(21.73%)相對(duì)豐度最高;mat期以不動(dòng)桿菌屬(27.94%)和蒼白桿菌屬(14.92%)相對(duì)豐度最高(圖3A、4A)。毛木耳子實(shí)體在不同生長(zhǎng)時(shí)期菌棒真菌均以木耳屬(Auricularia)相對(duì)豐度最高(99.19%~99.94%),在ful期木耳屬相對(duì)豐度達(dá)99.19%,其次是擬青霉屬(Simplicillium)(0.25%);在pri期木耳屬相對(duì)豐度達(dá)99.93%,其次是假絲酵母屬(Candida)(0.01%);在ope期木耳屬相對(duì)豐度達(dá)99.83%,其次是嗜熱真菌屬(Thermomyces)(0.03%);在mat期木耳屬相對(duì)豐度達(dá)99.94%,其次是短梗霉屬(Aureobasidium)(0.02%)和絲孢菌屬(Scedosporium)(0.01%)(圖3B、4B)。對(duì)mat期干耳產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),獲得產(chǎn)量(103±12) g/袋,耳片邊緣厚度(0.94±0.21) mm/片??梢娫诿径訉?shí)體生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段菌棒內(nèi)細(xì)菌菌群組成豐富且有較大差異,而真菌組成以木耳屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),另檢測(cè)出了擬青霉屬和曲霉屬(Aspergillus)等其他少量真菌屬。木耳屬的相對(duì)豐度在一定程度上影響產(chǎn)量形成。

        圖4 屬分類水平下細(xì)菌(A)和真菌(B)菌群組成及相對(duì)豐度Fig.4 Composition and relative abundance of bacterial (A) and fungal (B) community based on genus level

        為進(jìn)一步直觀展示樣本細(xì)菌和真菌群落組成關(guān)系,使用R軟件進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖。通過聚類的方式,將高豐度和低豐度的分類單元加以區(qū)分,并通過聚類熱圖中小方塊的顏色梯度來(lái)反映樣本之間群落組成的相似度(圖5)。

        圖5 基于屬水平的細(xì)菌(A)和真菌(B)菌群組成熱圖及聚類分析Fig.5 Heat map and cluster analysis of sample based on genus level紅色小方塊代表在對(duì)應(yīng)樣本中豐度較高的屬,綠色小方塊代表豐度較低的屬The red square represents the genus with higher abundance in the corresponding sample, and the green square represents the genus with lower abundance

        2.3.3 毛木耳子實(shí)體不同生長(zhǎng)期菌棒菌群組成的Beta多樣性分析 為探究不同樣本間細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)相似性(差異性),使用R軟件對(duì)加權(quán)Weighted的UniFrac距離矩陣分別進(jìn)行非度量多維標(biāo)度分析(Non-metric multidimensional scaling,NMDS),通過二維排序圖展現(xiàn)不同時(shí)期菌棒樣本群落的結(jié)構(gòu)分布,以觀測(cè)毛木耳不同生長(zhǎng)階段菌棒菌群差異。對(duì)不同時(shí)期毛木耳菌棒菌群基于加權(quán)UniFrac距離NMDS分析,對(duì)樣本進(jìn)行細(xì)菌群落NMDS分析表明,同一時(shí)期各樣本距離較分散,說(shuō)明各樣本的組成差異較明顯(圖6A);對(duì)樣本進(jìn)行真菌群落NMDS分析表明,除ful期樣本與其他各時(shí)期距離較分散外,其他各組樣本幾乎重疊,說(shuō)明ful期樣本菌棒中真菌群落與其他各時(shí)期存在顯著差異(圖6C)。采用Weighted UniFrac距離矩陣通過非加權(quán)組平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析,采用“等級(jí)樹”展示毛木耳不同生長(zhǎng)階段菌棒樣本間的相似度,圖中樣本間的分枝長(zhǎng)度越短,兩樣本越相似。毛木耳不同生長(zhǎng)期樣本細(xì)菌的UPGMA聚類分析結(jié)果顯示,mat樣本單成一枝,說(shuō)明毛木耳成熟期菌群組成與其他時(shí)期存在顯著不同,其他各樣本間菌群相似情況如圖6B所示。同樣對(duì)真菌樣本UPGMA聚類分析結(jié)果表明,ful期樣本與其他樣本有更遠(yuǎn)的分枝,剩余的其他樣本有更短的分枝,說(shuō)明ful期菌棒真菌群落組成與其他時(shí)期顯著不同(圖6D)。

        圖6 毛木耳菌棒細(xì)菌(A和C)和真菌(B和D)菌群基于加權(quán)UniFrac距離NMDS分析和UPGMA聚類分析Fig.6 NMDS analysis and UPGMA cluster analysis based on weighted UniFrac distance of bacterial (A and C) and fungal (B and D) communities

        2.3.4 毛木耳子實(shí)體不同生長(zhǎng)期菌棒細(xì)菌群落代謝功能預(yù)測(cè) 本研究基于PICRUSt(Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)開展細(xì)菌群落的代謝功能預(yù)測(cè),以便更好地了解菌群在毛木耳菌棒中發(fā)揮的作用,實(shí)現(xiàn)其“身份”與“功能”的對(duì)應(yīng)[15]。通過PICRUSt對(duì)16S rRNA基因序列在KEGG、COG和Rfam功能譜數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行預(yù)測(cè),并根據(jù)各樣本預(yù)測(cè)的功能類群豐度分布結(jié)果,繪制了KEGG第二等級(jí)分布圖(圖7)。結(jié)果表明,毛木耳子實(shí)體不同生長(zhǎng)期菌棒細(xì)菌富集的功能主要包括外源生物降解、核苷酸、萜類化合物和聚酮類化合物、氨基酸、維生素、脂質(zhì)、聚糖生物合成、碳水化合物代謝等。該圖基于“小提琴”的“寬窄”間接反映毛木耳不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)應(yīng)功能類群數(shù)據(jù)分布的密度高低,越寬表明該豐度下對(duì)應(yīng)的樣本越多。在ful期細(xì)菌群落多發(fā)揮外源生物降解與代謝和氨基酸代謝的作用;在pri期更多發(fā)揮的是碳水化合物代謝的作用;在ope期更多發(fā)揮的是外源生物降解與代謝的作用;在mat期更多發(fā)揮的是外源生物降解與代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝的作用。

        圖7 基于PICRUSt的細(xì)菌代謝功能預(yù)測(cè)的KEGG第二等級(jí)分布Fig.7 KEGG diagram for metabolic function prediction based on PICRUSt of bacterial community

        3 討 論

        菌棒菌群組成是影響食用菌單產(chǎn)的重要因素,間接影響種植效益,然而,國(guó)內(nèi)外關(guān)于毛木耳出耳期菌棒微生物多樣性研究較少。本研究表明基料常壓滅菌條件下,毛木耳出耳期菌棒有著豐富的細(xì)菌群落,在不同出耳階段菌棒細(xì)菌群落組成具有較大差異,以變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門為主,在屬水平上以賴氨酸芽胞桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、土壤芽胞桿菌屬、厭氧芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、貪銅菌屬、嗜糖假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、鏈球菌屬和雷爾氏菌屬等為主,且在子實(shí)體不同生長(zhǎng)階段優(yōu)勢(shì)菌群存在較大差異。唐振[16]對(duì)外源一氧化氮處理下菌棒中細(xì)菌群落進(jìn)行研究,表明厚壁菌門豐度最高,且檢測(cè)出了擬桿菌門和放線菌門,優(yōu)勢(shì)菌屬主要是芽胞桿菌屬,與本研究結(jié)果有一致之處。在病原菌研究方面,賀新生等[17]對(duì)四川金堂袋栽黃背木耳發(fā)生的“壞頭子病”的病原菌進(jìn)行分離鑒定,確定病原菌為芽胞桿菌屬細(xì)菌,其原因?yàn)槌簻缇y以殺死該菌芽胞,致使該菌在菌棒中大量繁殖,引起菌棒的潰爛,致使產(chǎn)量降低30%~70%。胡開輝等[18]對(duì)我國(guó)主栽食用菌細(xì)菌性病害報(bào)道認(rèn)為,雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)細(xì)菌性斑點(diǎn)病、菌褶滴水病、干腐病和軟腐病,平菇(Pleurotusostreatus)細(xì)菌性褐斑病、腐爛病,鳳尾菇(Pleurotussajor-caju)黃斑病,金針菇(Flammulinavelutipes)細(xì)菌性褐斑病,草菇(Volvariellavolvacea)基腐病等均是假單胞菌屬引起,雙孢蘑菇細(xì)菌凹點(diǎn)病由芽胞桿菌屬導(dǎo)致。Munsch等[19]發(fā)現(xiàn)康氏假單胞菌(Pseudomonascostantinii)能引起雙孢蘑菇子實(shí)體病害。同樣在本研究中檢測(cè)出了芽胞桿菌屬、假單胞菌屬等多個(gè)菌屬,為后續(xù)菌棒生理研究提供參考。高云虹等[20]對(duì)引起黑木耳栽培種污染的細(xì)菌進(jìn)行鑒定時(shí),獲得3株引起栽培種污染的細(xì)菌,分別為類芽胞桿菌屬、芽胞桿菌屬和賴氨酸芽胞桿菌屬,本研究也從毛木耳出耳菌棒中檢測(cè)出了這3個(gè)屬。Ma等[21]從杏鮑菇(Pleurotuseryngii)病害子實(shí)體中分離出可侵染其菌柄和菌蓋的泛菌屬(Pantoea)。劉紹雄等[22]對(duì)黑木耳常見病害進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)東洋芽胞桿菌(Bacillustoyonensis)引起黑木耳爛耳。托拉氏假單孢菌(Pseudomonastolaasii)能寄生于食用菌菌絲和子實(shí)體上[23],引起褐斑病[24]而不利于子實(shí)體的生長(zhǎng)。關(guān)統(tǒng)偉等[25]對(duì)杏鮑菇常壓滅菌培養(yǎng)料進(jìn)行純培養(yǎng)獲得7株有差異的細(xì)菌菌株,其中包括芽胞桿菌屬和假單胞菌屬等,且多數(shù)為桿菌屬。綜上,毛木耳菌棒中潛在可能引起子實(shí)體生理性病害的菌群,但由于肉眼較難發(fā)現(xiàn)病灶,故難以統(tǒng)計(jì)。本研究基于PICRUSt對(duì)毛木耳子實(shí)體生長(zhǎng)不同階段菌棒菌群代謝功能進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌棒細(xì)菌與外源生物降解與代謝、核苷酸代謝、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝、輔助因子和維生素的代謝、脂質(zhì)代謝、聚糖生物合成與代謝、碳水化合物代謝等相關(guān),預(yù)測(cè)結(jié)果顯示部分細(xì)菌可能在子實(shí)體不同生長(zhǎng)階段發(fā)揮其效力,部分細(xì)菌的富集可能參與了毛木耳菌絲對(duì)基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的利用過程,如邱立友等[26]報(bào)道固氮菌熒光假單胞菌能在食用菌的菌絲表面形成菌膜,其固定的多余氮會(huì)供給菌絲以促進(jìn)其生長(zhǎng)。

        毛木耳出耳期菌棒真菌類群主要?dú)w屬于擔(dān)子菌門和子囊菌門且以擔(dān)子菌門為主,屬水平上以木耳屬為主,相對(duì)豐度高達(dá)99.94%,最終獲得第一潮干耳(mat期)103 kg/1 000袋,可見木耳屬在菌棒中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)是獲得木耳子實(shí)體的關(guān)鍵,這與已知公認(rèn)結(jié)果一致。除此之外,還檢測(cè)出了極少量的擬青霉屬、假絲酵母屬、嗜熱真菌屬、短梗霉屬、絲孢菌屬和曲霉屬等。毛木耳生產(chǎn)中常見真菌性“病害”主要是綠霉、毛木耳柱霉(Scytalidiumauricola)、曲霉和鏈孢霉等,本研究檢測(cè)出相對(duì)豐度極低的擬青霉屬和曲霉屬等,推測(cè)這些菌的侵入多是由環(huán)境引入。在毛木耳真菌性病害中影響最廣泛最嚴(yán)重的是毛木耳柱霉病害,又叫“油疤病”,彭衛(wèi)紅等[27-28]對(duì)該真菌病害病原菌進(jìn)行了分離鑒定,確定為柱霉屬新種,提出了該病的綜合防控技術(shù)。據(jù)邱立友等[26]介紹,嗜熱真菌屬(降解纖維素、半纖維素等[29])、假單胞菌屬等能促進(jìn)食用菌的生長(zhǎng)發(fā)育。擬青霉屬可引起羊肚菌白霉病[30],危害子實(shí)體,影響羊肚菌土壤真菌群落結(jié)構(gòu);危害黑木耳菌棒的菌絲生長(zhǎng)[31],引起高達(dá)20%的菌棒污染。嗜熱真菌屬能夠降解培養(yǎng)料中的半纖維素可能促進(jìn)了菌絲對(duì)基料的利用。本研究中,除木耳屬以外的真菌屬相對(duì)豐度僅0.06%~0.81%且未明顯表現(xiàn)出污染癥狀,如果菌棒出現(xiàn)真菌性污染,最可能是由外界原因引起。本研究表明,毛木耳常壓代料栽培菌棒中具有豐富的微生物多樣性。細(xì)菌類群較真菌類群更豐富,且某些細(xì)菌可能是子實(shí)體病害的病原菌。真菌以木耳屬相對(duì)豐度最高,另檢測(cè)出極低豐度的擬青霉屬和曲霉屬等,未檢測(cè)到柱霉屬、青霉屬、鏈孢霉等菌棒常見病原菌,推測(cè)這些真菌可能采取常壓滅菌就能達(dá)到很好的滅殺效果。本研究對(duì)袋栽毛木耳生理病害及防控、高效栽培等具有生產(chǎn)指導(dǎo)意義。

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