劉志偉,袁振偉

(中國藥科大學 工學院,江蘇 南京 211198)

青霉素的出現(xiàn)曾被認為是人類現(xiàn)代醫(yī)學和健康領域的一座豐碑,在二戰(zhàn)爭期間挽救了無數(shù)的生命。然而,隨著抗生素的廣泛使用,多重耐藥細菌的出現(xiàn)越來越普遍。特別是那些接受過外科移植和癌癥治療的人更容易受到細菌感染。事實上,抗菌素耐藥性已被世界衛(wèi)生組織宣布為對人類健康的十大威脅之一[1]。 根據(jù)WHO的統(tǒng)計,到2035年耐藥菌感染將超越癌癥成為造成人類死亡(每年1 000萬人)的主要原因[2]。因此,實現(xiàn)對細菌感染早期檢測在細菌感染治療中起著至關重要的作用,不僅可以篩選合適的抗生素,而且可以將益生菌與感染菌分選出來。目前臨床采用的細菌檢測方法是基于患者臨床標本(血、尿、痰)進行的組織活檢和細菌培養(yǎng),這些操作不僅耗時費力,而且臨床樣本取樣過程中不可避免地被污染,因此并不能反映真實的細菌情況。雖然新技術的細菌檢測已經(jīng)發(fā)展,如電化學測量[3], 實時的聚合酶鏈反應[4],表面強化的拉曼散射[5]等,但這些技術需要復雜的專業(yè)操作,同時缺乏足夠的靈敏度。與上述方法和技術相比,基于熒光探針的熒光成像用來檢測細菌感染是一種快速、可行的方法,其中熒光探針是一種精巧、靈敏的工具可以有效地對細菌進行實時檢測。本文總結了目前存在的能夠可視化檢測細菌和感染的探針。這些探針根據(jù)其識別細菌的機制可分為共價結合型熒光探針和代謝標記型熒光探針。

1 基于化學結合策略的細菌識別熒光探針研究進展

與哺乳動物細胞的細胞膜成分不同,細菌細胞的細胞膜外有一層細胞壁,使細菌細胞免受惡劣環(huán)境的侵害。細菌的細胞壁是一個相當豐富和復雜的結構,并且有許多獨特的成分,如肽聚糖、脂多糖和分支菌酸,因此,細菌的細胞壁被認為是檢測和識別細菌的理想靶點,根據(jù)與細菌細胞壁上化學結合物的不同,基于化學結合策略的細菌探針包括基于抗生素結構的探針、基于鋅(Ⅱ)二甲基吡啶胺和基于其它結構的探針。

1.1 基于抗生素結構的細菌識別探針研究進展

抗生素通過破壞細菌形態(tài)以及干擾功能底物的生物合成過程來消滅細菌,也就是說,具有與細菌結合能力的抗生素被認為是一種合理的細菌成像和可視化探針識別基團[6]。目前為止臨床上批準用于治療細菌感染的抗生素有6種,其中β-內(nèi)酰胺、碳青霉烯類萬古霉素和多粘菌素B啟發(fā)了一系列檢測細菌探針的設計。

1.1.1 基于B-內(nèi)酰胺結構的細菌探針研究進展

細菌細胞壁的主要成分是肽聚糖(PG),它可以有效維持細菌的形狀并保護它免受膨脹壓力。PG是由b-(1,4)-連接的n-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N-乙酰氨基葡萄糖(MurNAc)酸聚糖鏈和含有4～5個氨基酸的多肽鏈組成的聚合物結構,如圖1所示,青霉素結合蛋白(PBP)作為轉肽酶將D-丙氨酸(D-Ala)的羧基和L-賴氨酸的氨基交聯(lián)成肽聚糖。B-內(nèi)酰胺類抗生素通過與青霉素結合蛋白結合抑制肽聚糖正常交聯(lián)使肽聚糖不能常規(guī)合成而導致細菌裂解。

圖1 細菌肽聚糖的結構

b-內(nèi)酰胺類抗生素為細菌成像提供了理想的識別基團。熒光標記的b-內(nèi)酰胺類抗生素,如BODIPY偶聯(lián)青霉素V類似物Bocilin(圖2A)[7], 已被用于識別細菌以及檢測活細菌中的PBP活性,這種策略也被稱為基于活性的蛋白標[8-9]。此外一系列基于b-內(nèi)酰胺類抗生素的熒光探針已經(jīng)被陸續(xù)開發(fā)出來。Carlson[10]通過將四甲基羅丹明的熒光基團偶聯(lián)到頭孢菌素C的骨架上計并合成了一種含頭孢菌素C的探針(圖2B),體外細菌培養(yǎng)證明了CephC-T可以實現(xiàn)枯草芽孢桿菌PY79和D39肺炎鏈球菌的特異性體內(nèi)成像。Xie[11]通過將頭孢噻肟與4-羥基-1,8-萘酰亞胺(HN)進行偶聯(lián)構建了一種比例型熒光探針CTX-HN(圖2C),其結構中頭孢噻肟作為b內(nèi)酰胺酶識別片段,對ESBLs具有較好的選擇性而不被其它b-內(nèi)酰胺酶水解,在370 nm激發(fā)時,PBS中的CTX-HN在455 nm處熒光強烈,加入廣譜b-內(nèi)酰胺酶(ESBL)后CTX-HN的β-內(nèi)酰胺環(huán)被水解并釋放HN后,從而使得HN在455 nm處的發(fā)射逐漸降低,同時由于HN的大斯托克斯位移,560 nm處的發(fā)射增強(在450 nm激發(fā))。在560 nm和455 nm處發(fā)射比的最大變化可達2 667倍。通過這種方法,CTH-HN可以有效區(qū)分產(chǎn)ESBL的耐藥菌(ESPO)與一般細菌。

(A)Bocilin;(B)CephC-T;(C)CTX-HN。

1.1.2 基于碳青霉烯結構的細菌熒光探針研究進展

碳青霉烯類抗生素在β-內(nèi)酰胺環(huán)上具有反式取代基,阻止了大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶的水解從而可以被碳青霉烯酶選擇性水解,因此碳青霉烯類抗生素探針有潛力作為探針的識別片段檢測碳青霉烯酶產(chǎn)生菌(CPO),這是近年來迫切需要解決的一種引起嚴重感染的耐多藥細菌[12]。Xie[13]設計了一種對CPO特異性響應的熒光探針CB-1(圖3A)。CB-1以碳青霉烯母環(huán)為碳青霉烯酶識別基團。因為碳青霉烯結構的取代有效猝滅了BODIPY熒光發(fā)射因此CB-1最初是無熒光的(與未取代BODIPY相比),一旦與CPO接觸后,碳青霉烯酶會特異性水解CB-1從而產(chǎn)生不穩(wěn)定的二胺I,二胺I會進一步自發(fā)異構化或降解,破壞碳青霉烯酶與BODIPY的偶聯(lián),從而恢復BODIPY的強綠色熒光信號發(fā)射。Min[14]設計了以碳青霉烯母環(huán)為識別基團,苯基醚為連接體,香豆素為響應基團的探針1b(圖3B)。1b可以全面識別產(chǎn)生各類碳青霉烯類酶的耐藥菌。1b與產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科(CPE)臨床標本孵育后,1b可以發(fā)出明顯的熒光信號,證明探針1b具有良好的檢測靈敏度和準確性。Yang[15]提出了一種比色型熒光探針CARBA-H(圖3C),CARBA-H通過甲氧基苯基醚為連接體將識別片段與間萘酚的熒光團結合。CARBA-H與產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科(CPE)一起培養(yǎng)后,CARBA-H結構中的碳青霉烯母環(huán)會被碳青霉烯酶水解從而恢復間萘酚的熒光發(fā)射信號,因此CARBA-H可以實現(xiàn)對包括產(chǎn)Ambler在內(nèi)的所有三個類別的碳青霉烯酶的廣泛特異性鑒定和CPE臨床分離株的熒光成像,特別是產(chǎn)OXA-48和oxa-181類型碳青霉烯酶的耐藥菌株。

(A)CB-1;(B)1b;(C)CARBA-H。

1.1.3 基于萬古霉素結構的細菌熒光探針研究進展

萬古霉素(Van)是一種糖肽類抗生素,能特異性結合革蘭氏陽性菌壁上的D-Ala-D-Ala序列,從而使得萬古霉素成為構建革蘭氏陽性菌特異性識別熒光探針的理想化識別基團。Dijl and Dam[16]通過將萬古霉素偶聯(lián)到近紅外(NIR)熒光團IR-Dye 800CW設計了革蘭氏陽性細菌識別探針Vanco-800CW(圖4A),Vanco-800CW既可以對實現(xiàn)對小鼠體內(nèi)革蘭氏陽性細菌感染模型活體成像,也可以對死亡的革蘭氏陽性菌進行成像。Xu[17]以FeCl3為氧化劑構建聚芴基噻吩-3-乙酸酯(PFPTA),所得聚噻吩(PFPTA)聚合物再與Van和a-甲氧基-鄰氨基聚乙二醇(mPEG-NH2)通過酯胺反應偶聯(lián),成功構建熒光探針PTPVan(圖4C)。

在體外MRSA培養(yǎng)模型中,PTPVan可作為革蘭氏陽性細菌的熒光探針對MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)進行長時間的有效示蹤。受到聚集誘導發(fā)光熒光團(AIEgen)優(yōu)越的光學性能的啟發(fā),Liu[18]通過在自組裝多肽鏈兩側分別偶聯(lián)和AIEgen成功構建具有革蘭氏陽性菌診療一體化功能的探針E-Probe(圖4C)。E-probe與接觸后,可與MRSA表面共價結合并進一步自組裝形成納米聚集體,激發(fā)光下E-Probe發(fā)光熒光信號并同時觸發(fā)活性氧(ROS)的釋放。在小鼠體內(nèi)MRSA肌肉炎模型中,E-Probe不僅可以對MRSA引發(fā)的感染進行活體成像,而且可以治愈感染。

1.1.4 基于多黏菌素結構的細菌熒光探針研究進展

多黏菌素是一種結構中含有陽離子、兩性、環(huán)狀的抗菌肽[19],可以選擇性地與革蘭氏陰性細菌細胞壁上的脂多糖(LPS)的Lipid A發(fā)生化學結合。因此多黏菌素可用于構建對革蘭氏陰性菌具有高親和力的特異性探針Bradley[20]構建了亞甲基藍-多黏菌素偶聯(lián)物MB-PMX(圖6A),可以同時對革蘭氏陰性菌實現(xiàn)成像和殺傷。Dhaliwal[21]通過將多黏菌素b與環(huán)境敏感的7-硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑(NBD)熒光基團進行化學偶聯(lián)研制了一種水溶性光學成像探針NBD-PMX(圖6B),NBD的極性敏感特性使得NBD-PMX在細菌感染后產(chǎn)生的疏水環(huán)境下能激發(fā)出更高的信噪比,同時該探針化學穩(wěn)定無毒,經(jīng)喉鏡途徑在肺腔內(nèi)給入微量(MIC 1/10)的NBD-PMX后,能夠在短短的幾分鐘內(nèi)實現(xiàn)對于罹患呼吸機肺炎患者體內(nèi)遠端人體氣道和肺泡中的革蘭氏陰性菌的高分辨率實時成像。

1.2 基于鋅(II)-二甲基吡啶胺結構的細菌熒光探針研究進展

鋅(II)-二甲基吡啶胺(ZnDPA)是一種含有鋅離子的化合物,可以特異性地與細菌包膜中普遍存在的磷酸化的兩親體、磷脂酰甘油、心磷脂發(fā)生化學結合[22],使得ZnDPA可以成功識別構建細菌識別探針理想化識別基團。Smith[23]以ZnDPA作為識別基團和BODIPY作為熒光團構建了兩種結構類似的熒光探針。一種探針是微生物靶向熒光顯像劑mSeek,另一種探針是氧光敏類似物mDestroy(圖5A)。這兩種ZnDPA-BODIPY偶聯(lián)物都能實現(xiàn)特異性的細菌成像,同時側鏈被碘原子修飾后的mDestroy可以在激發(fā)光下產(chǎn)生ROS從而有效殺死細菌。Smith[24]進一步構建了一個以花氰染料為熒光基團的ZnDPA探針Cy-ZnDPA(圖5B),結果表明Cy-ZnDPA可以有效實現(xiàn)革蘭氏陽性菌感染的小鼠活體成像。基于芳酸及其衍生物結構的染料及其偶聯(lián)物已被制備和評價用于各種類型的成像應用[25-27]通過將芳酸類熒光基團包封在保護性大環(huán)內(nèi),構建了兩個高穩(wěn)定性的芳酸輪烷衍生物,然后將這兩個輪烷衍生物與ZnDPA偶聯(lián)到輪烷的兩側,成功構建出為兩個結構相關的細菌探針Squaraine-Zndpa1和Suqaraine-ZnDPA2(圖6C)。在腿部感染裸鼠模型中,兩個探針都實現(xiàn)了細菌感染的成像, 并且Squaraine-ZnDPA-1比Squaraine-ZnDPA-2表現(xiàn)出更高的熒光強度和更快的體內(nèi)清除速率。

(A)MB-PMX;(B)NBD-PMX。

(A)mSeek和mDestroy的結構;(B)Cy-ZnDPA;(C)squarine-ZnDPA1和squarine-ZnDPA2。

1.3 其它結構的細菌熒光探針研究進展

除了細胞壁的特殊成分以外,近年來還發(fā)現(xiàn)了細菌中存在的一些其他靶點。有研究表明證明含有硼酸的染料可以通過與表面的糖蛋白結構結合來標記革蘭氏陽性細菌的孢子[27]。

Chang[29]合成并開發(fā)了一種基于BODIPY結構的熒光探針BacGo(圖7A),體外細菌培養(yǎng)表明BacGo可以實現(xiàn)對幾乎所有革蘭氏陽性細菌的廣泛成像,而不染色革蘭氏陰性細菌。絲狀溫度敏感Z蛋白(FtsZ)已被證明在細菌細胞分裂過程[30-31]以及葡聚糖的生物合成[32]中發(fā)揮重要作用。也就是說,FtsZ蛋白被認為是開發(fā)新型抗生素的一個有希望的新靶點[33-34]。Matsumura 和Pilch[35]通過將熒光基團BPDIPY偶聯(lián)到一個惡唑-苯甲酰胺結構的FtsZ抑制劑上開發(fā)了一種基于ftsz蛋白抑制劑的熒光探針BOFP(圖6B),體外細菌培養(yǎng)表明:BOFP可以有效地標記上述所有革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原體,因此BOFP是一種優(yōu)越的熒光探針,具有廣譜的細菌識別和檢測能力。

(A)BacGo;(B)BOFP。

2 基于代謝標記策略的細菌熒光探針研究進展

細菌是一種活的生命有機體,因此需要從周圍環(huán)境中吸收營養(yǎng)并合成功能底物來滿足自身的繁殖和生長的需要。值得注意的是細菌和哺乳動物的代謝途徑存在巨大差異[36],根據(jù)代謝物質的不同,細菌代謝途徑可以具體分為碳水化合物代謝途徑,核苷,葉酸的代謝途徑。細菌細胞膜獨特組分的生物合成過程以及鐵離子的代謝途徑,其中碳水化合物的代謝和細菌細胞壁獨特組分的生物合成可以為熒光探針實現(xiàn)細菌的敏感和選擇性可視化提供堅實的基礎。與傳統(tǒng)的與細菌共價結合的探針相比,基于代謝標記策略的探針具有背景信號低、靈敏度和特異性好等顯著優(yōu)勢。

2.1 基于糖代謝途徑標記的細菌熒光探針研究進展

糖類是細菌繁殖必不可少缺的營養(yǎng)物質之一。與哺乳動物細胞類似,細菌通過活性轉運體介導的主動轉運吸收糖類,因此細菌細胞膜上有許多相應的轉運體從而將胞外的糖轉運到胞內(nèi)[37-39]。根據(jù)糖類具體種類的不同,細菌的糖類代謝途徑可以分為麥芽糖代謝途徑以及海藻糖代謝途徑。其中麥芽糖和麥芽糖己糖被各種活性細菌普遍利用,而海藻糖是分枝桿菌細胞壁上不可或缺獨特成分,被分枝桿菌特異性吸收[40]。

2.1.1 基于麥芽糖代謝途徑標記的細菌熒光探針研究進展

麥芽糖和麥芽己糖是細菌重要的供能物質之一[41]因此細菌可以表達一種獨特的麥芽糖糊精轉運蛋白[42]。然而這種麥芽糖糊精轉運蛋白在哺乳動物細胞膜上是不表達的[43]。受到細菌和哺乳動物細胞中的獨特麥芽糖途徑差異的啟發(fā),Murthy[44]通過分別將炔功能化的苝和熒光染料IR-780與疊氮化的葡萄糖寡聚物進行點擊反應,構建了兩個基于麥芽糖的探針MDP1和MDP-2(圖8A)?；邴溠刻堑奶结槼浞掷昧似咸烟堑途畚锏挠H水性和不透膜性以及麥芽糖糊精被細菌選擇性內(nèi)化的優(yōu)勢,并且在體內(nèi)和體外實驗中MDP-1和MDP-2均表現(xiàn)出良好的細菌成像能力。Gambhir[45]開發(fā)了一種麥芽糖的熒光衍生物Cy7-1(圖9B),在體外細菌培養(yǎng)中和小鼠體內(nèi)感染模型中Cy7-1可被多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌株吸收從而同時實現(xiàn)熒光與光聲的雙重成像。在大腸桿菌誘導的肌炎和臨床相關的金黃色葡萄球菌傷口感染小鼠模型中證明了該探針不僅可以檢測感染、評估感染程度,而且可以對抗生素治療效果的能力進行可視化評估。

從左至右分別為碳水化合物、葉酸、細胞壁 鐵離子和核苷代謝途徑。

(A)MDP-1和MDP-2;(B)Cy7-1。

2.1.2 基于海藻糖代謝途徑標記的細菌熒光探針研究進展b

如圖10所示,海藻糖是海藻糖二羧酸酯(TDM)的前體,TDM是分枝桿菌菌膜的重要成分。外源性海藻糖分子可以通過兩種代謝途徑進入分枝桿菌外膜。第一種途徑是通過糖abc-lpqy轉運蛋白復合物將海藻糖的雙糖轉運到細胞質中[46]使得海藻糖轉化為海藻糖二酸鹽(TDM),接著通過Mmpl3轉運體系統(tǒng)從細胞質轉運到外膜[47]。第二種途徑定位于外周質,涉及抗原Ag85介導的海藻糖真菌化[48]。Ag85蛋白復合體由三種相關的酰基轉移酶Ag85A、Ag85B和Ag85C組成,它們負責海藻糖的?；?形成海藻糖菌酸[49]。

圖10 結核分枝桿菌細胞膜結構[50]

一些課題組已經(jīng)觀察到經(jīng)過結構修飾的海藻糖熒光類似物[50-51]可以被整合到結核分枝桿菌的菌膜中。Bertozzi[52]通過將海藻糖與環(huán)境敏感的4-N,N-二甲氨基-1,8-萘酰亞胺(DMN)熒光基團偶聯(lián),構建了熒光模擬物DMN-Tre(圖11A)可以實現(xiàn)對菌膜的準確標記和監(jiān)測。得益于DMN-Tre被整合到疏水菌膜的過程是由Ag38復合物進行的,同時DMN從水環(huán)境過渡到疏水環(huán)境時可以觸發(fā)更強的熒光強度,因此DMN-Tre被進一步開發(fā)為快速識別和檢測患者痰液中存在的結核分枝桿菌的工具[53]。最近有研究證明[54-55]海藻糖二霉菌酸(TDM)可以被分枝桿菌特異性水解酶(Tdmh)水解從而增加結核分枝桿菌菌膜對營養(yǎng)物質的通透性,使得分枝桿菌能夠主動獲取更多的營養(yǎng)物質,以應對宿主免疫系統(tǒng)引起的營養(yǎng)剝奪。受此啟發(fā)Swarts[56]構建了一種基于FRET的TDM類似物FRET-TDM(圖11B),在與Tdmh接觸后,FRET-TDM結構中的猝滅基團DABCYL會因為Tdmh水解作用而離去從而恢復熒光發(fā)射線信號。體外實驗表明,FRET-TDM可被分枝桿菌產(chǎn)生的Tdmh特異性激活從而作為分枝桿菌鑒定和成像的探針。Kiessling[57]開發(fā)了一種含有猝滅劑的海藻糖探QTF,該探針由BODPI熒光團和DABCYL猝滅劑組成,QTF可以被Ag85的真菌轉移酶特異性水解使得猝滅基團DABCYL離去,結構中殘留的海藻糖類似物作為供體被結核分枝桿菌吸收從而實現(xiàn)分枝桿菌生長的實時熒光成像。

(A)DMN-Tre;(B)FRET-Tdm;(C)QTF。

(A)TPEDy-D-Al;(B)Si-Rhodamine;(C)IR-FGN。

2.2 基于細胞壁合成途徑標記的細菌熒光探針研究進展

細胞壁是維持細菌重要組成部分可以有效維持細菌形態(tài)不受外界環(huán)境的影響。細胞壁是一個多維的復合體,其成分因細菌的種類而有所異,細菌需要吸收一系列的前體來形成細胞壁以維持自身形態(tài),因此這些熒光標記前體類似物可以作為熒光探針來識別細菌。許多證據(jù)表明,d-氨基酸和3-脫氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)可以轉化為代謝標記型熒光探針。

2.2.1 基于肽聚糖合成途徑代謝標記的細菌熒光探針研究進展

如圖11A所示,D-氨基酸是肽聚糖的成分之一,因此,熒光標記D-氨基酸(FDAA)可以作為氨基酸的供體被參與細菌的復制過程從而摻入PG中,實現(xiàn)對細菌的特異性成像[58]。同時,由于D-氨基酸不能被哺乳動物細胞吸收使得基于FDAA結構的探針可以實現(xiàn)高對比度成像,區(qū)分細菌感染細胞和無菌細胞。在FDAA中D-Ala是最廣泛使用的熒光探針,因為D-Ala是PG肽鏈第4和第5位的天然殘基,因此可以減弱FDAA標記PG的潛在空間位阻更容易整合到PG當中。Liu[59]通過將AIE光敏劑吡啶取代四苯基乙烯(TPEPy)與D-Ala結合構建出代謝標記性熒光探針TPEPy-d-Ala(圖11A),當一旦代謝結合到細菌肽聚糖中,TPEPy-d-Ala的分子內(nèi)運動被抑制導致熒光信號增強,與此同時TPEPy-d-Ala具備光敏劑特異性可以在激發(fā)光下產(chǎn)生單線態(tài)氧,有效清除細胞內(nèi)細菌,更重要的是,由于結構中D-Ala和吡啶的親水性,使得TPEPy-d-Ala在細胞內(nèi)親水環(huán)境中弱發(fā)射,從而保證了較低的背景信號實現(xiàn)高信噪比成像。生物正交化學的快速發(fā)展為熒光探針的設計提供了新的思路。Berottzi[60]將含羅丹明的疊氮化物基團與硅原子修飾的羅丹明和環(huán)二烯基團D-Ala進行偶聯(lián)成功構建了一種基于氨基酸的細菌探針Si-Rhodamine(圖11B)。既含D-Ala的環(huán)二烯先作為丙氨酸供體被摻入PG中,隨后Si-Rhodamine通過點擊反應與D-Ala結合,一旦與環(huán)二烯反應后,Si-Rhodamine的熒光量子產(chǎn)率提高到48倍,且Si-Rhodamine比羅丹明具有更長的發(fā)射波長。體外細菌培養(yǎng)證明Si-Rhodamine能夠實現(xiàn)體內(nèi)細菌病原體感染的可視化成像。Tan[61]開發(fā)了一種基于近紅外二區(qū)(NIR-II)的代謝標記熒光探針(圖11C),該探針由D-炔丙基甘氨酸和IR-FGN的NIR-II熒光團組成。先將D-炔丙基甘氨酸灌胃給予取C57BL/6小鼠,間隔3 h后收集C57BL/6的盲腸微生物,清洗干凈后通過灌胃給與C57BL/6小鼠灌胃IR-FGN標記的菌群,并且NIR-II激發(fā)光下照射。移植了IR-FGN標記微生物群的C57BL/6小鼠模型腹部有清晰的熒光成像,當移植小鼠接受乙醇殺死IR-FGN標記微生物群時,熒光強度明顯下降,實驗結果證明IR-FGN可以實現(xiàn)小鼠體內(nèi)腸桿菌的可視化實時成像。

2.2.2 基于KDO合成途徑標記的細菌熒光探針研究進展

圖13A所示,脂多糖(LPS)由三種結構成分組成:最外層的多糖結構域為O抗原,核心結構域由糖和LipidA組成,其中LipidA是一種與幾種脂肪酸連接的磷酸化的氨基葡萄糖二糖。而3-脫氧-d-甘露-辛-酮糖酸(KDO)是LPS內(nèi)核的一種特異性和必需成分,長期以來被認為存在于幾乎所有革蘭氏陰性物種的LPS中[62-63],因此,熒光標記的KDO可以實現(xiàn)革蘭氏陰性菌的特異性識別成像[64]。

(A)LPS的結構;(B)KOD的合成途徑。

受到生物正交與點擊化學的啟發(fā),Vauzeilles[65]合成了疊氮化物基團偶聯(lián)類似物KDO和羅丹明與丁炔偶聯(lián)的熒光探針Rho-KDO(圖14A)。疊氮化的KDO可被革蘭氏陰性菌迅速吸收并結合到LPS中,隨后,羅丹明與丁炔偶聯(lián)的熒光團與LPS定位的KDO結合,使羅丹明對革蘭氏陰性菌實現(xiàn)特異性成像。無獨有偶,Liu[66]通過使用具有AIE特性的四苯基乙烯開發(fā)了一種基于生物正交的細菌探針TPEPA-KDO(圖14B)。在體外細菌實驗中,TPEPA不僅對革蘭氏陰性菌進行了出色的特異性熒光成像,而且利用四苯基乙烯的光敏劑特性,實現(xiàn)了對革蘭氏陰性細菌的特異性的診療一體化,綜上所述KDO是構建革蘭氏陰性細菌特異性識別熒光探針的理想化靶點。

3 總結與展望

在本文中,我們總結了目前用于細菌識別和可視化的熒光探針,包括基于細菌化學結合策略的探針和基于代謝途徑標記策略的探針,其中相當一部分已用于臨床實際細菌檢測和篩選新的抗生素。展望未來,熒光探針在細菌成像和監(jiān)測方面既有機遇,也有挑戰(zhàn)。雖然熒光探針可以實現(xiàn)對細菌的靈敏、快速的可視化,但其自身存在光漂白、聚集猝滅(ACQ)和激發(fā)光穿透深度有限等一系列缺點和缺陷,其中最困難的障礙之一可能是需要開發(fā)出易于穿透細菌細胞包膜的并且熒光發(fā)射信號強度高并且光穩(wěn)定的熒光團。一般來說,熒光探針由識別片段連接體和熒光基團組成,其中識別片段是必不可少的核心。生物化學和細菌細胞生物學的快速發(fā)展使我們對細胞的形態(tài)和分裂有了更深入的了解從而為高特異性與高靈敏度的細菌熒光探針的設計開發(fā)提供有效的理論基礎。總之,熒光探針在未來幾年將繼續(xù)蓬勃發(fā)展,并且在可預見的未來,熒光探針將在細菌成像、新型抗生素篩選、細菌診療一體化等方面發(fā)揮不可或缺的作用。