李 志,孟 茹,王淑琴,馬怡雋,沈秀英,郭志宏,朵 紅*

(1.青海大學(xué)/省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/青海省動物疫病病原診斷與綠色防控技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海西寧 810016;2．西寧市動物疫病預(yù)防控制中心,青海西寧 810003)

牛的環(huán)形泰勒蟲病是由璃眼蜱的蜱傳播的環(huán)形泰勒蟲寄生于牛的單核巨噬系統(tǒng)細(xì)胞和紅細(xì)胞而引起的血液原蟲病[1]。該病主要在熱帶和亞熱帶國家發(fā)生和流行,每年造成110多萬頭牛死亡,損失達(dá)數(shù)億美元[2]。在亞洲、非洲和南歐,大量的牛受到媒介蜱的感染;同時(shí)全球變暖造成媒介蜱分布范圍擴(kuò)大;再加上新發(fā)泰勒蟲病原的生物學(xué)特性和經(jīng)濟(jì)重要性并未闡明,從而使該病的發(fā)生與流行愈加嚴(yán)重[3-5]。盡管抗泰勒蟲藥物-布帕伐醌和細(xì)胞弱毒疫苗在預(yù)防和控制該病過程中發(fā)揮了重要作用,但是目前已出現(xiàn)布帕伐醌抗性蟲株,并且該疫苗需要冷鏈運(yùn)輸,同時(shí)疫苗免疫后宿主均為帶蟲狀態(tài)[6]。因此,亟需對蟲體分泌關(guān)鍵分子進(jìn)行深入、系統(tǒng)研究,以期獲得潛在藥物靶點(diǎn)或者疫苗候選分子。

與其他頂復(fù)門寄生蟲一樣,環(huán)形泰勒蟲也進(jìn)化出了復(fù)雜的策略,重塑其在宿主細(xì)胞中的生態(tài)位,從而實(shí)現(xiàn)增殖和生存。然而,這種由媒介蜱傳播的原蟲是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一類可誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞發(fā)生永生化的真核生物,因此又被稱為轉(zhuǎn)化型泰勒蟲。此類泰勒蟲還包括小泰勒蟲(T.parva)和萊氏泰勒蟲(T.lestoquardi)。目前研究最多的是環(huán)形泰勒蟲和小泰勒蟲,前者可轉(zhuǎn)化牛的巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞,而小泰勒蟲能使宿主的T和 B淋巴發(fā)生永生化。盡管小泰勒蟲和環(huán)形泰勒蟲都可使牛的B淋巴細(xì)胞發(fā)生永生化,但是這兩種蟲體轉(zhuǎn)化B細(xì)胞的機(jī)制是否一致仍有待探究。更重要的是,泰勒蟲裂殖體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有癌細(xì)胞的某些細(xì)胞表型,如無限增殖、能量代謝失調(diào)、入侵和轉(zhuǎn)移激活以及免疫逃逸[1]。在蟲體感染宿主后可將裂殖體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分離出來,進(jìn)而建立體外培養(yǎng)細(xì)胞系。因此,體外永生化細(xì)胞系極利于在細(xì)胞水平和分子水平對蟲體與宿主細(xì)胞的相互作用進(jìn)行研究。同時(shí),在體外用布帕伐醌處理泰勒蟲轉(zhuǎn)化的細(xì)胞后,伴隨寄生蟲的清除,宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化特性隨之消失,細(xì)胞停止增殖,恢復(fù)至正常的程序性凋亡,說明泰勒蟲誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化具有可逆性特征[2],這為研究胞內(nèi)寄生蟲與宿主細(xì)胞的相互作用提供了強(qiáng)有力的模型。Witschi M等通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定了環(huán)形泰勒蟲轉(zhuǎn)化巨噬細(xì)胞后蟲體蛋白組成,并對確定的蟲體蛋白進(jìn)行了分類和功能預(yù)測,為泰勒蟲-宿主細(xì)胞的互作關(guān)系和細(xì)胞永生化研究提供了重要數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。之前的研究主要集中在泰勒蟲劫持宿主細(xì)胞信號通路方面,尤其是細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)信號,如c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和宿主核因子c-Myc、核轉(zhuǎn)錄因子-κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB)和激活蛋白1(activator protein-1,AP-1)等[7-8]。在本研究中,我們聚焦于已知的環(huán)形泰勒蟲分泌蛋白與宿主細(xì)胞間的相互作用;并且這些已研究的分子可能是潛在的藥物靶標(biāo),甚至疫苗候選基因,從而為牛泰勒蟲病致病機(jī)制研究以及防控方面奠定基礎(chǔ)。

1 環(huán)形泰勒蟲表面蛋白

環(huán)形泰勒蟲表面蛋白(T.annulatasurface protein,TaSP)是一個(gè)單拷貝基因,在蟲體子孢子和裂殖體階段均有表達(dá)。該蛋白含有3個(gè)跨膜區(qū),且C端具有3個(gè)高度磷酸化的絲氨酸(S303,S304和S305),并且蟲體轉(zhuǎn)化細(xì)胞S期S303和S305的磷酸化程度遠(yuǎn)高于M期[9]。TaSP與宿主細(xì)胞的微管蛋白α和γ均發(fā)生相互作用,這表明該分子可能參與微管組裝,從而在調(diào)控細(xì)胞有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用。此外,近期研究發(fā)現(xiàn),TaSP可與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin dependent kinase 1,CDK1)結(jié)合;用CDK1抑制劑處理環(huán)形泰勒蟲感染細(xì)胞后,可抑制蟲體增殖,說明該蛋白可能參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化[10]。除與宿主細(xì)胞發(fā)生相互作用外,該基因也是環(huán)形泰勒蟲病的診斷標(biāo)識和亞單位疫苗候選分子[6]。

2 環(huán)形泰勒蟲裂殖體表面蛋白p104

環(huán)形泰勒蟲裂殖體表面蛋白p104(T.annulatamajor schizont surface protein p104,Ta-p104)主要定位于環(huán)形泰勒蟲的微線體。該分子結(jié)構(gòu)高度無序,富含脯氨酸,含有SxIP、SH3基序以及泰勒蟲感染的高頻率結(jié)構(gòu)域(domain of frequently associated inTheileriainfection,FAINT)。Woods K等[11]證明,Ta-p104將宿主末端結(jié)合蛋白1(end binding protein 1,EB1),蛋白招募至裂殖體表面,使其磷酸化進(jìn)而調(diào)控微管動態(tài);也發(fā)現(xiàn)宿主CLIP-170相關(guān)蛋白1(CLIP-170-associating protein 1,CLASP1)[12]、CD2相關(guān)蛋白(CD2 associated protein,CD2AP)[13]也與Ta-p104發(fā)生相互作用。盡管已發(fā)現(xiàn),蟲體分子Ta-p104、TaSP與宿主細(xì)胞微管具有緊密的關(guān)聯(lián),但是仍有許多問題有待解釋,如在蟲體感染的細(xì)胞中細(xì)胞分裂如何調(diào)控?盡管蟲體增殖與宿主細(xì)胞分裂周期同步[32],但是宿主細(xì)胞有絲分裂過程中是否驅(qū)動蟲體DNA的合成?在泰勒蟲轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞過程中可引起JNK信號通路持續(xù)激活,其中Ta-p104招募JNK2至裂殖體表面,形成復(fù)合體,抑制JNK2的功能,進(jìn)而促進(jìn)蟲體增殖[14]。但是,該分子是否操控其他宿主細(xì)胞信號,進(jìn)而維持細(xì)胞永生化狀態(tài)尚不清楚。

3 環(huán)形泰勒蟲脯氨酰異構(gòu)酶1

環(huán)形泰勒蟲脯氨酰異構(gòu)酶1(T.annulataprolyl isomerase 1,TaPin1)是一個(gè)高度保守的分子,該蛋白具有肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域,分布于宿主細(xì)胞的胞漿和細(xì)胞核中;研究發(fā)現(xiàn),TaPin1分子主要調(diào)控宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子c-Jun和缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1 subunit alpha,HIF1α),進(jìn)而引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化:1)TaPin1通過劫持含F(xiàn)-box/WT重復(fù)域蛋白7(F-box/WD repeat-containing protein 7,FBW7)泛素連接酶,激活c-Jun轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控onco-miR-155表達(dá),促進(jìn)宿主細(xì)胞增殖[7,15];2)TaPin1通過穩(wěn)定M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase isoform M2,PKM2),激活HIF1α因子,促使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)和己糖激酶(Hexokinase 2,HK2)表達(dá),從而影響宿主細(xì)胞表型[2,16-17]。但是,TaPin1穩(wěn)定宿主PKM2蛋白以及降解FBW7的分子機(jī)制尚不清楚。

4 環(huán)形泰勒蟲富含脯氨酸的微管和SH域互作蛋白

環(huán)形泰勒蟲富含脯氨酸的微管和SH域互作蛋白(T.annulataproline rich microtubule and SH-domain interaction protein,TaMISHIP)只在轉(zhuǎn)化型泰勒蟲中表達(dá),含有一個(gè)信號肽序列和蛋白裂解位點(diǎn),以及兩個(gè)核定位信號序列和一個(gè)核輸出信號序列[3,18]。在蟲體子孢子階段,TaMISHIP與p104部分共定位;在裂殖體階段,TaMISHIP分子以點(diǎn)狀形式表達(dá),且與p104分布緊密相連[12]。Pull Down實(shí)驗(yàn)證明TaMISHIP與宿主CD2AP、CLASP1結(jié)合,同時(shí)免疫沉淀方法證實(shí)該分子與宿主EB1也存在較弱的相互作用[3,13,18]。因此,蟲體與宿主細(xì)胞互作的復(fù)合物(EB1/CLASP1/p104/TaMISHIP/CD2AP)可能會通過其他方式招募宿主細(xì)胞分子至裂殖體表面,進(jìn)而調(diào)控宿主細(xì)胞功能。

5 環(huán)形泰勒蟲GPI錨定裂殖體蛋白34

環(huán)形泰勒蟲GPI錨定裂殖體蛋白34 (T.annulataGPI anchored schizont protein34,Tagp34)是泰勒蟲所獨(dú)有的分子,因其蛋白分子質(zhì)量為34 ku而得名。該分子是一個(gè)GPI錨定蛋白,以點(diǎn)狀形式分布于小泰勒蟲和環(huán)形泰勒蟲裂殖體表面。和TaMISHIP一樣,gp34在蟲體感染和未感染細(xì)胞中都可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,誘導(dǎo)細(xì)胞雙核化[18]。而在COS7細(xì)胞中,過表達(dá)gp34時(shí),發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于細(xì)胞中體和中央紡錘體,說明其可與微管發(fā)生結(jié)合[3]。有數(shù)據(jù)證明,gp34是微管調(diào)節(jié)器復(fù)合體CLASP1和EB1的組分,表明這兩種蛋白可能在宿主細(xì)胞分裂過程中發(fā)揮作用。Huber S等[13]證明,gp34與宿主細(xì)胞CD2AP發(fā)生相互作用,進(jìn)而影響蟲體入侵。弓形蟲可重新排列宿主的微管網(wǎng)絡(luò),以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的重新排列,以利于蟲體生存[18]。雖然此結(jié)論尚未在泰勒蟲感染的細(xì)胞中得到證實(shí),但是某些蟲體分子有可能對宿主細(xì)胞器,例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體或內(nèi)溶酶體囊泡進(jìn)行招募,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其增殖。

6 環(huán)形泰勒蟲分泌蛋白

環(huán)形泰勒蟲分泌蛋白(T.annulatasecretory protein,TaSE)在轉(zhuǎn)化型泰勒蟲都有表達(dá),是一個(gè)保守的單拷貝基因。該基因只在裂殖體和梨形蟲階段表達(dá),而在子孢子階段并不表達(dá)。而在裂殖體階段,該蛋白在裂殖體內(nèi)外層均有分布,并且在裂殖體表面表達(dá)[3]。TaSE可與宿主微管蛋白α-tubulin發(fā)生結(jié)合,因此TaSE可能在寄生蟲和宿主細(xì)胞中都發(fā)揮著作用。

7 環(huán)形泰勒蟲半胱氨酸蛋白酶

在頂復(fù)門寄生蟲中,半胱氨酸蛋白酶是一個(gè)蛋白酶家族,分為9個(gè)亞類,可能在寄生蟲毒力、宿主入侵、營養(yǎng)和宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在環(huán)形泰勒蟲中,其半胱氨酸蛋白酶(T.annulatacysteine proteinase,TaCP)被歸類為C1家族,C1A亞家族,并且在其催化中心無半胱氨酸殘基。Zhao S等[19]通過酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn),TaCP可與宿主B細(xì)胞腦膜轉(zhuǎn)錄因X2 (cereblon transcript variant X2,CRBN)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶4C(protein serine/threonine protein phosphatase 4,PPP4C)都發(fā)生相互作用,并表明TaCP可能參與調(diào)控宿主信號通路,但其具體機(jī)制尚不清楚。同時(shí),該蛋白是否與宿主細(xì)胞其他分子發(fā)生結(jié)合仍有待解析。

8 環(huán)形泰勒蟲環(huán)孢素蛋白1

與TaPin1一樣,該蛋白是泰勒蟲基因組中的另一個(gè)脯氨酸異構(gòu)酶,只存在于轉(zhuǎn)化型泰勒蟲。該蛋白含有228個(gè)氨基酸,在其 N端含有一個(gè)信號肽序列和一個(gè)異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該蛋白主要分布于環(huán)形泰勒蟲裂殖體周圍[20],表明其可與宿主細(xì)胞發(fā)生互作。酵母雙雜交和Pull Down 技術(shù)證實(shí),環(huán)形泰勒蟲環(huán)孢素蛋白1(T.annulatacyclophilin1,TaCyp1)與宿主RNA聚合酶II亞單位21中介體(mediator of RNA polymerase II transcription subunit 21,MED21)蛋白發(fā)生直接相互作用,并且在蟲體感染細(xì)胞中,通過SiRNA干擾宿主分子后,宿主細(xì)胞中NF-κB1/κB2 轉(zhuǎn)錄水平顯著下降,而P105和P52基因水平并未發(fā)生變化[20],說明其他分子可能參與MED21的調(diào)控。但是TaCyp1分子在宿主細(xì)胞永生化過程中的分子基礎(chǔ)仍是未知的。

9 環(huán)形泰勒蟲亞端粒編碼的可變蛋白多基因家族

小泰勒蟲和環(huán)形泰勒蟲基因組含有四條染色體,其中小泰勒蟲基因組大小為8.3 mb,而環(huán)形泰勒蟲基因組大小為8.5 mb;并且,在這兩個(gè)轉(zhuǎn)化型泰勒蟲存在一個(gè)多基因家族,即環(huán)形泰勒蟲亞端粒編碼的可變蛋白多基因家族(T.annulatasubtelomere-encoded variable secreted proteins multigene family,TaSVSP-family)家族,此家族是泰勒蟲基因組中最大的基因家族。在小泰勒蟲中,該家族含有85個(gè)基因;而在環(huán)形泰勒蟲中SVSP家族具有51個(gè)成員,重要的是,該家族基因具有進(jìn)化中立、非典型密碼子使用、核酸序列高度缺失和插入的特征,這就意味著SVSP分子間結(jié)構(gòu)具有較大差異,可能參與不同的生物學(xué)過程。同時(shí),先前研究發(fā)現(xiàn),該基因家族大部分基因含有信號肽序列、PEST基序以及FAINT結(jié)構(gòu)域,并且主要在蟲體裂殖體階段表達(dá),這表明其可能在宿主細(xì)胞永生化過程中扮演重要角色。在U2OS細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染小泰勒蟲SVSP基因(TP03-0882)后,發(fā)現(xiàn)其分布于細(xì)胞核,但在蟲體感染細(xì)胞中,并未檢測到該分子,說明該分子可能存在某種體內(nèi)降解機(jī)制。關(guān)于該家族基因是否與宿主細(xì)胞發(fā)生互作及其作用機(jī)制研究很少,目前我們在環(huán)形泰勒蟲中發(fā)現(xiàn),SVSP449、SVSP454和SVSP455分子主要表達(dá)于蟲體裂殖體階段,并且在環(huán)形泰勒蟲感染細(xì)胞的細(xì)胞核和胞漿中都有分布[21],說明上述分子可能與宿主細(xì)胞蛋白結(jié)合,從而執(zhí)行其生物學(xué)功能。我們研究發(fā)現(xiàn),蟲體分子SVSP449與宿主細(xì)胞X-鏈接2-樣RNA結(jié)合基序(RBMX2-Like:RNA binding motif protein-X-linked 2-like,RBMX2-Like)蛋白發(fā)生互作[22];SVSP454蛋白與宿主分子卷曲螺旋域181(coiled-coil domain 181,CCDC181)和線粒體核糖體蛋白L30(mitochondrial ribosomal protein L30,MRPL30)均具有相互作用[23];同時(shí),也證明SVSP455與宿主細(xì)胞熱休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)發(fā)生相互作用,進(jìn)而調(diào)控線粒體信號通路,有助于蟲體生存[24]。雖對蟲體幾個(gè)SVSP蛋白與宿主細(xì)胞互作進(jìn)行了探究,但是這些分子在泰勒蟲誘導(dǎo)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的分子機(jī)制并不清楚。

10 環(huán)形泰勒蟲裂殖體AT-hook蛋白家族

環(huán)形泰勒蟲裂殖體AT-hook蛋白家族(T.annulata schizont AT-hook protein family,TashAT-family)含有17個(gè)基因,并且預(yù)測發(fā)現(xiàn)很多TashAT蛋白含有信號肽序列、DNA結(jié)合基序、核定位信號和FAINT結(jié)構(gòu)域。蟲體分泌的一些TashAT蛋白定位于宿主細(xì)胞核中,并且發(fā)現(xiàn)TashAT2蛋白可調(diào)控宿主細(xì)胞干擾素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)表達(dá)。在環(huán)形泰勒蟲中,TashAT的DNA結(jié)合域序列具有高度的一致性。然而,在小泰勒蟲中并未發(fā)現(xiàn)DNA結(jié)合域同系物。那么在這兩種蟲體中這些蛋白是否與宿主細(xì)胞結(jié)合?在功能上是否存在差異?以及這些結(jié)構(gòu)域在宿主細(xì)胞表型中扮演怎樣角色?這些問題仍有待深入研究。

11 展望

在泰勒蟲與宿主細(xì)胞互作研究中,一直存在著一個(gè)令人著迷的問題:哪些寄生蟲分子(蛋白、脂質(zhì)、RNA、其他因子)直接參與,或者對宿主細(xì)胞癌樣化表型是必需的?盡管目前已解析了某些蟲體分子可通過劫持宿主細(xì)胞信號進(jìn)而維持永生化狀態(tài),但是這只是蟲體功能蛋白的冰山一角。同時(shí),截至目前環(huán)形泰勒蟲中仍有近一半基因功能是未知的。因此,需結(jié)合先進(jìn)的生物學(xué)方法,如液相色譜-質(zhì)譜、高通量功能基因篩選技術(shù)以及生物物理學(xué)方法,同時(shí),結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù),如AlphaFold2等對環(huán)形泰勒蟲編碼蛋白進(jìn)行深入分析與研究。更重要的是,建立環(huán)形泰勒蟲的Crispr-Cas基因編輯系統(tǒng)可為病原基因功能研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)工具,可精確解析蟲體關(guān)鍵分子在病原-宿主互作以及致病機(jī)制中的分子基礎(chǔ),同時(shí)為疫苗研發(fā)提供關(guān)鍵候選分子。