溫麗翠,李才善,葛曉敏,吐熱古麗·阿力木,劉凱強,特列克·庫拉別克,巴音查汗·蓋力克

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

馬泰勒蟲(Theileiaequi)隸屬于泰勒科(Theileriidae)泰勒屬(Theileia),與馬駑巴貝斯蟲共屬馬梨形蟲,是寄生在馬屬動物的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和紅細胞內(nèi)的一種蜱傳血液原蟲[1],也是導(dǎo)致馬梨形蟲病的主要病原[2],但馬泰勒蟲的危害遠高于馬駑巴貝斯蟲[3]。感染馬泰勒蟲的馬匹會表現(xiàn)出食欲下降,體溫升高,黏膜充血,精神不振的臨床癥狀,若不及時治療,則會出現(xiàn)腹瀉,腸絞痛,嚴(yán)重時,會發(fā)生心律失常,共濟失調(diào)、癲癇等病癥。馬泰勒蟲病多呈急性經(jīng)過,發(fā)病率和病死率較高[4],尤其對外來引進的馬屬動物危害更大,是制約發(fā)展中國家馬屬動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的原蟲病之一[5]。

馬泰勒蟲病在不同的國家流行程度不同。例如,SANT C[6]等人通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)方法對特立尼達的111匹馬進行馬泰勒蟲檢測,發(fā)現(xiàn)有24.3%的馬被感染;Torres R[7]等人利用套式PCR方法對智利賽馬場的457個樣本進行馬泰勒蟲檢測,其感染率高達53.6%;Salas D R[8]等人通過PCR方法對墨西哥韋拉克魯斯州馬的100份樣本進行檢測,結(jié)果顯示有18.0%的馬中存在T.equi。馬匹感染馬泰勒蟲后成為無癥狀病原攜帶者,制約它們的跨境活動。我國馬匹數(shù)量位居世界第二,近年來,關(guān)于馬泰勒蟲流行病學(xué)的報道增多。在國內(nèi),孫秀濤[9]對廣西省部分馬匹進行了T.equi的相關(guān)報道。新疆地區(qū)馬術(shù)運動蓬勃發(fā)展,為促進國內(nèi)馬匹種類繁育發(fā)展搭建了平臺,但馬泰勒蟲病一直是阻礙當(dāng)?shù)伛R產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的一種不可忽視的地方病[10]。新疆伊犁是全國重要的運動馬及傳統(tǒng)馬的輸出基地之一[11],也是伊犁馬主產(chǎn)區(qū)[12]。馬泰勒蟲病在伊犁地區(qū)也是常見的家畜原蟲病。據(jù)文獻記載,2017年楊紅霞[13]等人的報道了馬泰勒蟲病導(dǎo)致伊犁一孕馬死亡。2022年史倩云[14]等人在昭蘇采樣過程中也發(fā)現(xiàn)了一例馬泰勒蟲病例。

由上述報道可知,馬泰勒蟲病在世界范圍內(nèi)各地區(qū)流行,在新疆的部分地區(qū)也時有發(fā)生,但是關(guān)于馬泰勒蟲病在旅游景點的報道及馬泰勒蟲基因型的研究較少,因此,本研究對在烏魯木齊周邊某旅游景點發(fā)現(xiàn)的一例疑似馬泰勒蟲病的病例進行血涂片檢查和PCR檢測,并從基因?qū)用嫣接懥宋覈鸟R泰勒蟲病基因型類型,旨在為馬泰勒蟲基因型致病性的防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 2022年5月,烏魯木齊周邊某旅游景點出現(xiàn)一匹在2021年9月份左右,從伊犁昭蘇某團場購入的6歲母馬發(fā)病。采集疑似患馬的耳緣靜脈血和全血。主訴:此馬于3個月前出現(xiàn)發(fā)燒,鼻流黃白色鼻涕并伴有出血,排尿呈紅黃色,食欲減退,精神萎靡,血液稀薄,黏性下降。

1.1.2 主要試劑 血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒,購自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司;PCR試劑,購自北京鼎國昌盛生物公司;快速吉姆薩染色試劑盒,購自上海生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 主要儀器 體式顯微鏡(M205A型),德國Leica公司產(chǎn)品;生物顯微鏡(ECLIPSE E200型),日本Nikon公司產(chǎn)品;電泳儀(DYY-6C),北京六一生物科技有限公司;凝膠成像儀(GelDocXR型),美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;電子天平(PL303 型),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀診斷 視診觀察患病馬匹的精神狀態(tài),飲食,排糞、排尿情況,觸診結(jié)膜有無充血或黃染,軀體是否出現(xiàn)水腫,并給患馬測量體溫。

1.2.2 血涂片檢查 從耳緣靜脈采集血液,滴在干凈載玻片上,用另一玻片推展成薄膜。按照瑞士染液說明書方法進行染色。染色后將血涂片自然晾干,滴香柏油在油鏡下觀察。

1.2.3 馬泰勒蟲18S rRNA基因檢測 參照血液/細胞/組織基因組提取試劑盒操作說明書提取患馬核酸,置-20 ℃冰箱備用保存。引物參照羅金等[15]擴增馬泰勒蟲18S rRNA基因目的片段使用的引物,進行本病例馬泰勒蟲病的PCR檢測。具體的引物信息為F:5′-TTTGGGCTGTTTACAGTTGC-3′;R:5′-CCTCAAAGTAAACGTCG- TCATG-3′,引物合成委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司進行。采用13 μL反應(yīng)體系,以獲得的DNA為模板,進行PCR擴增。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃/53 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,循環(huán)次數(shù)30;72 ℃再延伸,10 min,PCR體系設(shè)立如表1。

表1 PCR反應(yīng)體系Table 1 Reaction system of PCR

1.2.4 馬泰勒蟲基因型分析 參考Ratzon D K[16]等人基于18S rRNA進行馬泰勒蟲基因型分析的序列信息,以牛環(huán)形泰勒18S rRNA基因(登錄號:JQ743636)為外群,使用MAFFT V7.487進行序列比對,以Trimal V 1.2rev59中的參數(shù)-Automated1進行序列裁剪,使用MEGA X篩選最佳模型為K2+G,以最大似然法(Maximum Likelihood,ML),Bootstrap=1000進行基于馬泰勒蟲18S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 患馬臨床檢查

經(jīng)診斷發(fā)現(xiàn),患病馬匹體溫升高(41.2 ℃)、不食、精神沉郁、呼吸急促、流鼻涕、伴有貧血、比較消瘦、被毛雜亂無光,在其鬃毛處發(fā)現(xiàn)疑似蜱蟲叮咬的痕跡。

2.2 血涂片

通過瑞士染色發(fā)現(xiàn)紫色的圓形類蟲體(圓環(huán)形、橢圓形),頂端呈現(xiàn)點狀的紫色,中間呈現(xiàn)空心圓狀,為馬泰勒蟲,結(jié)果見圖1。

圖1 馬泰勒蟲血涂片(×1 000)Fig.1 The blood smear of T.equi(×1 000)

2.3 馬泰勒蟲18S rRNA檢測

經(jīng)PCR擴增后,將提取的患馬核酸一組3個重復(fù),1個陰性對照。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果,在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)512 bp大小的目的片段,結(jié)果見圖2。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～3.馬泰勒蟲PCR產(chǎn)物;4.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000; 1-3.T.equi PCR products; 4.Negative control圖2 馬泰勒蟲18S RNA序列擴增結(jié)果Fig.2 18S rRNA sequence amplification result of T.equi

2.4 馬泰勒蟲基因型結(jié)果分析

以先前進行馬泰勒蟲A、B、C、D、E基因型分型的序列為參考,馬泰勒蟲基因型分析發(fā)現(xiàn),新疆伊犁馬主產(chǎn)區(qū)馬泰勒蟲的基因型以A 型和E 型為主。C和D基因組同聚一大支,親緣關(guān)系較近,B和E基因型聚為一支親緣關(guān)系較近,而A基因型相對獨立。進一步研究發(fā)現(xiàn)我國周邊國家馬泰勒蟲基因型屬于E型,其中哈薩克斯坦株(MN857677),沙特阿拉伯株(LC431546),俄羅斯株(MG551915),西班牙株(AY534882)和甘肅株(MH651217)5個地區(qū)都聚集在E基因型,新疆尼勒克株(ON384628)與俄羅斯株(MG551915)聚為一支,親緣關(guān)系較近,昭蘇株(OL589499)等疆內(nèi)馬泰勒蟲也匯聚在E型,本研究檢測出該患馬的馬泰勒蟲屬A型,與其同源性較高的,隸屬新疆伊犁地區(qū)的昭蘇、尼勒克等地的代表性馬泰勒蟲屬E型,未見有屬B、C、D基因型的序列。具體見圖3。

3 討論

馬泰勒蟲是由中間宿主蜱傳播,寄生于馬屬動物紅細胞內(nèi)的血液原蟲,分布廣泛[17]。在養(yǎng)殖牧馬和賽馬的地區(qū),馬泰勒蟲病普遍流行,嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展及畜產(chǎn)品生產(chǎn)。本文探究了伊犁馬主產(chǎn)區(qū)馬泰勒蟲基因型類型及分布情況,對烏市周邊某旅游景點一例疑似感染馬泰勒蟲病的馬匹進行診斷及基因型析,綜合確診該馬患有馬泰勒蟲病,新疆伊犁馬主產(chǎn)區(qū)馬泰勒蟲基因型為A型和E型,E型居多,隸屬新疆伊犁地區(qū)的昭蘇、尼勒克等地的代表性馬泰勒蟲屬E型,未見有屬B、C、D基因型的序列。此外,我國周邊國家哈薩克斯坦株,沙特阿拉伯株,俄羅斯株,西班牙株和甘肅株5個地區(qū)都聚集在E基因型?；谶@些主要流行基因型的研究,對于開發(fā)馬泰勒蟲病新的診斷工具和疫苗起關(guān)鍵作用。烏市某旅游景點產(chǎn)生馬泰勒蟲病是由于基層人員對該病的防控意識不足,對該病的治療也沒有較好的治療辦法,一旦有新出生馬匹或外來馬匹引入該地區(qū)時,則極易發(fā)生急性感染,嚴(yán)重時患畜可能直接死亡,從而對該景區(qū)造成極大的經(jīng)濟損失。

馬泰勒蟲病尚無特效疫苗可用,主要以預(yù)防為主。防治本病的關(guān)鍵在于消滅馬體表和周圍環(huán)境中的硬蜱,切斷傳播途徑[18]。在蜱的活躍季節(jié),采用人工滅蜱和藥物滅蜱相結(jié)合的方法,經(jīng)常檢查畜體體表,定期對畜體體表和圈舍徹底噴灑消毒。對外來馬匹要嚴(yán)格進行檢疫,防止帶蟲馬進入。上述建議可以為旅游景點馬泰勒蟲的防治提供參考,必要時結(jié)合藥物治療。常用防治梨形蟲病的藥物主要以西藥為主,此外,中藥因安全環(huán)保、低耐藥性的特點也被廣泛應(yīng)用于梨形蟲病的防治。然而,患病馬匹即使后期治療也可能成為新宿主,作為傳染源傳播給其他馬屬動物。因此,在治療過程,除了對癥治療外,應(yīng)更加重視臨床治愈后的護理,同時增強馬匹自身的抵抗力。本研究可為新疆伊犁馬主產(chǎn)區(qū)馬泰勒蟲遺傳進化分析及基因型與治病特性間關(guān)系研究提供理論依據(jù),在今后馬匹飼養(yǎng)管理中,可根據(jù)本文提供方法進行馬泰勒蟲病的預(yù)防,為大城市旅游健康發(fā)展提供指導(dǎo)意義。