陳昱光,李云香,王 嬋,李劍南,賀 鑫,雷安民

(西北農林科技大學動物醫(yī)學院,陜西楊凌 712100)

根據美國農業(yè)部(USDA)發(fā)布的數據顯示,2021年世界生豬存欄量為74928萬頭,比2020年上升了15.16%;世界豬肉產量為10 610萬t,與2020年相比上升10.81%;預計在未來的幾年里,生豬的需求量將繼續(xù)增長。為了滿足市場的需求,除了擴大養(yǎng)殖規(guī)模外,對豬種進行不斷地改良更應是努力的方向,在相同的養(yǎng)殖規(guī)模下,優(yōu)良的豬種飼料轉化率高、出肉率高,這意味著減少了過量的飼料需求和糞便產生對環(huán)境的負面影響[1]。作為可以幫助生豬養(yǎng)殖業(yè)改良生豬性狀、提高生產效益、維護生豬遺傳多樣性的關鍵輔助技術,豬精液的冷凍保存一直是研究的重點和難點。

相較于液體保存的精液,冷凍保存的精液具有生物安全性、使用的靈活性以及國際貿易的優(yōu)勢,因此在理想情況下,冷凍保存的精液是豬授精的第一選擇。此外,豬精子的冷凍保存技術也是長期保留高價值遺傳資源的關鍵技術。但在豬冷凍保存精液的使用中發(fā)現,復蘇后精子存活率較低、質量較差,這導致了在實際生產中出現授精率低、每胎產仔數達不到正常標準等問題,同時由于冷凍復蘇后精子受損的影響,也難以保證能否完整保存優(yōu)良種畜的性狀,因此大大妨礙了冷凍保存技術在實際生產中的應用[2]。

1 豬凍精技術的應用現狀

1.1 人工授精

人工授精是目前應用最廣泛的豬育種技術,在發(fā)達國家育種方案中的應用率達90%以上[3]。最常用于人工授精的是液體儲存的精液(包括低溫保存的精液或鮮精),其繁殖性能較好,繁殖率高于90%,每頭授精成功的母豬活產仔數可達到12頭以上,與自然交配后獲得的效果相似。

人工授精也可以用冷凍保存的豬精子,盡管冷凍復蘇后精液的受精能力要比液體儲存的精液低得多。由于豬精子細胞膜成分的特殊性,導致其冷凍復蘇后豬精子復蘇率和質量遠低于牛、羊等其他大型牲畜,因此難以在生產上得到廣泛應用。制約豬精液凍存技術發(fā)展關鍵因素在于,目前冷凍復蘇機制豬精子損傷的機制并不完善,因此難以針對化的改良豬精液凍存配方[4]。

目前,養(yǎng)豬業(yè)的人工授精主要依賴于液體儲存的精液。雖然冷凍精子在某些情況下也被使用,但全球豬基因交換的主要方法仍是通過活體動物的運輸。運輸活體動物的成本相對較高,還需要花費疾病預防測量等相關檢疫費用,這限制了豬遺傳信息在全球范圍內的交換。而通過運輸冷凍保存的豬精液,可以將成本和風險降至最低。

1.2 凍精技術

目前已有公司建立了豬精子冷凍保存的商品化方案,針對主流豬種,可以使復蘇后精子活率達到76%～85%,但其妊娠率和每窩仔豬數量仍達不到鮮精的標準,不足以在生產實際中進行大范圍應用,特別是中國地方豬種,其凍精復蘇后存活率往往不足40%,這對我國的育種保種進程有一定的限制[5]。同時研究發(fā)現公豬之間個體的差異性對復蘇后精子活力和質量影響顯著。收集并冷凍長白豬的精液時,觀察到存在30%公豬的精液在復蘇后表現出非常低的活力。此外,即使是同一頭豬,在不同的時間、年齡、季節(jié)對其精液的冷凍保存,復蘇后也觀察到精液質量存在顯著差異。

1.3 種質資源的交換與保護

長期以來的市場需求決定了生豬養(yǎng)殖業(yè)對于料重比高、生長速度快、瘦肉率高的豬種的追求,導致了養(yǎng)殖企業(yè)對于品種豬的盲目引進與雜交利用,極不利于豬種遺傳資源的保存與生態(tài)多樣性的維護。探索出優(yōu)良的豬精子冷凍技術與方案,能夠大大降低優(yōu)良品種豬的引進成本,同時也可以有效保存現有的各類豬種的種質資源。因此,豬凍精技術的建立,是加強全國豬種遺傳資源保護、引進優(yōu)良豬種及優(yōu)良種豬育種的必要手段,是保證全國養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)發(fā)展的基礎和必要條件。

2 豬精子損傷機制的研究

2.1 凍融致豬精子損傷

冷凍復蘇過程包括一系列可能改變細胞結構的步驟,會導致細胞膜受損、膽固醇流失、獲能樣變化以及DNA碎片化,還可能破壞二硫鍵導致核蛋白結構穩(wěn)定性降低[9]。除了冷凍介質、溫度和滲透壓變化引起的負面影響外,冷凍復蘇過程還會造成細胞內ROS失衡,引發(fā)脂質過氧化,使細胞發(fā)生凋亡樣變化和DNA氧化損傷[10]。此外,凍融過程會破壞線粒體等細胞器,降低這些細胞器的活性,從而影響精子活力[11]。線粒體損傷也增加了活性氧的產生,且造成活性氧水平的升高程度因物種而異。

豬精子經歷凍融后還會導致精子內肌動蛋白、絲裂霉素和溶質載體家族成員等關鍵蛋白的再分配和重新定位;損害膜離子通道相關蛋白的功能;并改變特定精子蛋白的酪氨酸磷酸化模式。

2.2 豬精子對ROS損傷敏感

與新鮮精液相比,低溫保存(17℃)的豬精子和冷凍豬精子的受精能力較低。這是由于處理過程中的化學和物理變化,會影響細胞內氧化平衡。豬精子內,高水平ROS產生的病理效應的關鍵要點是造成不飽和脂肪酸(PUFAs)的過氧化[13]。研究表明,豬精子的質膜上富含不飽和脂肪酸,當大量的碳碳鍵被ROS氧化就造成了精子內脂質過氧化反應,這將直接導致豬精子凋亡樣變化的出現[13]。

精子耐低溫性與質膜的組成直接相關,特別是膽固醇/磷脂比率和磷脂部分飽和脂肪酸的豐度,因為這些成分決定了精子的膜流動性。例如,牛精子比豬精子表現出更高的彈性,這歸因于牛精子中較高的膽固醇/磷脂比率(牛:0.45,野豬:0.26)和較低的蛋白質/磷脂比率(牛:0.80,野豬:1.26)[13]。豬精子細胞膜上含有大量的不飽和脂肪酸,更易在冷凍應激誘導的ROS代謝紊亂作用下發(fā)生脂質過氧化級聯反應,導致細胞膜損傷并發(fā)生鐵死亡,因此,豬精子質膜容易不穩(wěn)定,易失去選擇通過性,允許Ca2+、碳酸氫鹽和培養(yǎng)基成分進入胞內[13],破壞細胞內穩(wěn)態(tài),促進蛋白質和mRNA的降解,降低精子的存活率[14]。

2.3 可能存在的調控機制

根據研究顯示,細胞死亡過程通常受到不同基因的調控;例如,參與凋亡調控的一些關鍵基因是Caspases、TP53、FAS、BCL-2和BAX。調控鐵死亡的基因包括GPx4、Nrf2、LSH、TFR1和SLC7A11。細胞壞死受到LEF1、RIP1和RIP3的調控,最后,自噬進程受到ATG5、ATG7、DRAM3和TFEB基因的調控[14]。因此,針對性的用細胞死亡相應調控基因的激活或抑制劑可以有效誘導或抑制細胞死亡進程。

近年來的研究發(fā)現,冷凍復蘇所導致的細胞膜脂質過氧化失控與細胞鐵死亡過程聯系密切,是鐵死亡過程的重要一環(huán)。以往的研究通常會將凍存復蘇與豬精子凋亡聯系到一起,但最近的研究顯示,凍存復蘇并未引起豬精子內DNA片段化和Caspase激活等凋亡現象[15],且凋亡抑制劑并不能緩解豬精子凍存損傷,但鐵死亡抑制劑可以有效抑制膜脂質過氧化和精子死亡,或可以考慮冷凍復蘇過程誘導了豬精子細胞鐵死亡發(fā)生的可能性。

2.4 蛋白質組學與生物標志物制

精子功能驗證的黃金標準是使卵子成功受精并發(fā)育為可存活的胚胎。想要準確判斷冷凍精子的生殖潛能,需要更好地了解精子的功能。精子功能調控的分子機制對于優(yōu)化冷凍精子處理方式和維持其生育能力至關重要。大多數與受精相關的分子機制都依賴于蛋白質的功能,這使得蛋白質組學成為生殖生物學中最強大的研究工具。因此,對精液蛋白質組學的研究是了解精子功能生物學和分析受精能力受損原因的必要條件。導致冷凍豬精子受精能力受損的潛在分子機制還不明確,精液蛋白質組學在解決這一挑戰(zhàn)中可以發(fā)揮關鍵作用[29]。

精液蛋白,無論是來自精漿還是精子,都是衡量精子功能和生育能力潛在的生物標志物,因為它們在涉及到精子功能生物學的相關分子途徑中發(fā)揮著關鍵作用。精液蛋白的任何定性和定量的改變都可能導致精子受精能力的喪失。研究發(fā)現頂體蛋白、纖維連接蛋白、熱休克蛋白和電壓依賴的陰離子通道蛋白水平與精子的低溫耐受性呈正相關[16],而和三磷酸異構酶的蛋白水平呈負相關[29]。此外,評估冷凍保存對整個精子蛋白質組的影響也是優(yōu)化冷凍過程的必要條件。最近發(fā)表的兩項比較新鮮和冷凍復蘇公豬精子蛋白質組學的研究顯示,在新鮮精子和冷凍精子之間鑒定出41個定量不同的蛋白質,以及32個在超低溫保存過程經歷相關豐度變化的蛋白質[17]。這些結果清楚地表明,低溫保存重塑了公豬精子的相應蛋白質,這也與其他物種哺乳動物中進行的研究結論相符合[18]。以上的結果都為冷凍精子受損機制的研究提供了潛在的標志物。當然,在這些發(fā)現應用于該領域之前,必須進行相應的驗證,包括蛋白質印記(Western blot,WB)、ELISA等,以確保所鑒定的蛋白質可以作為可靠的生物標志物。

3 豬精子冷凍技術改善手段

3.1 前期處理時間

有研究表明,精子在收集后不立即冷凍,冷凍保存的結果會更好。冷凍前在15～17℃孵育持續(xù)3 h以上能夠優(yōu)化凍存效果,而這種優(yōu)化處理的最佳時間段是10～24 h[19]。這一時期可以通過平衡或維持精子的脂質結構,從而有助于質膜的穩(wěn)定。但精子在該時期變得更耐低溫的詳細機制仍未闡明,研究人員推測與熱應激相關的精子蛋白(如熱休克蛋白70)的磷酸化有關。

3.2 抗氧化劑

迄今為止,許多研究證實了在冷凍介質中補充抗氧化劑可以抵消ROS對精子的負面影響?，F階段絕大多數的研究集中于在豬精子冷凍介質中添加合成或天然抗氧化劑,這的確對維持豬精子功能產生了積極的作用。在整個精子冷凍復蘇的步驟中,精子會在每個不同的溫度變化階段,包括從室溫至17℃(冷凍前孵育階段)、17℃至4℃(冷卻步驟結束,冷凍步驟開始前)、從冷凍狀態(tài)至37℃(解凍后),重新達到熱平衡狀態(tài),在此過程中精子所處的液體環(huán)境和處理時間也有所不同,因此在開發(fā)新的精子冷凍復蘇策略時,可以考慮在孵育液、解凍液以及授精培養(yǎng)基也添加抗氧化劑來進一步優(yōu)化方案[20]。

3.3 冷凍保護劑

可滲透性冷凍保護劑有甘油、二甲基亞砜、乙二醇、甲醇、丙二醇和二甲基乙酰胺等[21]。其中甘油是豬精子的最佳滲透性冷凍保護劑,其最佳作用濃度在2%～3%之間[6]。蛋黃和乳糖則是最常見的不滲透性冷凍保護劑,用作豬精子的冷凍延長劑。在蛋黃提取物中發(fā)現的磷脂可以防止精子發(fā)生冷休克和Ca2+內流,而蛋黃的低密度脂蛋白部分表現出最好的低溫保護功能。此外,使用表面活性劑,如 Orvus ES Paste,可以促進蛋黃蛋白與質膜的相互作用,當與蛋黃共用時可以改善精子冷凍效果[22]。但需要注意的是冷凍保護劑在常溫下會對細胞的存活起到不利的影響,所以通常會在4℃平衡階段加入以減少毒害作用。

3.4 精漿

通常精漿會在冷凍保存前被移除,因為研究人員認為精漿的存在會降低精子復蘇后的存活率。然而,并不是所有來自精漿的蛋白質都對精子有害。有研究指出僅去除低分子量蛋白質(12～14 ku)可改善冷凍保存效果,而添加精漿中部分物質至冷凍介質中可增加冷凍精子的活力和膜完整性[23]。

復蘇后加入精漿是否對精子有利存在對立的結果。一些研究人員指出,精漿對復蘇后精子活力和膜完整性有積極影響,也有研究結果表明加入精漿后精子頂體和膜完整性下降[24]。這種矛盾的結果同樣也出現在對復蘇精子生殖性能的研究中,有研究表明復蘇后添加精漿可提高精子生殖性能[25],而另外一些研究則顯示這種處理無明顯差異甚至有不利影響。這些矛盾的結果可能歸因于添加精漿的比例,因為添加50%的精漿(復蘇后4 h精子活力30%)效果明顯比添加10%精漿(復蘇后4 h精子活力20%)要更好[25]。

3.5 凍精的儲存

雖然檢測同批次冷凍效果好和效果差的豬精液后發(fā)現其脂質過氧化水平和復蘇后ROS總量沒有顯著差異,但有報道稱液氮存儲會增加細胞內的ROS水平,這可能會對低溫保存樣品的壽命造成影響[26]。Li J等分別對冷凍儲存2年,4年和8年的同一批豬精液質量進行評估,并與早期復蘇結果(冷凍后15 d)進行比較。與冷凍后15 d復蘇的精子樣本相比,冷凍儲存4或8年的精子樣品中總精子活力有所下降。值得注意的是,研究結果表明多于2年的冷凍儲存時間會對豬精子運動能力造成不利影響,因此在做人工授精時需要額外增加精液數量[26]。

4 討論

目前用冷凍復蘇的公豬精子進行人工授精多是作為品種改良的手段在養(yǎng)殖場中小范圍使用[27]。豬精子冷凍保存的主要優(yōu)點是可以儲存來自優(yōu)良性狀公豬的遺傳物質;構建種質庫以防自然災害(如豬瘟導致的大面積撲殺)所造成的遺傳信息丟失;并且相較于鮮精和活體運輸,冷凍保存的豬精子極大地促進了優(yōu)良豬種遺傳信息在國際之間交流的同時,也具備更高的生物安全性[28]。相信在不久的將來,冷凍保存的精子在實踐生產中可以得到更廣泛的應用。

最新的研究進展顯示,冷凍復蘇的豬精子進行人工授精后的生育結果已經得到了改善,但迄今為止,最先進的凍精技術依然避免不了低溫保存對精子本身的負面影響,人工授精后效果達不到鮮精的標準。這主要是凍存致豬精子損傷的分子機制仍不明確所導致[29],未來豬精子凍存技術的改進,除了于冷凍精子所處液體環(huán)境中添加抗氧化劑外,或可將目光對準于凍存致精子細胞死亡的相關機理研究以及利用蛋白質組學技術闡明凍精受損的潛在分子機制上來。