王進(jìn)峰,李 穎,韓若龍,呂 妮,岳 登

(1.銅川市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,陜西銅川 727000;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100;3.銅川市農(nóng)業(yè)科技信息站,陜西銅川 727000)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)是一種革蘭氏陰性、無芽孢、無鞭毛的兼性厭氧的致病性短桿菌,呈兩極濃染,中間淺的特點(diǎn),屬于巴氏桿菌科巴氏桿菌屬細(xì)菌,它是危害養(yǎng)殖業(yè)的重要致病菌,能夠引起多種動(dòng)物出現(xiàn)呼吸道疾病,可感染豬、牛、羊、兔、雞等多種動(dòng)物和人,是一種重要的人獸共患病原菌[1]。

2022年11月陜西某奶山羊場羊出現(xiàn)精神沉郁,采食量減少,體溫升高,個(gè)別羊出現(xiàn)呼吸困難,嚴(yán)重者死亡,剖檢可見病死羊?qū)嵸|(zhì)器官變性,淋巴結(jié)腫大、充血,心包積液,含多量纖維素滲出物。本研究無菌采集病死奶山羊肝臟、肺臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、致病性試驗(yàn)及PCR鑒定,旨在為奶山羊疾病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料為2022年11月無菌采集于陜西一規(guī)?；躺窖驁霾∷滥躺窖虻姆闻K及肝臟組織。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 5周齡雄性昆明小鼠10只,體重25 g,購自西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 主要試劑 普通營養(yǎng)培養(yǎng)基,TSA營養(yǎng)培養(yǎng)基,血瓊脂培養(yǎng)基,南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品;厭氧肉肝湯,中海生物科技有限公司;DNA Marker DL 2 000,2×TaqMasterMix,南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品;各種染色試劑,細(xì)菌微量生化反應(yīng)管,抗菌素藥敏片,杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 SHA-X恒溫?fù)u床,上海智勝分析儀器制造有限公司產(chǎn)品;SW-CJ-IBU超凈工作臺(tái),上海博訊實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品;TC-5000 PCR儀,Techne有限公司產(chǎn)品;電泳儀(DYY-6C),北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;細(xì)菌濁度儀,杭州齊威儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與形態(tài)學(xué)觀察 將無菌采集的肝、肺組織病料接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基中,置37℃恒溫厭氧培養(yǎng)12 h后觀察菌落形態(tài)及生長情況;并挑取疑似菌落進(jìn)行染色鏡檢,觀察其染色情況及形態(tài)特征;用接種環(huán)挑取血瓊脂平板上疑似的單菌落,接種于厭氧肉肝湯培養(yǎng)管中,37℃恒溫培養(yǎng)12 h,對(duì)疑似菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

將培養(yǎng)菌株接種于TSA固體培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)12 h;同時(shí)接種于厭氧肉肝湯液體培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)12 h,分別觀察,并進(jìn)行革蘭氏染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察[2]。

1.2.2 生化試驗(yàn) 在無菌條件下,用接種環(huán)挑取TSA固體培養(yǎng)基上的典型菌落分別接種于葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、吲哚、氧化酶、硫化氫、尿素、甲基紅等生化培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)48 h,觀察記錄結(jié)果,并根據(jù)微生物鑒定系統(tǒng)說明書進(jìn)行鑒定。

1.2.3 16S rRNA基因的擴(kuò)增 挑取TSA瓊脂培養(yǎng)基上純培養(yǎng)的細(xì)菌,使用煮沸法提取細(xì)菌DNA;PCR反應(yīng)體系20 μL:2×TaqPCR MasterMix 10 μL,上、下游引物各1 μL(表1),DNA模板2 μL,ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收PCR產(chǎn)物,送至擎科生物工程(上海)股份有限公司測序,將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中參考菌株16S rRNA進(jìn)行Blast同源性比對(duì)。選取同源性較高菌株的16S rRNA基因序列,應(yīng)用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[3]。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 無菌挑取分離純化的細(xì)菌接種于TSB液體培養(yǎng)基上,置于37℃搖床中(180 r/min)培養(yǎng)12 h,吸取100 μL的菌液于TSB培養(yǎng)基上,并將其涂布均勻,然后用無菌鑷子將各種藥敏片分別平放在培養(yǎng)基表面, 保持紙片間距離適度,37℃溫箱培養(yǎng)24 h。觀察結(jié)果并測量抑菌圈直徑,根據(jù)抑菌圈直徑判定分離菌對(duì)藥物敏感性。抑菌環(huán)直徑判定依據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品說明書:抑菌圈直徑≥17 mm,為高度敏感;14 mm≥抑菌圈直徑<17 mm,為中高度敏感;抑菌圈直徑<14 mm,為耐藥。

1.2.5 小鼠致病性試驗(yàn) 將分離純化的細(xì)菌接種于血清肉湯培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h,通過平板計(jì)數(shù)并調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/mL,每個(gè)小鼠腹腔注射0.2 mL,注射5只小鼠,對(duì)照組小鼠注射等量的營養(yǎng)肉湯[4]。分別隔離飼養(yǎng)兩組小鼠,觀察小鼠臨床表現(xiàn),死亡小鼠及剖檢并觀察病理變化,無菌采集肺臟進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

從肝、肺組織中分離到1株菌,將分離純化的細(xì)菌接種于TSA培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出貧瘠的細(xì)小、透明、露滴狀菌落;在麥康凱培養(yǎng)基上不生長;在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長良好,呈現(xiàn)出白色、圓形、光滑水滴狀的小菌落;三糖鐵培養(yǎng)基上生長出較小菌落,且使三糖鐵培養(yǎng)基顏色變黃;在厭氧血清肉湯中,開始輕度混濁,4～6 d液體變清朗,管底出現(xiàn)黏稠沉淀,振搖后不分散,表面形成菌環(huán);革蘭氏染色鏡檢,分離菌均為紅色、兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌,,散在或成對(duì)存在,說明分離菌兼性厭氧。

2.2 生化試驗(yàn)

根據(jù)細(xì)菌微量生化反應(yīng)管試劑盒操作規(guī)范對(duì)分離菌進(jìn)行生化特性鑒定,葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、觸酶、鳥氨酸脫羧酶試劑管反應(yīng)均呈陽性,麥芽糖、乳糖、吲哚、枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素、甲基紅反應(yīng)均呈陰性。結(jié)果見表2,與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》中多殺性巴氏桿菌的生化特性一致,因此初步確定分離菌株為多殺性巴氏桿菌。

表2 分離株的生化特性Table 2 Biochemical characteristics of isolates

2.3 細(xì)菌16S rRNA基因序列分析結(jié)果

分離菌株16S rRNA PCR檢測,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示880 bp 左右的特異性條帶(圖1),與目的條帶大小一致。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列上傳GenBank,用Blast進(jìn)行對(duì)比,與多殺性巴氏桿菌(登錄號(hào):OQ253475)序列同源性為99%,綜合分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2),進(jìn)一步確定分離菌株為多殺性巴氏桿菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000;1.分離菌株;2,3.陽性對(duì)照;4.陰性對(duì)照M.DNA Marker DL 2000;1.Isolated strain; 2,3:Positive control; 4.Negative control圖1 菌株16S rRNA基因PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of strain 16S rRNA gene

YBS.本次試驗(yàn)所得分離菌株YBS.The isolate obtained in this test圖2 基于16S rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥物敏感性檢測結(jié)果見表3。分離菌對(duì)羧芐西林、哌拉西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮、慶大霉素等抗菌藥敏感,對(duì)青霉素、苯唑西林、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢拉定、四環(huán)素、多西環(huán)素、紅霉素等抗菌藥耐藥。

表3 分離菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果(抑菌圈直徑/mm)Table 1 The results of antimicrobial susceptibility test (inhibition zone diameter/mm)

2.5 小鼠致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)組小鼠接種分離菌株12 h出現(xiàn)精神沉郁、采食活動(dòng)減少、顫抖等臨床癥狀,24 h后小鼠全部死亡,對(duì)照組小鼠狀態(tài)良好。

對(duì)試驗(yàn)組小鼠進(jìn)行剖檢可見攻毒小鼠的肺臟出血嚴(yán)重,肝臟腫大并且有淤血、腹腔有纖維素液體滲出,對(duì)照組小鼠剖檢未見異常病理變化。對(duì)試驗(yàn)組小鼠肺臟和肝臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng),從中分離到該致病性菌株,而從對(duì)照組小鼠中未獲得,說明分離得到的多殺性巴氏桿菌具有致病性。

3 討論

多殺性巴氏桿菌是羊常見的細(xì)菌性病原菌,為革蘭陰性桿菌,需氧或兼性厭氧[5]。本菌作為一類條件性致病菌[6],具有潛伏能力強(qiáng)、養(yǎng)殖過程難以清除、人獸共患等諸多風(fēng)險(xiǎn),嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全并給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本菌可引起多種動(dòng)物呼吸道疾病[7],例如禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、兔鼻瘺和出血性敗血癥,它在同種或不同種動(dòng)物間也可相互感染,還可以通過動(dòng)物抓咬、皮膚損傷等感染人類。多殺性巴氏桿菌病潛伏期短、呈散發(fā)或地方性流行、傳播速度快、死亡率高。多發(fā)于牛羊[8],臨床癥狀主要表現(xiàn)為高熱、肺炎、內(nèi)臟器官廣泛性出血[9],幼齡羊感染后發(fā)病較嚴(yán)重,而成年羊多呈隱性感染[10],發(fā)病較少。幼羊剖檢病變主要為胸腔積液和肝臟淤血,有灰白色米粒大小的壞死灶等癥狀。

本研究從病死羊肝臟組織中分離到疑似致病菌。將分離菌進(jìn)行革蘭染色、生化特性鑒定并將其16S rRNA序列與羊多殺性巴氏桿菌屬同種的16S rRNA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示,其與OQ253475.1:24-743親緣關(guān)系最近,可確定其為多殺性巴氏桿菌;藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,可有效篩選出防治該菌株的抗生素。小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示試驗(yàn)組的小鼠全部死亡并出現(xiàn)肺炎癥狀,并且從肺組織中分離到相同的病原菌,說明分離菌株具有較強(qiáng)的致病性。本研究從奶山羊病例中分離到多殺性巴氏桿菌,并對(duì)其進(jìn)行了致病性和藥敏試驗(yàn),為羊多殺性巴氏桿菌病的防治提供參考。