馬雪，劉芷毓，邢云昆，姚碧云，傅娟玲，趙鵬

（1.浙江省疾病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 310051；2.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系，食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

苯并［a］芘（benzo［a］pyrene，BaP）屬于多環(huán)芳烴類化合物，廣泛存在于煙草煙霧及空氣、水和土壤等環(huán)境中，長(zhǎng)期暴露會(huì)導(dǎo)致肺癌等多種癌癥的發(fā)生［1-2］。BaP 經(jīng)代謝酶代謝生成二氫二醇、酚類、環(huán)氧化物和醌類等中間產(chǎn)物及終致癌物7，8-二氫二醇-9，10-環(huán)氧BaP 發(fā)揮毒作用，可能的機(jī)制涉及與芳烴受體結(jié)合，與DNA 結(jié)合導(dǎo)致遺傳損傷，引起微RNA（microRNA，miRNA）失調(diào)等表觀遺傳改變及干擾信號(hào)通路等［3-10］。Jin 等［11］提出了BaP 始于芳香受體活化，繼而經(jīng)不同關(guān)鍵事件誘發(fā)肺功能減退、肺纖維化和肺癌等肺損傷有害結(jié)局路徑。盡管BaP 致癌機(jī)制研究取得了一定進(jìn)展，但BaP 致癌的遺傳和表觀遺傳機(jī)制尚未闡明。

研究表明，miRNA表達(dá)失調(diào)是BaP誘發(fā)肺癌過(guò)程中的重要特征，基于二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)的miRNA 表達(dá)譜分析可為進(jìn)一步闡明BaP 致癌的表觀遺傳學(xué)機(jī)制提供線索。BaP可誘導(dǎo)miR-137，miR-150，miR-142-5p，miR-122，miR-34c，miR-34b-5p，miR-29b，let-7a，miR-21 和miR-29等表達(dá)失調(diào)，影響免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和細(xì)胞周期等生物學(xué)過(guò)程［12-14］。前期開(kāi)展的miRNA組測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)，BaP惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞THBEc1與對(duì)照細(xì)胞16HBE的miRNA存在明顯差異。功能研究發(fā)現(xiàn)，THBEc1細(xì)胞中miR-152-3p，miR-142-5p和miR-211-5p表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致活化白細(xì)胞黏附分子（activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM）上調(diào)，影響THBEc1 細(xì)胞增殖、遷移和裸鼠體內(nèi)成瘤等，提示miR-152-3p/miR-142-5p/miR-211-5p-ALCAM 軸可能在BaP 致癌過(guò)程中發(fā)揮作用［6］。本課題組前期對(duì)BaP 惡性轉(zhuǎn)化人支氣管上皮細(xì)胞T-16HBE-C1（THBEc1）和16HBE細(xì)胞的蛋白質(zhì)組差異進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，THBEc1細(xì)胞中叉頭框蛋白A1（forkhead-box A1，F(xiàn)OXA1）蛋白表達(dá)水平上調(diào)。通過(guò)建立FOXA1敲除單克隆細(xì)胞THBEc1-ΔFOXA1-c34 和敲除對(duì)照單克隆細(xì)胞THBEc1-ctrl 開(kāi)展表型錨定研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA1在BaP 致癌中具有癌基因作用［15］。但FOXA1在THBEc1細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的機(jī)制和發(fā)揮癌基因作用的信號(hào)通路或網(wǎng)絡(luò)尚未闡明。鑒于miRNA 在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的重要作用，推測(cè)BaP 可能通過(guò)誘導(dǎo)miRNA 表達(dá)改變導(dǎo)致FOXA1 蛋白表達(dá)上調(diào)，繼而FOXA1 通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究采用人支氣管上皮細(xì)胞16HBE和本課題組構(gòu)建的細(xì)胞THBEc1，THBEc1-ctrl 和THBEc1-ΔFOXA1-c34，綜合利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，篩選靶向FOXA1的miRNA 以及FOXA1 的潛在靶基因，識(shí)別以FOXA1 為軸的上下游分子，以期為進(jìn)一步探究FOXA1 在BaP 致癌中的作用和可能機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

MEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素（美國(guó)Sigma公司）；TRIzol和Lipofectamine?2000試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒、SuperReal-PreMix Plus（SYBR Green）和Pro-Light HRP 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；人FOXA1基因cDNA 表達(dá)質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒pCMV-未標(biāo)記的陰性對(duì)照質(zhì)粒（北京義翹神州科技股份有限公司）；潮霉素B（hygromycin B，中國(guó)上海阿拉丁公司）；一抗，兔抗人FOXA1單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）；兔抗人異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）多克隆抗體和兔抗人熱休克蛋白B1（heat shock protein B1，HSPB1）多克隆抗體（北京義翹神州科技股份有限公司）；鼠抗人β 肌動(dòng)蛋白單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 抗體（二抗）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；雙鏈miRNA 模擬物和雙鏈miRNA 模擬物陰性對(duì)照（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）。SCI-I65D CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本ASTEC 公司）；CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 細(xì)胞構(gòu)建和培養(yǎng)

人支氣管上皮細(xì)胞16HBE，由中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院陳雯教授惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室保存。BaP 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞THBEc1 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存［16］。敲除FOXA1基因的THBEc1 單克隆細(xì)胞THBEc1-ΔFOXA1-c34和質(zhì)粒對(duì)照細(xì)胞THBEc1-ctrl分別為利用CRISPR/Cas9 技術(shù)將FOXA1 雙切口酶質(zhì)粒和對(duì)照雙切口酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到THBEc1 細(xì)胞后篩選所獲的單克隆株，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存［15］。細(xì)胞培養(yǎng)均使用含10% 胎牛血清的MEM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中。

1.3 靶向FOXA1的miRNA的預(yù)測(cè)和篩選

利用TargetScan7.2 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.targetscan.org/vert_72/）和ENCORI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//starbase.sysu.edu.cn/）預(yù)測(cè)靶向FOXA1 的miRNA。同時(shí)結(jié)合本課題組前期miRNA 測(cè)序結(jié)果：與16HBE細(xì)胞比較，在THBEc1細(xì)胞中351個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)（差異倍數(shù)＜0.5 且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率＜0.05）［6］。采用Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析，使用Venn圖對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶向FOXA1的miRNA與THBEc1細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的miRNA取交集，綜合預(yù)測(cè)可能靶向調(diào)控FOXA1的miRNA。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測(cè)16HBE和THBEc1細(xì)胞中hsamiR-584-5p（miR-584-5p），hsa-miR-142-5p（miR-142-5p）和hsa-miR-211-5p（miR-211-5p）表達(dá)水平

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的16HBE和THBEc1細(xì)胞，利用TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA。以總RNA 為模板用FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒合成cDNA，RT-qPCR 檢測(cè)miRNA 水平。以U6 作為內(nèi)參，miRNA相對(duì)表達(dá)水平以2-ΔΔCt表示。引物序列見(jiàn)表1。

Tab.1 MicroRNA（miRNA）primer sequences for realtime quantitative PCR（RT-qPCR）

1.5 靶向FOXA1的miRNA鑒定

1.5.1 miRNA轉(zhuǎn)染

將THBEc1 細(xì)胞以每孔2.5×105密度接種于6 孔板，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且細(xì)胞密度達(dá)到60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前棄掉原培養(yǎng)基，用無(wú)血清和無(wú)雙抗的MEM 培養(yǎng)基潤(rùn)洗細(xì)胞3 次，按照Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明書(shū)，THBEc1 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-584-5p 模擬物，miR-142-5p 模擬物和miR-211-5p 模擬物，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（blank control，BC）、無(wú)模擬物含Lipofectamine?2000 試劑的轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組（mock control，MC）和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照模擬物的陰性對(duì)照組（negative control，NC）。于轉(zhuǎn)染后48 和72 h 收集細(xì)胞，Western印跡法檢測(cè)FOXA1表達(dá)水平。

1.5.2 Western 印跡法檢測(cè)miRNA 轉(zhuǎn)染后THBEc1細(xì)胞中FOXA1表達(dá)水平

取1.5.1 中轉(zhuǎn)染的THBEc1 細(xì)胞，使用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。將30 μg蛋白樣品經(jīng)12% SDS-PAGE分離，再經(jīng)濕式電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。電轉(zhuǎn)后的硝酸纖維素膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后，分別與FOXA1 單克隆抗體（1∶3000）和β 肌動(dòng)蛋白抗體（1∶3000）4 ℃孵育過(guò)夜，繼而與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶20 000）室溫孵育2 h。經(jīng)TBST 清洗后，使用Pro-Light HRP 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白條帶，利用天能化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)獲取圖像。利用Image J軟件分析每個(gè)條帶積分吸收光度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的積分吸光度比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.6 FOXA1潛在靶基因的預(yù)測(cè)和篩選

利用hTF（Database of Human Transcription Factor Targets）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget#！/），并結(jié)合Harmonizonme 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//maayanlab.cloud/Harmonizome/）進(jìn)入ENCODE 和JASPAR 轉(zhuǎn)錄因子靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)綜合預(yù)測(cè)FOXA1 的潛在靶基因。采用Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析，使用Venn圖對(duì)hTF，ENCODE和JASPAR 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的FOXA1 潛在靶基因與本課題組前期對(duì)THBEc1-ctrl 和THBEc1-ΔFOXA1-c34細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢出的差異表達(dá)基因取交集，綜合預(yù)測(cè)FOXA1的潛在靶基因［17］。

1.7 RT-qPCR 檢測(cè)THBEc1-ctrl 和THBEc1 -ΔFOXA1-c34 細(xì)胞中FOXA1 潛在靶基因的表達(dá)水平

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期THBEc1-ctrl 和THBEc1-FOXA1-c34 細(xì)胞，利用TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA。以總RNA為模板，使用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)mRNA 水平，包括跨膜蛋白98（transmembrane protein 98，TMEM98）、IKAROS 家族鋅指2（IKAROS family zinc finger 2，IKZF2）、IDH1、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子5（TNF receptor associated factor 5，TRAF5）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 型受體（bone morphogenetic protein receptor type 2，BMPR2）、HSPB1、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX family transcription factor 2，RUNX2）、golgin A7 家族成員B（golgin A7 family member B，GOLGA7B）和維甲酸相關(guān)孤核受體A（RAR related orphan receptor A，RORA）共9 個(gè)基因表達(dá)水平。以GAPDH 作為內(nèi)參，mRNA 相對(duì)表達(dá)水平以2-ΔΔCt表示。引物序列見(jiàn)表2。

Tab.2 mRNA primer sequences for RT-qPCR

1.8 FOXA1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的構(gòu)建和鑒定

1.8.1 構(gòu)建

將THBEc1-ΔFOXA1-c34 細(xì)胞以每孔1.5×105密度接種于24 孔板中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞密度60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明分別轉(zhuǎn)染FOXA1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒，同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染試劑組。于轉(zhuǎn)染后48 h，使用含潮霉素100 mg·L-1的MEM 培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，每2 d更換1次含潮霉素的培養(yǎng)基。潮霉素篩選10 d，轉(zhuǎn)染試劑組細(xì)胞全部死亡后，使用不含潮霉素的MEM 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)成克隆后，將全部克隆相繼轉(zhuǎn)到6 孔板和25 cm2培養(yǎng)瓶擴(kuò)增培養(yǎng)，從而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FOXA1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞。以THBEc1-ΔFOXA1-c34細(xì)胞作為親本細(xì)胞構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)FOXA1的細(xì)胞命名為THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe 細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞命名為THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl細(xì)胞。

1.8.2 鑒定

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THBEc1-ctrl，THBEc1-ΔFOXA1-c34，THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl和THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe 細(xì)胞，用Western 印跡法檢測(cè)細(xì)胞中FOXA1表達(dá)水平，方法同1.5.2。

1.9 RT-qPCR 檢測(cè)THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl 和THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe 細(xì)胞中FOXA1 潛在靶基因的表達(dá)水平

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl和THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe 細(xì)胞，用RT-qPCR 檢測(cè)FOXA1潛在靶基因TMEM98，IKZF2，IDH1，TRAF5，BMPR2，HSPB1，RUNX2，GOLGA7B和RORA的表達(dá)水平，方法同1.7。

1.10 Western 印跡法檢測(cè)THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl 和THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe 細(xì)胞中l(wèi)DH1和HSPB1的表達(dá)水平

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期THBEc1-ctrl，THBEc1-ΔFOXA1-c34，THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl和THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe細(xì)胞，用Western印跡法檢測(cè)IDH1和HSPB1的表達(dá)水平。其中電轉(zhuǎn)后的硝酸纖維素膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后，分別與IDH1 多克隆抗體（1∶500）、HSPB1 多克隆抗體（1∶10 000）和β 肌動(dòng)蛋白抗體（1∶3000）4 ℃孵育過(guò)夜，繼而與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶20 000）室溫孵育2 h。其余方法均同1.5.2。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以±s表示。利用SPSS 26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行圖表繪制。兩組間比較采用Studentt檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組內(nèi)兩兩比較采用Dunnettt檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)測(cè)和篩選靶向調(diào)控FOXA1的miRNA

利用TargetScan 7.2和ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)到213 和145 個(gè)可能靶向調(diào)控FOXA1的miRNA。對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的miRNA 和THBEc1 細(xì)胞（與16HBE比較）中下調(diào)的miRNA取交集，發(fā)現(xiàn)THBEc1細(xì)胞中下調(diào)的miR-584-5p，miR-142-5p 和miR-211-5p 潛在靶向調(diào)控FOXA1（圖1A）。RT-qPCR結(jié)果顯示，THBEc1細(xì)胞中上述3個(gè)miRNA的表達(dá)水平均低于16HBE細(xì)胞（P＜0.01）（圖1B）。

2.2 鑒定靶向調(diào)控FOXA1的miRNA

Western 印跡結(jié)果如圖2 所示。在轉(zhuǎn)染后48和72 h，BC，MC 和NC 組間FOXA1 蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異；miR-584-5p 模擬物和miR-211-5p 模擬物組THBEc1 細(xì)胞中FOXA1 蛋白表達(dá)水平均低于NC 組（P＜0.01）；而miR-142-5p 模擬物組THBEc1 細(xì)胞中FOXA1 蛋白表達(dá)水平與NC 組間無(wú)明顯差異。提示miR-584-5p和miR-211-5p參與FOXA1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，兩者均可下調(diào)FOXA1 蛋白的表達(dá)，miR-584-5p 和miR-211-5p 下調(diào)可能是BaP惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞THBEc1 中FOXA1 蛋白表達(dá)水平上調(diào)的機(jī)制之一。而miR-142-5p 不參與FOXA1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

Fig.2 Expression levels of FOXA1 after transfection of miRNA mimics in THBEc1 cells for 48 h（A）and 72 h（B）by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.BC：blank control cells；MC：mock control cells treated with Lipofection? 2000 reagent；NC：negative control cells transfected with negative mimics miR-584-5p：THBEc1 cells transfected with miR-584-5p mimics；miR-142-5p:THBEc1 cells transfected with miR-142-5p mimics;miR-211-5p:THBEc1 cells transfected with miR-211-5p mimics.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1 and B1，respectively.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with NC group.

2.3 預(yù)測(cè)和篩選FOXA1的潛在靶基因

通過(guò)檢索hTF，JASPAR 和ENCODE 數(shù)據(jù)庫(kù)，分別檢索到17 450，1 442 和11 209 個(gè)基因含F(xiàn)OXA1 結(jié)合位點(diǎn)。將3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到的基因與THBEc1-ΔFOXA1-c34 和THBEc1-ctrl 細(xì)胞間的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后發(fā)現(xiàn)的1 195個(gè)差異表達(dá)基因（different expression genes，DEG）取交集，共發(fā)現(xiàn)20個(gè)基因在3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均被預(yù)測(cè)為FOXA1的潛在靶基因，并且在THBEc1-ΔFOXA1-c34和THBEc1-ctrl細(xì)胞間差異表達(dá)，結(jié)果如圖3A所示。

Fig.3 lntersection set of potential target genes of FOXA1 predicted by hTF，JASPAR，ENCODE databases and DEGs between THBEc1-ΔFOXA1-c34 and THBEc1-ctrl cells (A) and mRNA expression levels of indicated genes in THBEc1-ΔFOXA1-c34 and THBEc1-ctrl cells（B）.THBEc1-ΔFOXA1-c34：monoclonal cell lines obtained after THBEc1 cells knocked out FOXA1；THBEc1-ctrl：THBEc1 cells transfected with negative control plasmid.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with THBEc1-ctrl cells.

本課題組前期工作證實(shí)了FOXA1在BaP惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞THBEc1中發(fā)揮促進(jìn)裸鼠體內(nèi)成瘤及THBEc1細(xì)胞體外增殖和遷移的作用。在上述20個(gè)FOXA1的潛在靶基因中，TMEM98，IKZF2，IDH1，TRAF5，BMPR2，HSPB1，RUNX2，GOLGA7B和RORA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有文獻(xiàn)支持，故將這9 個(gè)基因作為候選基因，進(jìn)一步研究FOXA1敲除對(duì)其mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果如圖3B 所示，F(xiàn)OXA1 蛋白表達(dá)缺失后，TMEM98，IKZF2，IDH1，TRAF5，BMPR2，HSPB1和RUNX2mRNA 表達(dá)水平均下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），GOLGA7B和RORAmRNA表達(dá)水平均上調(diào)（P＜0.01，P＜0.05）。

2.4 構(gòu)建FOXA1 過(guò)表達(dá)細(xì)胞THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe

Western 印跡結(jié)果（圖4）顯示，與THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl 細(xì)胞相比，THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe 細(xì)胞中FOXA1 蛋白表達(dá)恢復(fù)（P＜0.01）。但THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe細(xì)胞中FOXA1表達(dá)水平低于THBEc1-ctrl細(xì)胞（P＜0.01）；THBEc1-ΔFOXA1-c34 和THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl 細(xì)胞中均未檢出FOXA1 蛋白表達(dá)。由此表明，穩(wěn)定表達(dá)FOXA1 的THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

Fig.4 Expression levels of FOXA1 protein in THBEc1-ctrl，THBEc1-ΔFOXA1-c34，THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl and THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe cells by Western blotting（A）.THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl：THBEc1-ΔFOXA1-c34 transfected with negative control plasmid；THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe：THBEc1-ΔFOXA1-c34 transfected with human FOXA1 gene ORF cDNA clone expressional plasmid.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with THBEc1-ctrl cells；##P＜0.01，compared with THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl cells.

2.5 FOXA1過(guò)表達(dá)對(duì)THBEc1-ΔFOXA1-c34細(xì)胞中FOXA1潛在靶基因mRNA水平的影響

RT-qPCR 結(jié)果（圖5）所示，THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe 細(xì)胞中IDH1和HSPB1mRNA 表達(dá)水平較對(duì)照細(xì)胞THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl上調(diào)（P＜0.01），余7個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異。

Fig.5 mRNA expression levels of indicated genes in THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl and THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe cells by RT-qPCR.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl cells.

2.6 敲除FOXA1 對(duì)THBEc1 細(xì)胞HSPB1 和lDH1蛋白表達(dá)的影響

Western 印跡結(jié)果（圖6）所示，與THBEc1-ctrl細(xì)胞相比，THBEc1-ΔFOXA1-c34 細(xì)胞中IDH1 和HSPB1 表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01）；與THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl 細(xì)胞相比，THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe 細(xì)胞中IDH1 和HSPB1 表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01）。表明FOXA1 表達(dá)水平的改變可影響IDH1和HSPB1的表達(dá)。

Fig.6 Expressions of HSPB1 and lDH1 in THBEc1-ctrl，THBEc1-ΔFOXA1-c34，THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl and THBEc1-ΔFOXA1-c34-oe cells by western blotting(A).See Fig.4 for the cell treatment.B and C were the semi-quantitative results of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with THBEc1-ctrl cells；##P＜0.01，compared with THBEc1-ΔFOXA1-c34-ctrl cells.

3 討論

本研究結(jié)果表明，在THBEc1 細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的miR-584-5p 和miR-211-5p 對(duì)FOXA1基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。通過(guò)對(duì)FOXA1敲除細(xì)胞THBEc1-ΔFOXA1-c34 與對(duì)照細(xì)胞THBEc1-ctrl 進(jìn)行mRNA表達(dá)差異分析，以及對(duì)THBEc1-ΔFOXA1-c34 細(xì)胞進(jìn)行FOXA1 功能回補(bǔ)，發(fā)現(xiàn)了可能受FOXA1 調(diào)控的2 個(gè)潛在靶基因，IDH1和HSPB1，提示miR-584-5p / miR - 211 - 5p-FOXA1-IDH1 /HSPB1軸可能在BaP致癌中發(fā)揮作用。

目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA 在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)，且影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡等生物學(xué)事件。miRNA 表達(dá)失調(diào)可進(jìn)一步導(dǎo)致靶基因表達(dá)失調(diào)，繼而影響靶基因參與的信號(hào)通路，這可能是miRNA 參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程的重要方式。鑒于miRNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本研究重點(diǎn)關(guān)注了FOXA1的miRNA 調(diào)控，以探究BaP 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞THBEc1 中FOXA1 蛋白表達(dá)水平上調(diào)的可能機(jī)制。已有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-132，miR-200a 和miR-100 等多種miRNA 可通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控FOXA1參與甲狀腺癌、膠質(zhì)瘤和乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡等，從而發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用［18-20］。本研究綜合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、miRNA 測(cè)序、RT-qPCR 以及miRNA 模擬物轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的證據(jù)，首次證實(shí)了miR-584-5p 和miR-211-5p 對(duì)FOXA1的負(fù)調(diào)控作用，說(shuō)明miR-584-5p 和miR-211-5p 下調(diào)是導(dǎo)致THBEc1 細(xì)胞FOXA1 蛋白表達(dá)水平上調(diào)的原因之一。miR-584-5p和miR-211-5p已被證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）、骨肉瘤、胃癌、肝癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)靶向相關(guān)基因，發(fā)揮腫瘤抑制因子作用，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［21-23］。如miR-584-5p 在NSCLC 中表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控YKT6 和基質(zhì)金屬蛋白酶14 抑制NSCLC 的遷移、侵襲和血管生成［21-22］。下調(diào)miR-584-5p 可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞中WW 結(jié)構(gòu)域E3 泛素蛋白連接酶1 過(guò)表達(dá)，從而激活腫瘤生長(zhǎng)因子-β 信號(hào)通路，促進(jìn)增殖并抑制凋亡［23］。另外，在肝癌細(xì)胞中miR-584-5p 亦參與對(duì)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶16 的調(diào)控［24］。有關(guān)miR-211-5p，已有文獻(xiàn)報(bào)道其參與調(diào)控腫瘤相關(guān)的增殖、遷移、侵襲、血管生成和凋亡等，在腎細(xì)胞癌、膠質(zhì)瘤、肝癌、骨肉瘤和三陰性乳腺癌等腫瘤中常表達(dá)下調(diào)［25-29］。在腎細(xì)胞癌中，過(guò)表達(dá)miR-211-5p 可導(dǎo)致上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制因子1（encoding snail family zinc finger 1，SNAI1）表達(dá)下調(diào)，從而抑制腫瘤細(xì)胞體外遷移和侵襲及體內(nèi)轉(zhuǎn)移［25］。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，miR-211-5p可以負(fù)調(diào)控同源盒基因C8 的表達(dá)，影響遷移和增殖［26］。體外研究表明，miR-211-5p 可通過(guò)負(fù)調(diào)控?；o酶長(zhǎng)鏈家族成員4抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［27］。在骨肉瘤中，miR-211-5p 可通過(guò)負(fù)調(diào)控富含脯氨酸蛋白11，抑制腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲，同時(shí)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［28］。在三陰性乳腺癌中，miR-211-5p可通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控沉默信息調(diào)節(jié)因子1，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移［30］。亦有證據(jù)顯示，miR-211-5p 在前列腺癌、宮頸癌、甲狀腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中可分別對(duì)殼多糖酶3 樣蛋白1、性別決定區(qū)Y 框蛋白4、丙酮酸脫氫酶激酶5 和陰陽(yáng)-1 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用［30-33］。在上述文獻(xiàn)報(bào)道的miR-211-5p 的靶基因中，SNAI1 在BaP 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞THBEc1 中mRNA表達(dá)水平較對(duì)照細(xì)胞16HBE 上調(diào)1.48 倍（P＜0.01），提示miR-211-5p/SNAI1 軸可能是THBEc1細(xì)胞呈高遷移和侵襲表型的機(jī)制之一。值得注意的是，課題組前期工作已證實(shí)ALCAM 受miR-211-5p 調(diào)控，敲除ALCAM可抑制THBEc1 細(xì)胞體外增殖和裸鼠體內(nèi)成瘤，但促進(jìn)THBEc1 細(xì)胞的體外遷移和體內(nèi)轉(zhuǎn)移［6］。本研究證實(shí)，F(xiàn)OXA1亦是miR-211-5p 的下游靶基因，而敲除FOXA1可抑制THBEc1 細(xì)胞體外增殖、遷移以及裸鼠體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移［15］。由此推斷，以miR-211-5p 為靶點(diǎn)，通過(guò)上調(diào)其表達(dá)將可能同時(shí)對(duì)FOXA1和ALCAM發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖而不增加轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，相關(guān)研究工作值得開(kāi)展。

研究發(fā)現(xiàn)，敲除FOXA1可導(dǎo)致BaP 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞THBEc1 轉(zhuǎn)錄組顯著改變［17］。上述發(fā)現(xiàn)雖然提示FOXA1 直接或間接參與多種生物學(xué)事件，但欲闡明其直接參與的信號(hào)通路或網(wǎng)絡(luò)，則有賴于對(duì)FOXA1靶基因的鑒定。本研究在對(duì)FOXA1敲除細(xì)胞THBEc1-ΔFOXA1-c34 與對(duì)照細(xì)胞THBEc1-ctrl轉(zhuǎn)錄組差異分析的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)THBEc1-ΔFOXA1-c34 細(xì)胞進(jìn)行FOXA1 功能回補(bǔ)，發(fā)現(xiàn)IDH1和HSPB1可能是受FOXA1 調(diào)控的2 個(gè)潛在靶基因。

IDH1 主要催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸。IDH1基因編碼的蛋白質(zhì)是在細(xì)胞質(zhì)和過(guò)氧化物酶體中發(fā)現(xiàn)的NADP+依賴性IDH，在細(xì)胞質(zhì)NADPH 產(chǎn)生中起著重要作用。IDH1異常表達(dá)見(jiàn)于多種腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，IDH1在原發(fā)性膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)，并且其過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移［34］。Chen 等［35］通過(guò)對(duì)139 例NSCLC 患者血清IDH1 水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NSCLC 患者血清中IDH1 水平顯著高于健康對(duì)照和良性肺部疾病患者，提示IDH1 可能作為NSCLC 早期診斷的潛在標(biāo)志物。Yang 等［36］研究發(fā)現(xiàn)，IDH1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)并指示高級(jí)別腫瘤，而且IDH1 的高表達(dá)與結(jié)直腸癌對(duì)5-氟尿嘧啶的耐藥性有關(guān)。Zheng 等［37］研究發(fā)現(xiàn)，高IDH1水平與高骨肉瘤患者預(yù)后不良有關(guān)，HSP90 ATP酶活性激活因子1 可通過(guò)正向調(diào)節(jié)IDH1 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Charitou 等［38］研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌細(xì)胞中敲低叉頭框O蛋白后過(guò)表達(dá)IDH1，可逆轉(zhuǎn)α-酮戊二酸和NADPH/NADP+水平下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)IDH1受FOXA1 正調(diào)控，且IDH1在BaP 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞THBEc1中mRNA表達(dá)水平是對(duì)照細(xì)胞16HBE 的1.69 倍（P＜0.01），提示FOXA1 可能通過(guò)上調(diào)IDH1發(fā)揮其癌基因作用。

HSPB1是本研究發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)受FOXA1調(diào)控的潛在靶基因。該基因編碼小熱休克蛋白家族的一個(gè)成員，亦稱HSP27。在應(yīng)對(duì)環(huán)境應(yīng)激時(shí)，HSPB1蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，作為分子伴侶促進(jìn)其他蛋白質(zhì)的正確折疊，從而參與蛋白的質(zhì)量控制［39］。HSPB1基因的表達(dá)與多種人類癌癥的不良臨床預(yù)后相關(guān)，HSPB1蛋白可能促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，同時(shí)保護(hù)癌細(xì)胞免于凋亡［40-41］。多種腫瘤中HSPB1表達(dá)失調(diào)已有文獻(xiàn)報(bào)道。Huang 等［42］研究發(fā)現(xiàn)，HSPB1 在NSCLC 患者癌組織和血清中均上調(diào)，而且HSPB1 上調(diào)與腫瘤分化不良、淋巴轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)。Sun 等［43］研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中敲低HSBP1可促進(jìn)鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin引起的鐵死亡，提示HSPB1 可能是腫瘤細(xì)胞鐵死亡的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在鐵代謝中發(fā)揮作用。此外，研究亦發(fā)現(xiàn)，HSPB1 與胃癌、肝癌、前列腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤的耐藥性有關(guān)［44］。如在卵巢癌細(xì)胞中，HSPB1的過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制P21從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性［45］。在前列腺癌中，HSPB1通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3/Twist參與白細(xì)胞介素6 介導(dǎo)的EMT 從而驅(qū)動(dòng)EMT，而其減弱逆轉(zhuǎn)EMT 并降低細(xì)胞遷移、侵襲和基質(zhì)金屬蛋白酶活性［46］。在胃癌細(xì)胞中，F(xiàn)YN 過(guò)表達(dá)且可以通過(guò)FYN/殺傷性T 細(xì)胞來(lái)源的蛋白激酶HSPB1 軸介導(dǎo)細(xì)胞增殖和侵襲［47］。本研究結(jié)果表明，敲除FOXA1后HSPB1表達(dá)下調(diào)，而FOXA1回補(bǔ)可使HSPB1表達(dá)上調(diào)，提示FOXA1對(duì)HSPB1具有調(diào)控作用。值得注意的是，與對(duì)照細(xì)胞16HBE 比較，在FOXA1 表達(dá)上調(diào)的THBEc1 細(xì)胞中，HSPB1mRNA 表達(dá)水平無(wú)明顯改變（差異倍數(shù)為0.87，P=0.283），但HSPB1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（差異倍數(shù)為0.14，P=0.001），提示除FOXA1 外，可能其他機(jī)制如miRNA、泛素降解系統(tǒng)等對(duì)HSPB1 的調(diào)控在THBEc1 細(xì)胞中發(fā)揮主導(dǎo)作用，相關(guān)機(jī)制值得深入研究。

綜上所述，BaP 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞THBEc1 中miR-584-5p/miR -211-5p-FOXA1 軸參與IDH1和HSPB1轉(zhuǎn)錄調(diào)控。BaP 可能在誘發(fā)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中引起miR-584-5p 和miR-211-5p 表達(dá)下調(diào)，繼而導(dǎo)致FOXA1 蛋白表達(dá)上調(diào)。上調(diào)IDH1可能是FOXA1 在THBEc1 細(xì)胞中發(fā)揮癌基因作用的機(jī)制之一。BaP 誘導(dǎo)miR-584-5p 和miR-211-5p 表達(dá)下調(diào)的機(jī)制及IDH1 在THBEc1 細(xì)胞惡性表型中的作用仍需進(jìn)一步研究。