陳瑛，曹愛麗

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200062）

糖尿病的患病率逐年攀升，糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是其最常見的并發(fā)癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約1/3 的1 型糖尿病患者和1/2 的2 型糖尿病患者進(jìn)展為DKD［1］，DKD 患病率將隨著全球糖尿病患病率的上升而增加，預(yù)計(jì)在2045 年將增加近50%［2］?？刂蒲?、血壓和調(diào)整生活方式是DKD的基本治療策略。近年來，新型降糖藥物不斷涌現(xiàn)，如鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（sodium-glucose cotransporter 2，SGLT2）抑制劑、胰高血糖素樣肽1 受體（glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R）激動(dòng)劑和二肽基肽酶4 抑制劑以及新一代鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑，這些藥物在控制血糖的同時(shí)具有良好的腎保護(hù)作用。非糖尿病患者中使用SGLT2 和GLP-1R激動(dòng)劑也能獲得心腎保護(hù)作用［3-5］。提示除高血糖外還存在其他推動(dòng)DKD發(fā)展的關(guān)鍵因素。

有研究表明，脂代謝紊亂與腎功能障礙及其他與DKD 相關(guān)的病理改變有關(guān)［6］。當(dāng)人體能量攝入逐漸超過身體在脂肪組織中儲(chǔ)存脂肪的能力時(shí)，非脂肪組織如肌肉、肝和腎等部位發(fā)生脂質(zhì)沉積。值得注意的是，腎細(xì)胞對(duì)DKD的脂質(zhì)沉積表現(xiàn)出不同程度的敏感性，其中足細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)沉積尤為敏感［7］。足細(xì)胞是腎小囊臟層上皮細(xì)胞，附著于腎小球基底膜外，其損傷被認(rèn)為是DKD病理機(jī)制中的一個(gè)重要事件［8］。代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)異常、炎癥和氧化應(yīng)激等因素均可引起足細(xì)胞肥大，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，并隨著DKD的進(jìn)展出現(xiàn)足細(xì)胞脫落或凋亡，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障破壞，引起大量尿蛋白產(chǎn)生，繼而導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，腎纖維化發(fā)生，最后發(fā)展為終末期腎臟疾病［9］。表明足細(xì)胞的完整性和生理功能對(duì)于延緩DKD 至關(guān)重要。高脂環(huán)境引起的足細(xì)胞脂質(zhì)沉積可通過激活炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等途徑造成足細(xì)胞損傷［10］。故尋找改善DKD 足細(xì)胞脂質(zhì)沉積的有效藥物和靶點(diǎn)具有重要臨床意義。

利拉魯肽（liraglutide）是一種GLP-1R 激動(dòng)劑，臨床主要用于治療2 型糖尿病，同時(shí)也可減輕2 型糖尿病患者的腎功能惡化和發(fā)展為終末期腎病的風(fēng)險(xiǎn)［11-12］。據(jù)2021 年美國糖尿病協(xié)會(huì)指南和中國糖尿病腎病防治指南，GLP-1R 激動(dòng)劑可作為治療2 型糖尿病和DKD 患者的首選藥［13］。同時(shí)，利拉魯肽對(duì)脂質(zhì)代謝具有一定作用，可減輕2 型糖尿病患者內(nèi)臟脂肪和異位脂質(zhì)沉積，降低2 型糖尿病患者和肥胖青少年體重［14-16］。有研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽通過上調(diào)2 型糖尿病大鼠腎中AMP 活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）磷酸化抑制大鼠腎脂質(zhì)沉積，并在一定程度上改善糖尿病大鼠腎功能［17］。然而利拉魯肽調(diào)控足細(xì)胞脂質(zhì)沉積的具體作用機(jī)制尚不明確。

CXC趨化因子配體16（CXC chemokine ligand 16，CXCL16）是一種趨化因子，可通過激活炎癥通路、上調(diào)細(xì)胞表面清道夫受體、誘導(dǎo)參與脂肪酸合成和儲(chǔ)存的酶的表達(dá)等方式促進(jìn)細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積。腎其他細(xì)胞脂質(zhì)的攝取往往依賴于CD36，而足細(xì)胞中的脂質(zhì)攝取卻有賴于CXCL16 的功能［18］。臨床研究表明，血清或尿液中CXCL16 的表達(dá)水平可作為2型糖尿病患者腎損傷及預(yù)測蛋白尿的新型標(biāo)志物［19-21］。沉默CXCL16 表達(dá)可減輕氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）對(duì)小鼠足細(xì)胞的損傷［22-23］。說明CXCL16 攝取脂質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞是造成足細(xì)胞脂質(zhì)沉積并引起損傷的關(guān)鍵因子。他汀類藥物具有顯著的降脂作用，多項(xiàng)脂代謝異常的研究常將辛伐他?。╯imvastatin）作為陽性對(duì)照藥，這已在科學(xué)界得到廣泛的認(rèn)可［24-27］。此外，辛伐他汀表現(xiàn)出顯著的足細(xì)胞保護(hù)作用，可通過抑制足細(xì)胞CXCL16 的表達(dá)減少足細(xì)胞對(duì)ox-LDL 的攝取進(jìn)而發(fā)揮腎保護(hù)作用［22，28］。本研究首先通過高糖和棕櫚酸模擬DKD 糖脂代謝紊亂環(huán)境，觀察足細(xì)胞CXCL16 的表達(dá)水平。并通過外源性給予重組CXCL16 觀察其對(duì)足細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)、細(xì)胞骨架、脂質(zhì)沉積及炎癥因子表達(dá)的影響，探討利拉魯肽對(duì)CXCL16 誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷和脂質(zhì)沉積的作用及機(jī)制，進(jìn)一步為利拉魯肽在DKD的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

重組CXCL16（美國Pepro Tech 公司，批號(hào)300-55），預(yù)先用純水配制成100 mg·L-1的儲(chǔ)備液，使用時(shí)1∶1000 稀釋；利拉魯肽（美國MedChem Express 公司，批號(hào)HY-P0014），預(yù)先用二甲亞砜（DMSO）配制成10，50 和100 μmol·L-1儲(chǔ)存液，使用時(shí)1∶1000稀釋；辛伐他?。绹鳰edChem Express公司，批號(hào)HY-17502），預(yù)先用DMSO 配置成100 μmol·L-1的儲(chǔ)存液，使用時(shí)1∶1000 稀釋。棕櫚酸和D-（+）-葡萄糖（美國Sigma 公司，批號(hào)P050，G8270）。澳洲胎牛血清（美國Hyclone 公司，批號(hào)SH30084.03）；RPMI-1640 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素（雙抗）混合液、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium Supplement，ITS-G）（美國Gibco公司，批號(hào)C11875500BT，15070063，41400045）；增強(qiáng)型RIPA 裂解液（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)AR0102）；BCA 蛋白定量試劑盒和SDSPAGE 膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)P0011，P0012）；彩色預(yù)染蛋白Marker（美國ThermoFisher 公司，批號(hào)26616）；PVDF 膜（美國Millipore 公司，批號(hào)IPVH00010）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）的ELISA 檢測試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，批號(hào)EHC103aQT，EHC107b，EHC002bQT）；PCR 引物〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕；兔抗人裂隙素單克隆抗體、鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白抗體、CytoPainter Phalloidin-iFluor 594 試劑和油紅O 染色試劑盒〔艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號(hào)ab216341，ab6276，ab176757，ab150678〕；兔抗人CXCL16 多克隆抗體（Affinity Biosciences 公司，批號(hào)DF3312）；兔抗人膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element-binding protein 1，SREBP1）、SREBP 2 和脂肪分化相關(guān)蛋白（adipose differentiation-related protein，ADRP）多克隆抗體（一抗）（美國Protein Tech公司，批號(hào)14088-1-AP，28212-1-AP，15294-1-AP）；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（二抗）（美國CST 公司，批號(hào)7074P2）；PCR 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

永生化人足細(xì)胞由美國西奈山醫(yī)學(xué)院何慈江教授惠贈(zèng)。人足細(xì)胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%澳洲胎牛血清、1%雙抗、1% ITS-G）于33 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)轉(zhuǎn)入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)分化7 d 用于實(shí)驗(yàn)，分化時(shí)所用RPMI-1640完全培養(yǎng)基不含ITS-G。

細(xì)胞分組：分組①細(xì)胞對(duì)照組、棕櫚酸組（250 μmol·L-1）、正常糖組（葡萄糖5 mmol·L-1）、甘露醇組（葡萄糖5 mmol·L-1+甘露醇35 mmol·L-1）和高糖組（葡萄糖40 mmol·L-1），其中棕櫚酸作用6 h，高糖作用24 h；分組②CXCL16 100 μg·L-1分別處理細(xì)胞6，12 和24 h 組；分組③細(xì)胞對(duì)照組、CXCL16 100 μg·L-1組、CXCL 16+利拉魯肽10，50和100 nmol·L-1組及CXCL 16+辛伐他汀100 nmol·L-1組；分組④細(xì)胞對(duì)照組、CXCL16 100 μg·L-1組、CXCL 16+利拉魯肽100 nmol·L-1組及CXCL 16+辛伐他汀100 nmol·L-1組。在分組③和④中，除細(xì)胞對(duì)照組外，各組預(yù)先給藥2 h 后再給予CXCL16 100 μg·L-1繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 油紅O染色檢測人足細(xì)胞內(nèi)脂滴面積比

取1.2 分組③處理的細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液并用PBS 清洗2 次，4%多聚甲醛固定后以PBS 清洗3 次，丙二醇室溫孵育5 min，再以油紅染料60 ℃孵育10 min。吸盡丙二醇后再以85%丙二醇溶液室溫孵育1 min，蒸餾水沖洗2次后蘇木素染色1 min，流水沖洗返藍(lán)，甘油封片后倒置顯微鏡觀察染色結(jié)果，脂滴呈橘紅色至鮮紅色。采集照片后使用Image J 軟件分析，以油紅染色陽性區(qū)域面積與照片總面積比值表示脂滴面積比。

1.4 鬼筆環(huán)肽染色檢測人足細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維百分比

取1.2 分組④細(xì)胞，嚴(yán)格按照CytoPainter Phalloidin-iFluor 594 試劑說明書操作進(jìn)行鬼筆環(huán)肽染色，染色完成后于激光共聚焦顯微鏡觀察染色結(jié)果，細(xì)胞內(nèi)絲狀F-肌動(dòng)蛋白呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。采集照片后使用Image J軟件分析，以單個(gè)細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白染色陽性區(qū)域熒光強(qiáng)度總和占該細(xì)胞面積的百分比表示F-肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維百分比。

1.5 ELlSA 檢測人足細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α，TGF-β和lL-1β濃度

取1.2 分組④處理后的細(xì)胞嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作檢測足細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α，TGF-β和IL-1β的濃度。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測人足細(xì)胞中TNF-α，TGF-β和IL-1β mRNA 水平

取1.2 分組④處理的細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液并用預(yù)冰的PBS清洗2次后，嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取RNA 和合成cDNA。按照說明書配制反應(yīng)體系，在qPCR 儀器上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，PCR 反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)，95 ℃變性10，60 ℃退火/延伸30 s。最終計(jì)算結(jié)果用β-肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化目的基因的相對(duì)表達(dá)，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequences for real time quantitative PCR

1.7 Western 印跡法檢測人足細(xì)胞中CXCL16、裂隙素、SREBP1、SREBP2和ADRP蛋白水平

取1.2①②④分組處理的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS 清洗2 次，吸盡PBS后加入RIPA 裂解液（含PMSF、蛋白酶/磷酸酶抑制劑）冰上裂解20 min，收集樣品于1.5 mL EP 管，13 800×g，4 ℃離心15 min，取上清；BCA 法蛋白定量變性后取15 μg 樣品上樣。8% SDS-PAGE 電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5% BSA室溫封閉1 h；按照說明書稀釋一抗4 ℃過夜孵育（CXCL16、裂隙素、SREBP1、SREBP2、ADRP 和β-肌動(dòng)蛋白稀釋比為1∶10 000，脂肪分化相關(guān)蛋白（一抗）稀釋比1∶500），次日TBST 洗膜3 次后加二抗（稀釋比1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST 再次洗膜3 次后顯影。運(yùn)用Image J 軟件分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用±s，使用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過單因素方差分析（Oneway ANOVA）進(jìn)行多組間檢驗(yàn)比較組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖和棕櫚酸對(duì)人足細(xì)胞CXCL16 蛋白表達(dá)的影響

Western 印跡結(jié)果（圖1）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，棕櫚酸組足細(xì)胞的CXCL16 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與正常糖相比，高糖組足細(xì)胞CXCL16 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），甘露醇組無顯著差異。

Fig.1 Effects of high glucose（HG）and palmitic acid（PA）on expression of CXC-chemokine ligand 16（CXCL16）in human podocytes by Western blotting.Cells were treated with PA 250 μmol·L-1 for 6 h or glucose 40 mmol·L-1（HG）for 24 h.Cells in the normal glucose（NG）group were treated with glucose 5 mmol·L-1 for 24 h.Cells in the mannitol（Mn）group were treated with a mixture of glucose 5 mmol·L-1+mannitol 35 mmol·L-1 for 24 h to exclude the effect of osmolarity on podocytes.B was the semi-quantitative result of A.IA：integrated absorance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with NG group.

2.2 CXCL16對(duì)人足細(xì)胞裂隙素表達(dá)的影響

Western 印跡結(jié)果（圖2）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，CXCL16 100 μg·L-1作用6，12 和24 h 組足細(xì)胞裂隙素蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.01）。提示外源性給予CXCL16可引起足細(xì)胞損傷。

Fig.2 Effect of CXCL16 on nephrin expression in human podocytes by Western blotting.The cells were treated with CXCL16 100 μg·L-1 for 0（cell control）6，12 and 24 h，respectively.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with 0 h group.

2.3 利拉魯肽對(duì)CXCL16 誘導(dǎo)的人足細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響

油紅O 染色結(jié)果顯示（圖3），與細(xì)胞對(duì)照組相比，CXCL16 100 μg·L-1組足細(xì)胞脂滴面積比顯著升高（P＜0.01），表明CXCL16 可以誘導(dǎo)足細(xì)胞脂質(zhì)沉積。與CXCL16 100 μg·L-1組相比，CXCL16+利拉魯肽10，50 和100 nmol·L-1組及CXCL16+辛伐他汀100 nmol·L-1組足細(xì)胞油脂滴面積比顯著降低（P＜0.01），表明利拉魯肽可以改善CXCL16 誘導(dǎo)的人足細(xì)胞脂質(zhì)沉積。

Fig.3 Effect of liraglutide on CXCL16-induced lipid deposition in human podocytes.After two hours of treatment with liraglutide 10，50 and 100 nmol·L-1 or simvastatin 100 nmol·L-1，the podocytes were stimulated with CXCL16 100 μg·L-1 for 24 h.Oil red O staining was used to detect the level of lipid droplets in human podocytes.B was the quantification of A.The number of observation positions for each treatment was chosen from a minimum of three fields.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with CXCL16 100 μg·L-1 group.

2.4 利拉魯肽對(duì)CXCL16 誘導(dǎo)的人足細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維百分比的影響

鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果（圖4）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，CXCL16 100 μg·L-1組足細(xì)胞應(yīng)力纖維百分比顯著下降（P＜0.01），與CXCL16 100 μg·L-1組相比，CXCL16+利拉魯肽100 nmol·L-1組和CXCL16+辛伐他汀100 nmol·L-1組足細(xì)胞應(yīng)力纖維百分比顯著升高（P＜0.01），表明CXCL16 干預(yù)可引起人足細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白受損，而利拉魯肽可以改善該損傷。

Fig.4 Effect of liraglutide on the cytoskeleton of CXCL16-stimulated human podocytes.See Fig.3 for the cell treatment.Red fluorescence represents Phalloidin and blue fluorescence indicates a DAPI-stained nucleus.B was the quantification of A.Percentage of F-actin stress fibers（%）=Sum of fluorescencenintensity in regions of F-actin staining positive for individuat cell/area of the cell×100%.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with CXCL16 100 μg·L-1 group.

2.5 利拉魯肽對(duì)CXCL16 刺激下人足細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α，TGF-β和lL-1β蛋白濃度的影響

ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，CXCL16 100 μg·L-1組足細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α，TGF-β 和IL-1β 蛋白濃度顯著升高（P＜0.01）。與CXCL16 100 μg·L-1組相比，CXCL16+利拉魯肽100 nmol·L-1組和CXCL16+辛伐他汀100 nmol·L-1組足細(xì)胞培養(yǎng)液TNF-α，TGF-β 和IL-1β 濃度顯著降低（P＜0.01）；表明利拉魯肽可以抑制CXCL16引起的足細(xì)胞炎癥水平升高。

Tab.2 Effect of liraglutide on secretion of TNF-α，TGF-β and lL-1β in CXCL16-stimulated human podocytes

2.6 利拉魯肽對(duì)CXCL16 刺激下人足細(xì)胞TNF-α，TGF-β和IL-1β mRNA表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果（表3）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，CXCL16 100 μg·L-1組足細(xì)胞中炎癥因子TNF-α，TGF-β和IL-1βmRNA 水平顯著增多（P＜0.05，P＜0.01）；與CXCL16 100 μg·L-1組相比，CXCL16+利拉魯肽100 nmol·L-1組和CXCL16+辛伐他汀100 nmol·L-1組足細(xì)胞中炎癥因子TNF-α，TGF-β和IL-1βmRNA 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。表明利拉魯肽可以抑制CXCL16 引起的炎癥水平升高。

Tab.3 Effect of liraglutide on mRNA levels of TNF-α，TGF-β and IL-1β in CXCL16-stimulated human podocytes

2.7 利拉魯肽對(duì)CXCL16 刺激下人足細(xì)胞裂隙素表達(dá)的影響

Western 印跡結(jié)果（圖5）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，CXCL16 100 μg·L-1組足細(xì)胞裂隙素的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與CXCL16 100 μg·L-1組相比，CXCL16+利拉魯肽100 nmol·L-1組和CXCL16+辛伐他汀100 nmol·L-1組足細(xì)胞裂隙素的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；表明CXCL16 可以引起足細(xì)胞損傷，利拉魯肽可逆轉(zhuǎn)該損傷。

Fig.5 Effect of liraglutide on nephrin expression in CXCL16-induced human podocytes by Western blotting.See Fig.3 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with CXCL16 100 μg·L-1 group.

2.8 利拉魯肽對(duì)CXCL16 刺激下足細(xì)胞SREBP1，SREBP2和ADRP蛋白表達(dá)的影響

Western 印跡結(jié)果（圖6）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，CXCL16 100 μg·L-1組足細(xì)胞中SREBP1，SREBP2 和ADRP 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。與CXCL16 100 μg·L-1組相比，CXCL16+利拉魯肽100 nmol·L-1組和CXCL16+辛伐他汀100 nmol·L-1組足細(xì)胞中SREBP1，SREBP2 和ADRP表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。

Fig.6 Effect of liraglutide on cholesterol regulatory element binding protein 1（SREBP1），SREBP2 and adipose differentiation-related protein（ADRP）expressions in CXCL16-induced human podocytes by Western blotting.See Fig.3 for the cell treatment.B，C and D were the semi-quantitative results of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01 compared with CXCL16 100 μg·L-1 group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，通過高糖或棕櫚酸模擬DKD糖脂代謝異常刺激足細(xì)胞，均可引起足細(xì)胞CXCL16 表達(dá)水平的顯著升高。表明CXCL16 在DKD 足細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用。CXCL16 是足細(xì)胞攝取ox-LDL 的主要受體，ox-LDL 損害小鼠足細(xì)胞裂隙素的表達(dá)與CXCL16 有關(guān)［28］。裂隙素是一種特殊的腎小球黏附蛋白，在腎小球足細(xì)胞表面表達(dá)，參與腎小球裂隙膜的構(gòu)成，對(duì)維持腎小球?yàn)V過及預(yù)防蛋白尿至關(guān)重要［29］。本研究結(jié)果顯示，外源性給予重組CXCL16 刺激人足細(xì)胞，可引起人足細(xì)胞裂隙素的表達(dá)下調(diào)，說明CXCL16在DKD足細(xì)胞損傷中的重要作用。

有研究表明，DKD 與脂質(zhì)代謝異常和脂質(zhì)沉積有關(guān)［30］。除降糖作用外，利拉魯肽可以有效降低甘油三酯、低密度脂蛋白等的水平，在調(diào)節(jié)脂代謝紊亂方面具有一定潛能［31］。本研究的結(jié)果表明，外源性給予CXCL16 可引起足細(xì)胞脂質(zhì)沉積明顯增多，利拉魯肽可改善CXCL16 誘導(dǎo)的足細(xì)胞脂質(zhì)沉積，與辛伐他汀效果相當(dāng)，表明利拉魯肽具有抗足細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用。同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示，利拉魯肽和辛伐他汀均可恢復(fù)CXCL16 引起的足細(xì)胞裂隙素表達(dá)下調(diào)和足細(xì)胞骨架受損，說明利拉魯肽抗脂代謝可減輕足細(xì)胞損傷程度。

過多的脂質(zhì)在細(xì)胞中積累時(shí)會(huì)通過各種機(jī)制導(dǎo)致炎癥信號(hào)的激活，引起IL-1β，IL-18，TNF-α 和IL-6 等各種促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放［32］。在本研究中，CXCL16引起足細(xì)胞脂質(zhì)沉積的同時(shí)，炎癥因子TNF-α，TGF-β 和IL-1β 的分泌和mRNA 表達(dá)水平也顯著升高，利拉魯肽或辛伐他汀干預(yù)可顯著改善這一變化，說明利拉魯肽改善足細(xì)胞脂質(zhì)沉積也進(jìn)一步改善了脂質(zhì)沉積激活的炎癥反應(yīng)。

SREBP 和ADRP 是介導(dǎo)脂肪酸的攝取、合成和氧化失衡以及脂代謝紊亂的重要分子［7］。SREBP是一類轉(zhuǎn)錄因子，包括SREBP1 和SREBP2 亞型，SREBP1 主要負(fù)責(zé)調(diào)控參與脂肪酸和甘油三酯合成的靶基因，而SREBP2 則負(fù)責(zé)參與膽固醇代謝基因的異常激活［33］。ADRP 主要參與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝和運(yùn)輸，可以結(jié)合游離脂肪酸和脂質(zhì)滴泡，從而促進(jìn)脂質(zhì)合成和儲(chǔ)存［34］。DKD 中發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)沉積引起腎小球ADRP 表達(dá)顯著上調(diào)伴隨足細(xì)胞標(biāo)志蛋白足細(xì)胞素、裂隙素表達(dá)下調(diào)［35］。此外，在脂代謝異常引起的足細(xì)胞損傷中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架受損，可能與SREBP 表達(dá)異常相關(guān)［17］。本研究結(jié)果顯示，CXCL16可引起足細(xì)胞SREBP1，SREBP2和ADRP的表達(dá)顯著升高，利拉魯肽和辛伐他汀均可降低其表達(dá)水平，表明利拉魯肽可通過抑制SREBP 和ADRP 的表達(dá)抑制足細(xì)胞脂質(zhì)沉積的發(fā)生，減輕足細(xì)胞損傷。

綜上所述，CXCL16 在DKD 足細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用，可誘導(dǎo)DKD足細(xì)胞脂質(zhì)沉積的發(fā)生。利拉魯肽可通過抑制CXCL16 誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積減輕足細(xì)胞損傷程度，并緩解脂質(zhì)沉積引起的炎癥激活，這可能與利拉魯肽能夠抑制SREBP 和ADRP的表達(dá)有關(guān)。