楊夢(mèng)蝶，寸興芳，吳寧，李錦，宋睿

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，神經(jīng)精神藥理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

20 世紀(jì)90 年代，世界衛(wèi)生組織將藥物成癮定義為慢性復(fù)發(fā)性腦部疾病，使得人類單純從社會(huì)學(xué)角度對(duì)待成癮問題轉(zhuǎn)為從醫(yī)學(xué)生物學(xué)角度對(duì)待成癮問題，這一轉(zhuǎn)變?yōu)槌砂a的神經(jīng)生物學(xué)研究提供了廣闊前景。藥物成癮不僅嚴(yán)重危害社會(huì)治安穩(wěn)定和引起重大惡性傳染病傳播，而且患者本身也遭受嚴(yán)重精神和軀體損害。《2022年世界毒品年度報(bào)告》顯示，全球約有2.84 億人存在多種成癮性物質(zhì)的不當(dāng)使用，較10 年前增加了26%；而我國《2022 年中國毒品形勢(shì)報(bào)告》指出，仍存在濫用人數(shù)多、濫用品種多樣化、治理鞏固任務(wù)艱巨等重大問題?？梢姴煌N類毒品濫用是全球毒品使用的突出問題。因此，研究不同種類成癮性物質(zhì)導(dǎo)致成癮的神經(jīng)機(jī)制，可為研發(fā)精準(zhǔn)干預(yù)措施提供扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，各類成癮性物質(zhì)均可直接或間接引起腦內(nèi)多巴胺遞質(zhì)含量升高，誘發(fā)強(qiáng)烈欣快感，啟動(dòng)成癮發(fā)生［1］。而上述功能的實(shí)現(xiàn)主要是通過中腦邊緣皮質(zhì)多巴胺系統(tǒng)，該系統(tǒng)是腦內(nèi)正性情緒調(diào)節(jié)中樞，參與調(diào)節(jié)機(jī)體獎(jiǎng)賞、動(dòng)機(jī)、決策和學(xué)習(xí)等重要生理功能［2］，其核心腦區(qū)是腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA），VTA 中近70%是多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元，并且VTA的DA能神經(jīng)元神經(jīng)纖維投射到伏隔核（nucleus accumbens，NAc）、前額葉皮質(zhì)、海馬和杏仁核等不同腦區(qū)，向投射腦區(qū)釋放DA［3-4］。其中VTA-NAc 是公認(rèn)的獎(jiǎng)賞環(huán)路［5-7］，與成癮性物質(zhì)引起的正性強(qiáng)化作用密切相關(guān)，是成癮啟動(dòng)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

各類成癮性物質(zhì)雖都能直接或間接快速引起腦內(nèi)DA 含量大幅度升高，引起強(qiáng)烈的欣快感，但不同成癮性物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用靶點(diǎn)千差萬別。甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）主要作用于突觸前膜的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（dopamine transporter，DAT）和重組囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體2（recombinant vesicular monoamine transporter 2，VMAT2），促進(jìn)囊泡內(nèi)DA耗竭性釋放，抑制DAT 對(duì)DA 的重吸收能力。另一方面，METH 還能結(jié)合單胺氧化酶并抑制其活性，促進(jìn)酪氨酸羥化酶表達(dá)，使得突觸間隙DA 含量短時(shí)間內(nèi)劇增［8-9］。可卡因（cocaine）則直接作用在DAT，抑制DA 重?cái)z?。?0］。與上述興奮劑完全不同的是，嗎啡（morphine）則是直接結(jié)合μ受體，抑制γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）能神經(jīng)元興奮性，從而解除對(duì)DA 能神經(jīng)元的抑制作用，引起VTA 腦區(qū)DA 能神經(jīng)元的興奮性升高［11］。由此可見，不同成癮性物質(zhì)直接作用的神經(jīng)物質(zhì)結(jié)構(gòu)存在巨大差異。目前可用于檢測(cè)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量變化的技術(shù)有微透析技術(shù)、微電極快速掃描循環(huán)伏安法（fast scan cyclin voltammetry，F(xiàn)SCV）和光纖記錄，并且已有研究采用微透析技術(shù)和FSCV 檢測(cè)到腦內(nèi)DA 含量的變化［12-14］。但微透析技術(shù)和FSCV 均只可檢測(cè)到神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化，且FSCV 技術(shù)還存在一些瓶頸問題，如檢測(cè)特定神經(jīng)遞質(zhì)的特異性不夠高，難以精確反映神經(jīng)遞質(zhì)的真實(shí)動(dòng)態(tài)信息，不同電化學(xué)活性物質(zhì)相互干擾以及基線漂移等，操作繁瑣，難度較高，且均無法記錄神經(jīng)元興奮性的實(shí)時(shí)變化。與之相比，光纖記錄具有特異性和靈敏度高的特點(diǎn)，在行為學(xué)訓(xùn)練或測(cè)試時(shí)監(jiān)測(cè)特定神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)元的實(shí)時(shí)變化，且實(shí)驗(yàn)操作較為簡(jiǎn)便，目前在神經(jīng)環(huán)路分子機(jī)制探究中應(yīng)用越發(fā)廣泛，同時(shí)也可與其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，如光遺傳和電生理技術(shù)等。

在誘發(fā)成癮形成過程中，神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)及神經(jīng)結(jié)構(gòu)的代償適應(yīng)性變化是其神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。本研究選擇目前流行最為廣泛的新型合成毒品METH、經(jīng)典興奮劑可卡因和傳統(tǒng)的高成癮性物質(zhì)嗎啡為代表，采用高靈敏度和高特異性的光纖記錄系統(tǒng)記錄多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)含量及神經(jīng)元興奮性的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)一步闡明上述不同成癮性物質(zhì)所引起的多巴胺能神經(jīng)元興奮性及多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)含量的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)變化特征，將為揭示各自不同的成癮神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制提供新視野，為后續(xù)開發(fā)成癮的精準(zhǔn)干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑、病毒和主要儀器

鹽酸嗎啡（青海制藥廠有限公司）；METH（批號(hào)：171212-201605，中國食品藥品檢定研究院）；可卡因和氯胺酮（軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所）；甲苯噻嗪鹽酸鹽（批號(hào)：S44817，上海麥克林生化科技有限公司）。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道建立成癮模型時(shí)采用的藥物劑量［15-18］，本研究選取METH 1 mg·kg-1、可卡因10 mg·kg-1和嗎啡10 mg·kg-1。藥物按照小鼠體重10 mL·kg-1用氯化鈉注射液配制成METH 0.1 g·L-1、可卡因1 g·L-1和嗎啡1 g·L-1，現(xiàn)配現(xiàn)用。氯化鈉注射液（批號(hào)：1802243205，石家莊四藥有限公司）；無水乙醇（批號(hào)：20170812，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；碘伏（批號(hào)：20020059，山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司）；美麗登義齒基托樹脂（批號(hào)：2015072701，賀利氏古莎齒科有限公司）；1454 瞬干膠（批號(hào)：745401，北京天山新材料技術(shù)有限公司）；多聚甲醛粉末（批號(hào)：158127）和含DAPI（40，6-二脒基-2-苯基吲哚，一種細(xì)胞核染料）的防熒光淬滅封片劑（批號(hào)：1003584214，美國Sigma 公司）；PBS 粉末（批號(hào)：23020301，中杉金橋），冷凍切片組織包埋劑（批號(hào)：2499-00，美國O.C.T.，SAKURA）；重組腺相關(guān)病毒血清型AAV2/9多巴胺能神經(jīng)元活性鈣離子指示劑病毒（批號(hào)：PT-1569，rAAV-mTH-GCaMP6m-WPREs）和多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)探針病毒（批號(hào)：PT-1340，rAAV-hSyn-DA4.4-WPRE-hGH pA）購買自樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司。

RWD 69100 小鼠腦立體定位儀（瑞沃德生命科學(xué)有限公司）；Nanoliter 2000 微量注射泵（美國WPI）；陶瓷插芯（2.5 mm）、光纖跳線和R820 三色單通道光纖記錄儀器（南京千奧星科生物科技有限公司）；LP10 激光功率檢測(cè)器（日本sanwa）；激光共聚焦顯微鏡（日本尼康，型號(hào)：NIK-S2594）；活動(dòng)箱（18 cm×15 cm×20 cm，安來科技儀器有限公司）；CM1900 冰凍切片機(jī)（德國徠卡）；VS200全景腦片高通量成像系統(tǒng)（日本奧林巴斯）。

1.2 動(dòng)物和分組處理

SPF 級(jí)C57BL/6J 雄性小鼠，體重20～25 g，購買于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0010，共計(jì)56 只。動(dòng)物購回后均飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)條件下，室溫為22～25 ℃，濕度為50%～70%，照明時(shí)間為6∶00-18∶00。飼養(yǎng)期間，動(dòng)物自由攝食飲水，間隔2～4 d 更換墊料。實(shí)驗(yàn)中所有的動(dòng)物處理均符合軍事醫(yī)學(xué)研究院倫理審查委員會(huì)的要求。根據(jù)腦注射位置的不同分為2 組：NAc腦區(qū)注射DA 神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針病毒組（n=28）和VTA 腦區(qū)注射DA 神經(jīng)元鈣離子指示劑病毒組（n=28）。

1.3 小鼠腦立體定位注射和光纖埋置

小鼠ip 給予氯胺酮100 mg·kg-1和甲苯噻嗪12.5 mg·kg-1，麻醉后固定在腦立體定位儀上，充分暴露顱骨頂部。用生理鹽水清洗顱骨頂部創(chuàng)口后，調(diào)節(jié)小鼠頭部使其保持水平。根據(jù)上述病毒注射部位不同的分組，將28只小鼠進(jìn)行VTA腦區(qū)的病毒注射，按照坐標(biāo)在顱骨上打孔（前囟后側(cè)3.2 mm，中縫左側(cè)0.5 mm），用微量注射泵吸取探針病毒試劑300 nL（rAAV-mTH-GCaMP6m-WPRE），垂直腦膜平面向下插入4.2 mm，以流速20 nL·min-1注入，注射后留針10 min 以便病毒充分?jǐn)U散和吸收，然后在同一位置腦膜平面向下4.2 mm 埋置光纖陶瓷插芯。28 只小鼠進(jìn)行NAc 腦區(qū)的病毒注射，按照坐標(biāo)在顱骨上打孔（前囟前側(cè)1.4 mm，中縫左側(cè)0.8 mm），用微量注射泵吸取探針病毒試劑300 nL（rAAV-hSyn-DA4.4-WPRE-hGH pA），垂直顱骨平面向下插入4.5 mm，以流速20 nL·min-1注入，注射后留針10 min 以便病毒充分?jǐn)U散和吸收，在同一位置顱骨平面向下4.5 mm 埋置光纖陶瓷插芯。隨后用1454 瞬干膠和牙科水泥固定導(dǎo)管。手術(shù)結(jié)束后，將小鼠放在電熱毯上至蘇醒，然后放回飼養(yǎng)間單籠飼養(yǎng)。小鼠將經(jīng)過2～3周的時(shí)間進(jìn)行手術(shù)恢復(fù)和病毒表達(dá)。

1.4 光纖記錄系統(tǒng)記錄NAc腦區(qū)DA探針熒光變化曲線下面積（area under curve，AUC）、線圖曲線最高值（peak）和達(dá)極值所需時(shí)間（time）

28 只NAc 注射DA 神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針的未經(jīng)藥物處理的小鼠分為4 組：生理鹽水組、METH（1 mg·kg-1，ip）組、可卡因（10 mg·kg-1，ip）組和嗎啡（10 mg·kg-1，sc）組，使用光纖記錄系統(tǒng)采集小鼠給藥后NAc 腦區(qū)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的熒光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)前，打開三色單通道光纖記錄儀預(yù)熱，光纖預(yù)先漂白30 min，待基線穩(wěn)定后，小鼠插上光纖，在活動(dòng)箱中自由活動(dòng)30 min后按照分組給藥，同時(shí)開始記錄470 nm信號(hào)，采集頻率為50 Hz，記錄時(shí)長為2 h。

使用千奧星科生物科技有限公司提供的模板獲取ΔF/F 軌跡，ΔF/F0=（F-F0）/F0值表示熒光強(qiáng)度變化，F(xiàn)0為給藥前400 s 信號(hào)積分的平均值。在數(shù)據(jù)分析過程中，采用MATLAB 2017 軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，通過運(yùn)動(dòng)矯正去除背景噪音信號(hào)，結(jié)合多項(xiàng)式矯正算法對(duì)信號(hào)進(jìn)行擬合改善光漂白效應(yīng)即熒光信號(hào)或光纖的自發(fā)熒光由于長時(shí)間記錄導(dǎo)致漂白基線逐步下降，從而得到真實(shí)的熒光數(shù)據(jù)。ΔF/F 值顯示為平均值，陰影區(qū)域表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。分析結(jié)果以熱圖和線圖表示，統(tǒng)計(jì)線圖中AUC、線圖曲線最高值和達(dá)極值所需時(shí)間。

1.5 光纖記錄系統(tǒng)記錄小鼠VTA腦區(qū)DA能神經(jīng)元鈣離子信號(hào)變化AUC、神經(jīng)元作用持續(xù)時(shí)間（duration）、線圖曲線最高值或最低值（event ampitude）和達(dá)極值所需時(shí)間

28 只VTA 腦區(qū)注射鈣離子指示劑病毒的未經(jīng)藥物處理的小鼠分為4 組：生理鹽水組、METH（1 mg·kg-1，ip）組、可卡因（10 mg·kg-1，ip）組和嗎啡（10 mg·kg-1，sc）組。使用光纖記錄系統(tǒng)采集小鼠給藥后VTA 腦區(qū)的的多巴胺能神經(jīng)元的熒光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)前，打開三色單通道光纖記錄儀預(yù)熱，光纖預(yù)先漂白30 min，待基線穩(wěn)定后，小鼠插上光纖在活動(dòng)箱中自由活動(dòng)30 min，抓取給藥，按照分組給藥，同時(shí)開始記錄470 nm 和405 nm 信號(hào)，采集頻率為50 Hz，記錄時(shí)長為2 h。

使用千奧星科生物科技有限公司提供的腳本獲取ΔF/F 軌跡，用當(dāng)前熒光強(qiáng)度F 和基線熒光強(qiáng)度F0的差值再除以基線熒光強(qiáng)度F0的值即ΔF/F0=（FF0）/F0的值來表征事件周圍的熒光強(qiáng)度變化，F(xiàn)0為給藥前400 s 信號(hào)積分的平均值。在數(shù)據(jù)分析過程中，以405 nm 激發(fā)光為參考通道，利用MATLAB 2017 軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，通過運(yùn)動(dòng)矯正去除背景噪音信號(hào)，結(jié)合多項(xiàng)式矯正算法對(duì)信號(hào)進(jìn)行擬合改善光漂白效應(yīng)即熒光信號(hào)或光纖的自發(fā)熒光由于長時(shí)間記錄導(dǎo)致漂白基線逐步下降，從而得到真實(shí)的熒光數(shù)據(jù)。ΔF/F 值顯示為平均值，陰影區(qū)域表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。分析結(jié)果以熱圖和線圖表征，分析神經(jīng)元興奮性變化特點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)線圖中AUC、神經(jīng)元持續(xù)作用時(shí)間、線圖曲線最高值或最低值和達(dá)極值所需時(shí)間。

1.6 病毒表達(dá)特異性驗(yàn)證

在病毒表達(dá)充分和完成1.4 和1.5 后的光纖記錄實(shí)驗(yàn)后，小鼠ip 給予氯胺酮100 mg·kg-1和甲苯噻嗪12.5 mg·kg-1進(jìn)行麻醉，翻正反射消失后，依次用生理鹽水和4%多聚甲醛溶液灌流后取腦，采用20%和30%蔗糖溶液進(jìn)行梯度脫水，至鼠腦沉至管底脫水完全。隨后進(jìn)行冰凍切片，切片厚度30 μm，取包含NAc 腦區(qū)和VTA 區(qū)域的冠狀腦片進(jìn)行熒光拍攝。切片完成后，玻片用PBS 溶液振蕩漂洗5 min，洗3次以完全洗去包埋液。對(duì)于包含目標(biāo)區(qū)域的腦片，在玻片上滴加含有DAPI 的防熒光淬滅的封片劑進(jìn)行封片，等封片劑晾干以后，放入-20 ℃保存或立即通過全景腦片高通量成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，可觀察到DA 神經(jīng)遞質(zhì)探針攜帶綠色熒光及DA能神經(jīng)元中的鈣離子指示劑蛋白（綠色熒光）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均以±s表示，所有的分析統(tǒng)計(jì)均采用SigmaStat軟件，均采用單因素方差分析，組間比較采用Bonferroni 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹腔分別給予METH 和可卡因及皮下給予嗎啡后小鼠NAc腦區(qū)DA神經(jīng)遞質(zhì)的變化

圖1A 和B 顯示，ip 給予METH（1 mg·kg-1）和可卡因（10 mg·kg-1）及sc 給予嗎啡（10 mg·kg-1）均會(huì)引起小鼠NAc 腦區(qū)的DA 探針熒光信號(hào)升高，提示NAc 腦區(qū)DA 含量顯著上升。METH 和可卡因給藥后迅速升高NAc 的DA 探針熒光信號(hào)，隨后可卡因組迅速恢復(fù)到原始水平，而METH 組熒光信號(hào)維持在高水平，提示可卡因迅速升高NAc 腦區(qū)DA含量，隨后迅速恢復(fù)到原始水平，METH 迅速且持續(xù)升高NAc 腦區(qū)DA 含量，并且維持在高水平。嗎啡給藥后NAc的DA 探針熒光信號(hào)緩慢上升達(dá)到峰值后緩慢降低恢復(fù)到原始水平，表明嗎啡給藥后，NAc 腦區(qū)DA 含量緩慢升高達(dá)到峰值后，又緩慢降低。在所用劑量下，從DA 含量變化上看，圖1C 和D 顯示METH 給藥后導(dǎo)致的NAc 腦區(qū)DA 含量變化幅度顯著高于可卡因和嗎啡（AUC：P＜0.01，與可卡因相比；P＜0.05，與嗎啡相比）；圖1E 顯示從3 個(gè)藥物給藥后NAc 腦區(qū)DA 含量達(dá)峰時(shí)間，METH 和可卡因達(dá)峰時(shí)間顯著早于嗎啡（P＜0.01，與METH相比；P＜0.01，與可卡因相比）。以上結(jié)果表明，METH、可卡因和嗎啡均顯著升高了小鼠NAc 腦區(qū)DA 神經(jīng)遞質(zhì)含量，DA 升高實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)存在顯著差異。

Fig.1 Changes of dopamine（DA）neurotransmitter，peak（C）,area under cureve（AUC）（D）and time（E）in nucleus accumbens（NAc）of mice treated with methamphetamine（METH），cocaine and morphine by optical fiber recording system.A and B were the curve and heatmap of DA，respectively.According to the group，the mice（n=28）injected with DA probe in NAC were injected with morphine（10 mg·kg-1，sc），METH（1 mg·kg-1，ip），and cocaine（10 mg·kg-1，ip）.At the same time，the 470 nm signal was recorded，the acquisition frequency was 50 Hz，and the recording duration was 2 h.±s，n=7.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with saline group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with cocaine group；△P＜0.05，△△P＜0.01，compared with morphine group.

2.2 腹腔分別給予METH 和可卡因及皮下給予嗎啡后小鼠VTA腦區(qū)DA能神經(jīng)元的變化

圖2A和B結(jié)果顯示，ip給予METH（1 mg·kg-1）和可卡因（10 mg·kg-1）均會(huì)引起DA 能神經(jīng)元的Ca2+信號(hào)快速而持續(xù)地下降，顯著抑制DA 能神經(jīng)元興奮性，而sc 給予嗎啡（10 mg·kg-1）引起DA 能神經(jīng)元的Ca2+信號(hào)緩慢而持續(xù)地上升，DA 能神經(jīng)元興奮性顯著上升。對(duì)于同屬于精神興奮劑的METH 和可卡因，從對(duì)DA 能神經(jīng)元興奮性的作用程度上看（圖2C和D），METH對(duì)神經(jīng)元的抑制程度顯著強(qiáng)于可卡因（event ampitude%：P＜0.05；AUC：P＜0.05）；從對(duì)DA 能神經(jīng)元的抑制時(shí)間上看（圖2E和F），METH 對(duì)VTA 的DA 能神經(jīng)元的抑制時(shí)間顯著長于可卡因（P＜0.05），而嗎啡與兩者相比，對(duì)VTA 的DA 能神經(jīng)元興奮性作用時(shí)間顯著長于METH 和可卡因（P＜0.01，與METH 相比；P＜0.05，與可卡因相比）。以上結(jié)果表明，METH、可卡因和嗎啡對(duì)VTA 腦區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性的作用具有顯著差異，在成癮的起始階段阿片類物質(zhì)和精神興奮性毒品對(duì)VTA 腦區(qū)的DA能神經(jīng)元產(chǎn)生相反的作用效果，提示在成癮過程中獎(jiǎng)賞系統(tǒng)發(fā)生了不同的代償性變化。

Fig.2 Changes of DAergic neurons，event ampitude（C），AUC（D），time taken to reach extremes（time）（E），and duration（F）in the ventral tegmental area（VTA）of mice treated with METH，cocaine，and morphine by optical fiber recording system.A and B were the heatmap of DA.According to the group，the mice injected with GCaMP6m in the VTA（n=28）were injected with morphine（10 mg·kg-1，sc），METH（1 mg·kg-1，ip）and cocaine（10 mg·kg-1，ip）.Recording of 470 nm and 405 nm signals began at the same time，the acquisition frequency was 50 Hz，and the recording duration was 2 h.±s，n=7.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cocaine group；##P＜0.01，compared with morphine group.

2.3 DA 神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針病毒和鈣離子指示劑病毒在小鼠NAc和VTA腦區(qū)的表達(dá)

圖3A1 和圖3A2 中表示的是病毒注射和光纖埋置的核團(tuán)位置。圖3B1 是DA 神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針在NAc 腦區(qū)的表達(dá)情況，綠色為神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針?biāo)鶖y帶的熒光蛋白。圖3B2 為GCaMP6m 在VTA腦區(qū)的表達(dá)情況，綠色為GCaMP6m 所攜帶的熒光蛋白。表明GCaMP6m 在VTA 腦區(qū)特異性表達(dá)，DA神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針在NAc腦區(qū)特異性表達(dá)。

Fig.3 Schematic representation of virus injection and DA fluorescent expression in NAc（A1）and and the VTA（A2）GCaMP6m fluorescent expression in NAc（B1）and VTA（B2）.

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)不同的成癮性物質(zhì)METH、可卡因和嗎啡均顯著升高NAc 腦區(qū)DA 神經(jīng)遞質(zhì)含量，但對(duì)于DA 升高的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)存在顯著差異。METH（1 mg·kg-1，ip）引起快速NAc 腦區(qū)DA 大幅度升高至尖峰，之后略有降低，然后在較長時(shí)間內(nèi)維持在較高水平；而可卡因（10 mg·kg-1，ip）亦能快速引起NAc 腦區(qū)DA 的升高并達(dá)峰，但快速恢復(fù)至基礎(chǔ)水平；與之相反，嗎啡（10 mg·kg-1，sc）引起NAc腦區(qū)DA 含量升高的速度較以上兩者較緩慢，達(dá)到峰值后緩慢恢復(fù)到原始水平；并且在本實(shí)驗(yàn)條件下，嗎啡和可卡因?qū)е碌腄A 水平升高幅度顯著低于甲基苯丙胺。上述DA 神經(jīng)遞質(zhì)變化動(dòng)力學(xué)的不同可能成為其導(dǎo)致成癮不同表型的重要神經(jīng)物質(zhì)基礎(chǔ)。比如，METH 導(dǎo)致的DA 水平的持續(xù)升高可能是其造成神經(jīng)興奮性毒性的關(guān)鍵因素之一；而對(duì)于可卡因而言，DA 的快速升高和快速降低將誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)欣快感的強(qiáng)烈渴求，以致在單位時(shí)間內(nèi)可卡因誘導(dǎo)的自身給藥次數(shù)顯著高于其他2 種物質(zhì)。此外，嗎啡和以上2 種興奮性成癮物質(zhì)不同，其在成癮過程中引起的DA 能神經(jīng)元投射靶區(qū)NAc 神經(jīng)可塑性存在顯著差異，嗎啡等阿片類物質(zhì)會(huì)使樹突分支、復(fù)雜性和樹突棘密度降低，而METH、可卡因等精神興奮劑可誘導(dǎo)樹突分支、復(fù)雜性和樹突棘密度增加［19-23］，這可能與本研究所發(fā)現(xiàn)的嗎啡引起的DA 的上升和下降的動(dòng)力學(xué)的顯著不同，造成DA對(duì)NAc腦區(qū)作用模式的不同。

本研究發(fā)現(xiàn)，單次給藥METH（1 mg·kg-1，ip）和可卡因（10 mg·kg-1，ip）導(dǎo)致VTA 腦區(qū)DA 能神經(jīng)元的興奮性顯著抑制，而嗎啡則與之相反。已有研究發(fā)現(xiàn)，METH 引起的NAc 腦區(qū)DA 遞質(zhì)的升高，主要是由于其作用于VMAT2 促進(jìn)DA 的釋放以及結(jié)合DAT 阻斷DA 的重吸收，而可卡因則主要通過結(jié)合多DAT 阻斷DA 的重吸收，而升高的DA 遞質(zhì)則結(jié)合多巴胺自身受體多巴胺D2 受體對(duì)DA 能神經(jīng)元產(chǎn)生負(fù)反饋抑制導(dǎo)致的興奮性減弱［24］，而在本實(shí)驗(yàn)條件下，METH 造成DA 能神經(jīng)元興奮性的抑制顯著強(qiáng)于可卡因，主要由于其造成DA 水平升高幅度顯著高于可卡因。而對(duì)于嗎啡（10 mg·kg-1，sc），其升高的DA 很可能也會(huì)通過自身受體途徑產(chǎn)生負(fù)反饋效應(yīng)，然而嗎啡導(dǎo)致的DA 遞質(zhì)水平的升高主要是通過結(jié)合VTA 腦區(qū)的抑制性GABA 神經(jīng)元上的阿片受體，從而解除其對(duì)DA 能神經(jīng)元的興奮性抑制，2種效果疊加則仍體現(xiàn)了DA能神經(jīng)元興奮性的增加。由此可見，以上3 個(gè)不同成癮性物質(zhì)對(duì)于VTA 的DA 能神經(jīng)元初始作用的不同，其所引起的獎(jiǎng)賞中樞神經(jīng)突觸可塑性也存在顯著差異，因此也將成為成癮表型不同的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究通過采用神經(jīng)遞質(zhì)探針和神經(jīng)元興奮性標(biāo)記的方法，實(shí)時(shí)記錄了不同成癮性物質(zhì)單次給藥所誘發(fā)的獎(jiǎng)賞中樞DA 神經(jīng)遞質(zhì)和DA能神經(jīng)元的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)變化，為揭示不同種類成癮性物質(zhì)的精確神經(jīng)機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在未來的研究中，將在連續(xù)給藥的成癮模型中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同成癮性物質(zhì)所引起的多巴胺系統(tǒng)的精準(zhǔn)變化，為后續(xù)開發(fā)成癮的精準(zhǔn)干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，對(duì)研發(fā)抗成癮藥物具有重要的意義。