馬承紅，王姜儼，蘇丹丹，謝佑紅，唐琳，周天宇，董群偉，孫平

1.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510062；

2.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院信息科，廣東 廣州 510062；

3.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510062；

4.廣東省云浮市中醫(yī)院，廣東 云浮 527300

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMO)是一種因雌激素降低導(dǎo)致低骨量及骨折風(fēng)險顯著增加為特點的代謝性骨病[1]。已證實，腸道菌群是造成PMO骨代謝異常的重要因素。雌激素缺乏會導(dǎo)致腸道中有益菌群定植減少，有害菌定植增加，從而引發(fā)一系列促進骨吸收的免疫炎癥反應(yīng)[2-4]?！澳I藏精、主骨、生髓”是中醫(yī)經(jīng)典理論之一。補腎中藥是治療PMO的常見中藥類型，其在影響腸道菌群防治骨質(zhì)疏松中發(fā)揮了重要作用[5]。齊墩果酸(oleanolic acid，OA)是補腎中藥女貞子、墨旱蓮等的主要活性成分之一，具有潛在的抗炎、抗氧化作用。研究表明其對骨質(zhì)疏松癥的治療起到積極作用[6-10]。本研究以去卵巢(OVX)小鼠構(gòu)建PMO模型，通過觀察OA干預(yù)后OVX小鼠骨量、炎性因子及腸道菌群的變化，進一步探討OA防治OVX小鼠骨量丟失的效果及其作用機制，以期為OA防治PMO提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑 19 只SPF 級11 周齡C57BL6/J雌性小鼠購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理中心，動物許可證號：SYXK(粵)2017-0124。置于廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗動物中心SPF級環(huán)境中進行飼養(yǎng)：給予小鼠普通飼料，室溫(22±2)℃，相對濕度40%～65%，12 h 光照，12 h 黑暗，保持良好通風(fēng)，定時紫外線消毒，自由進水和進食。OA 試劑購于上海麥克林生化科技有限公司(CAS 號508-02-1)；二甲基亞砜由天津市大茂化學(xué)試劑廠提供(批號00001)；水合氯醛由深圳希景生物提供(批號Lot.22S04X17)；0.9%氯化鈉溶液由四川科倫藥業(yè)股份有限公司提供(批號國字準號H20083400)；ELISA檢測試劑盒購于江蘇酶免實業(yè)有限公司(批號20211123M)。

1.2 實驗動物分組及造模 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后隨機分為假手術(shù)組(SHAM 組，n=6)、OVX 組(n=6)和OA 組(n=7)。10%水合氯醛以4 μL/g 麻醉OVX組和OA組小鼠，取背部正中旁側(cè)1 cm切口進入腹腔，結(jié)扎雙側(cè)輸卵管并切除雙側(cè)卵巢。SHAM 組按上述方法進行手術(shù)，保留雙側(cè)卵巢，切除卵巢旁邊同卵巢等大的脂肪組織。OA組腹腔注射OA(10 mg/kg)[8]，SHAM 組和OVX 組腹腔注射等劑量生理鹽水。隔日1次，實驗期12周。實驗結(jié)束后，無菌環(huán)境下取小鼠糞便用于16S rRNA 基因測序；小鼠眼眶血行ELISA 檢測；左側(cè)股骨行Micro-CT測定。本研究中關(guān)于動物的處置和操作均符合廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗倫理要求。

1.3 左側(cè)股骨Micro-CT測定 將肌肉筋膜剔除干凈的小鼠左側(cè)股骨統(tǒng)一方向擺入西門子Inveon Micro-CT 儀，以管電壓80 kV、管電流500 μA 為掃描參數(shù)對其進行掃描，掃描儀自帶軟件分析所獲取的圖像信息。從股骨遠端生長板遠端0.5 mm 為起點，提取其上方80 層骨組織的圖像信息，對去除皮質(zhì)骨的感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)行三維重建并分析以下指標(biāo)：骨密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分數(shù)(bone volume/tissue volume，BV/TV)、骨表面積骨體積比值(bone surface/bone volume，BS/BV)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)及骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)。

1.4 ELISA測定 采用摘眼球法收集小鼠血液，4℃、6 000 r/min離心10 min分離獲得血清。小鼠血清細胞因子的含量采取ELISA測定方法，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。測量指標(biāo)如下：β-膠原降解產(chǎn)物(β-collagen degradation products，β-CTX)、1 型原膠原氨基端前肽(procollagen type 1 N-prepeptide，P1NP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase 5b，TRACP5b)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白細胞介素-10 (interleukin-10，IL-10)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。

1.5 腸道菌群16S 擴增子測序 收集小鼠糞便于無菌EP管中，-80℃條件下冷凍保存，糞菌樣本使用E.Z.N.A.?soil DNA ki (Omega Bio-tek Norcross，GA，U.S.)提取DNA，對符合條件的DNA 用PCR 儀(ABI GeneAmp?9700型)擴增16S rRNA基因中的V3-V4區(qū)域，每個樣本重復(fù)3次，最后置于4℃保存。引物為：上游引物338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')、下游引物806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。2%瓊脂糖凝膠回收同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合物，并對其進行檢測和提純。純化后的PCR 產(chǎn)物用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit 進行建庫，Illumina 公司Miseq PE300平臺測序。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 Micro-CT 和ELISA 數(shù)據(jù)采用R軟件分析，樣本符合正態(tài)分布和方差齊性時，組間比較采用單因素ANOVA 檢驗；否則，組間比較采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗。腸道菌群數(shù)據(jù)于美吉生物云平臺上分析，Ace、Chao和Shannon 指數(shù)采用mothur軟件計算Alpha 多樣性；采用基于Bray-Curtis 距離矩陣算法的主坐標(biāo)分析(PCoA 分析)檢驗樣本間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性。組間微生物群落結(jié)構(gòu)差異程度采用ANOSIM 非參數(shù)檢驗；Alpha 多樣性和菌群豐度的組間差異采用Wilxocon 秩和檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OA 對小鼠骨微結(jié)構(gòu)及指標(biāo)的影響 如圖1 所示，OVX 組骨小梁數(shù)量顯著減少，骨微結(jié)構(gòu)受到破壞，OA 組骨小梁數(shù)量較OVX 組增加，骨微結(jié)構(gòu)破壞減少。如圖2 所示，與SHAM 組相比，OVX組BMD、BV/TV 和Tb.N 明顯降低，Tb.Sp 明顯增高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；BS/BV 和Tb.Th 變化不明顯，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與OVX組相比，OA 組BMD 和BV/TV 明顯增高，Tb.Sp 明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，Tb.N、BS/BV 和Tb.Th 變化不明顯，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 左側(cè)股骨遠端三維重建圖Figure 1 Three-dimensional reconstruction of the left distal femur

圖2 骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)變化Figure 2 Variation in bone microstructural parameters

2.2 OA 對小鼠血清ELISA 指標(biāo)的影響 如圖3所示，與SHAM 組相比，OVX 組促炎因子TNF-α、IL-6、骨吸收指標(biāo)TRACP5b、β-CTX、骨形成指標(biāo)P1NP 和LPS 明顯增高，抗炎因子IL-10 明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；與OVX組相比，OA組P1NP、TRACP5b、β-CTX、TNF-α、IL-6、和LPS明顯降低，IL-10 明顯增高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或＜0.05)。

2.3 OA對小鼠腸道菌群的影響 由圖4A 可知，三組小鼠腸道菌群中共有的OTU為437個，其中24個為SHAM 組所特有，30 個為OVX 組所特有，10 個為OA 組所特有，OVX 組的OTU 數(shù)量最多，OA 組最少。本研究通過PCoA 分析可知，SHAM 組主要分布于右下象限，OVX組主要分布于右上象限，OA組主要分布于左下象限，且P=0.001，R 值為0.837，表明可明顯區(qū)別三組樣本(圖4B)。隨著測序深度加大，在OTU水平的Shannon指數(shù)不再增加，表明測序數(shù)據(jù)量合理，能夠反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息(圖4C)。由圖4D 可知，與SHAM 組相比，OVX 組Chao、Ace 和Shannon 指數(shù)變化不明顯，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；與OVX 組相比，OA 組Chao 和Ace 指數(shù)明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，Shannon 指數(shù)變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖4 各組腸道微生物組分析Figure 4 Analysis of the gut microbiome of each group

如圖5A 所示，腸道菌群在門水平的相對豐度排名前7 的菌群分別為擬桿菌門(Bacteroidota)、厚壁菌門(Firmicutes)、脫硫桿菌門(Desulfobacterota)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)、放線菌門(Actinobacteriota)、彎曲菌門(Campilobacterota)及變形菌門(Patescibacteria)。其中，OVX 組Actinobacteriota 豐度較SHAM 組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，OA 組Actinobacteriota 豐度較OVX 組明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(圖5B)。腸道菌群在屬水平的相對豐度如圖6A所示。與SHAM組相比，Staphylococcus、Coriobacteriaceae_UCG-002 和Enterorhabdus 豐度在OVX 組中明顯降低，Odoribacter 豐度明顯增高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01 或＜0.05)；與OVX 組相比，OA 組Staphylococcus、Coriobacteriaceae_UCG-002和Enterorhabdus 豐度明顯增高，Odoribacter 豐度明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或＜0.05)(圖6B)。

圖5 各組小鼠腸道菌群門水平上差異分析Figure 5 Difference of the gut microbiota of each group at the phylum level

圖6 各組小鼠腸道菌群屬水平差異分析Figure 6 Difference of the gut microbiota of each group at the genus level

3 討論

近年來，越來越多的研究表明，腸道菌群不僅可以調(diào)節(jié)局部反應(yīng)，還可以調(diào)節(jié)包括骨代謝在內(nèi)的全身反應(yīng)，影響宿主代謝、免疫反應(yīng)和激素分泌[11]。腸道菌群紊亂會造成成骨細胞和破骨細胞之間的失衡，導(dǎo)致骨量減少、骨質(zhì)疏松風(fēng)險增加[12]。中醫(yī)藥在預(yù)防和治療PMO 中起著積極作用，OA通過抑制破骨細胞生成和刺激成骨細胞生成發(fā)揮骨保護作用[6-8]。然而目前尚無報道OA對OVX小鼠腸道菌群的影響。因此，本實驗觀察了OA干預(yù)OVX小鼠其骨量、炎性因子及腸道菌群的變化。

TRACP5b是骨吸收敏感指標(biāo)，能反應(yīng)破骨細胞活性[13]。β-CTX和P1NP 是目前國際公認的敏感性相對較好地反映骨吸收與骨形成的指標(biāo)[14]。本研究與既往研究一致[8]，OA 可顯著增加OVX 小鼠股骨BMD 和BV/TV，顯著降低Tb.Sp 和血清TRACP5b、β-CTX 及P1NP含量，提示OA可增加OVX小鼠骨量，抑制骨吸收，促進骨形成，降低骨轉(zhuǎn)換，從而延緩骨丟失。

TNF-α可促進破骨細胞生成，間接激活骨吸收陷窩的形成，使破骨細胞骨吸收功能增強[15]。IL-6 能夠刺激破骨細胞活性，抑制成骨細胞活性，從而增加骨吸收，促進骨量流失，誘發(fā)骨質(zhì)疏松[16]。IL-10 對破骨細胞生成有明顯的抑制作用[17]。LPS是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，可促使炎性細胞因子產(chǎn)生，損害腸道屏障，導(dǎo)致腸道通透性增高[18-19]。本實驗發(fā)現(xiàn)，OA 能夠顯著降低OVX 小鼠血清IL-6、TNF-α和LPS水平，顯著升高IL-10水平，提示OA可降低OVX小鼠炎性反應(yīng)，改善腸道通透性，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。

α多樣性指數(shù)(Chao、Ace、Shannon 指數(shù))代表了小鼠腸道菌群整體上的組成差異，但不能代表細菌相對豐度的差異。因此，本團隊更深層次地探究了菌群在門和屬級別的差異。有研究發(fā)現(xiàn)，在門水平，Actinobacteriota 豐度與BMD 呈正相關(guān)[20-21]，與本實驗一致。OVX小鼠腸道菌群中Actinobacteriota豐度顯著升高，OA 干預(yù)可顯著降低Actinobacteriota 豐度。在屬水平，Odoribacter豐度與TNF-α呈顯著正相關(guān)[22]。Staphylococcus可產(chǎn)生具有抗菌活性的葡萄球菌素，該類物質(zhì)具有潛在抗炎作用[23]。在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中，Coriobacteriaceae_UCG-002 豐度與血清中IL-6、TNF-α和IL-1β水平呈負相關(guān)，與IL-10 水平呈正相關(guān)[24]。已證實Enterorhabdus 豐度與促炎因子水平呈負相關(guān)，表明其在腸道穩(wěn)態(tài)中起積極作用[25]。本實驗發(fā)現(xiàn)OVX 小鼠的Odoribacter豐度顯著增加，Staphylococcus、Coriobacteriaceae_UCG-002 和Enterorhabdus 豐度顯著降低，表明Actinobacteriota、Staphylococcus、Coriobacteriaceae_UCG-002和Enterorhabdus可能是防治骨質(zhì)疏松的有益菌，而Odoribacter可能是促使骨質(zhì)疏松發(fā)生的有害菌，OA干預(yù)可有效改善這種菌群結(jié)構(gòu)，提示這可能是OA防治PMO的潛在作用靶點之一。

綜上所述，OA 能夠增加OVX 小鼠骨量、延緩骨丟失，其機制可能是通過改善腸道通透性、調(diào)節(jié)腸道菌群中Actinobacteriota、Staphylococcus、Coriobacteriaceae_UCG-002、Enterorhabdus和Odoribacter豐度及結(jié)構(gòu)、抑制炎性反應(yīng)實現(xiàn)的。本實驗尚存在一定局限，即未驗證OA 通過炎性因子及Actinobacteriota、Staphylococcus、Coriobacteriaceae_UCG-002、Enterorhabdus、Odoribacter 調(diào)控骨吸收的分子機制，需后續(xù)進一步研究證實。