陳曉穎,胡本祥,2,史嘉周,楊冰月,張 崗,彭 亮*

(1 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心,“秦藥”研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 712046;2 陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院,西安 712046)

茜草(RubiacordifoliaL.),又名紅茜根、滿江紅,為茜草科(Rubiaceae)茜草屬(RubiaLinn.)多年生草質(zhì)攀緣植物,廣泛分布于中國(guó)西北、華北、東北及朝鮮、印度和日本等地[1]。茜草具有極高的藥用和工業(yè)價(jià)值,其根及根莖是中國(guó)大宗中藥材品種之一,具有涼血、祛瘀、止血、通經(jīng)的功效,在傳統(tǒng)中醫(yī)中常用于治療各種血液循環(huán)并發(fā)癥,如痛經(jīng)和血瘀等[2]?，F(xiàn)代研究表明,蒽醌及其衍生物為茜草的主要活性成分,特別是茜草素和紫羅蘭素,具有止血、抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌等多種藥理活性[3-6]。同時(shí),茜草素和紫羅蘭素也一直被用作棉、絲和羊毛織物的重要天然染料,具有良好的藥用價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值[7-9]。

葉綠體是綠色植物特有的半自主型細(xì)胞器,擁有源于母系遺傳的獨(dú)立基因組,在植物細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用[10]。葉綠體基因組是1個(gè)圓形結(jié)構(gòu),具有保守的四分體結(jié)構(gòu),包括1個(gè)大單拷貝(LSC)區(qū)和1個(gè)小單拷貝(SSC)區(qū),2個(gè)相互倒置的重復(fù)(IR)區(qū)域,LSC和SSC正好被2個(gè)序列相同但方向相反的IR序列分開[11]。與核基因組相比,葉綠體基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,具有分子進(jìn)化速率適宜、序列高度保守、基因密集度高等優(yōu)點(diǎn)[12]。同時(shí),葉綠體基因組的特點(diǎn)是單倍體、母系遺傳、分子數(shù)量小和高度保守的序列結(jié)構(gòu),其序列變異可以為植物分類和遺傳關(guān)系提供重要理論依據(jù)[13]。鐘志敏[14]運(yùn)用DNA條形碼技術(shù),結(jié)合植物葉綠體全基因組分析,對(duì)石斛屬物種成功進(jìn)行了鑒定;Cui等[15]基于3種豆蔻屬植物葉綠體基因組進(jìn)行了特征比較與系統(tǒng)發(fā)育分析;Chen等[16]把整個(gè)葉綠體基因組用作鑒別物種的超級(jí)條形碼,對(duì)6種橐吾屬植物進(jìn)行了有效識(shí)別。由此說明葉綠體基因組在研究植物進(jìn)化、物種鑒定、資源開發(fā)與分子標(biāo)記等方面可作為有利技術(shù)手段[17]。

茜草屬多種植物具有藥用價(jià)值,它們外觀形態(tài)相似,難以區(qū)分,在實(shí)際用藥和生產(chǎn)中極易因物種差異而影響治療效果[18]。研究證實(shí),不同藥用植物的化學(xué)成分與親緣關(guān)系之間存在相關(guān)性,親緣關(guān)系越近,成分越類似[19]。因此,獲得茜草的遺傳資源信息,解析茜草及其同屬近緣種的親緣關(guān)系,可為其新藥源及其替代品的挖掘提供證據(jù)。目前,茜草的研究多集中于化學(xué)成分[20]、藥理作用[21]、非藥用部位[22]和染色[23]等方面,缺乏關(guān)于遺傳和葉綠體基因組等方面的分析?；诖?本研究運(yùn)用高通量技術(shù)對(duì)茜草全葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序、組裝、注釋,并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行結(jié)構(gòu)特征和序列變異解析;同時(shí),選取與茜草同科共20種植物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,對(duì)其親緣關(guān)系進(jìn)行探討與比較,以期為之后茜草的物種鑒定與區(qū)分、資源開發(fā)與利用、系統(tǒng)發(fā)育等研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

茜草樣品采自陜西省咸陽(yáng)市陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園(108°16′26″E,34°19′3″N),經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)胡本祥教授鑒定,憑證標(biāo)本保存于陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心。取茜草新鮮葉片,清洗干凈后液氮速凍,存放于-80 ℃冰箱。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取與測(cè)序

運(yùn)用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取茜草葉片總DNA后,對(duì)其純度、降解程度、是否存在RNA及蛋白污染、濃度進(jìn)行測(cè)定;合格DNA樣品運(yùn)用超聲技術(shù)隨機(jī)打斷,再通過末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR 擴(kuò)增等方法,構(gòu)建文庫(kù)。利用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)HiSeq X Ten測(cè)序,獲得序列原始數(shù)據(jù)(raw data),原始數(shù)據(jù)質(zhì)控合格后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,最終得到高質(zhì)量的clean data,以FASTQ格式提供[24]。

1.2.2 葉綠體全基因組序列組拼接與注釋

運(yùn)用Gurevich對(duì)序列拼接軟件進(jìn)行測(cè)試,以IDBA-UD和SPAdes效果最佳。本研究采用SPAdes v3.11.1拼接軟件對(duì)clean data的優(yōu)化序列進(jìn)行拼接和組裝,Kmer長(zhǎng)度參數(shù)設(shè)置分別為107、117、127[25]。利用DOGMA軟件對(duì)基因內(nèi)序列長(zhǎng)度、GC含量等進(jìn)行預(yù)測(cè),并利用Geneious軟件對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)行手動(dòng)校正[26];使用OGDRAW軟件繪制葉綠體全基因組圖譜[27]。最終注釋的葉綠體基因組提交至NCBI,獲得登錄號(hào)OK326894。

1.2.3 葉綠體基因組特征分析

采用MEGA11[28]進(jìn)行密碼子特征分析,包括同義密碼子使用量、相對(duì)同義密碼子使用值(RSCU)、堿基組成和密碼子含量的變化特征。使用SSRHunter軟件[29-30]鑒定葉綠體基因組中的簡(jiǎn)單序列重復(fù)序列(SSR),參數(shù)分別設(shè)置為8、5、4、3、3、3(單核苷酸至六核苷酸),且2個(gè)SSRs之間的最小距離為100 bp。SC/IR邊界使用IRSCOPE[31]進(jìn)行作圖分析。mVISTA軟件[32](https://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml)做全基因組對(duì)比,分析時(shí)勾選全局對(duì)比(Shuffle-LAGAN)。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載茜草科茜草亞科植物Rubiahorrida(KY378689)、Rubiacordifolia(OK326894)、Galiummollugo(KY562588)、Galiumaparine(KY562587)、Paederiafoetida(KY378691)、Paederiascandens(NC_049155)、Leptodermisscabrida(NC_049160)、Hedyotisovata(MK203877)、Gynochthodesparvifolia(NC_054151)、Gynochthodesofficinalis(NC_028009)、Morindacitrifolia(KY378694)、Damnacanthusindicus(MW548283)、Saprosmamerrillii(MK203879),共13種;下載仙丹花亞科植物Coffeacanephora(NC_030053)、Coffeaarabica(NC_008535)、Mussaendahirsutula(MK203878)、Emmenopteryshenryi(KY273445),共4種;下載金雞納亞科植物Mitragynaspeciosa(KY085908)、Cinchonaofficinalis(MZ151891)、Antirheachinensis(NC_044102),共3種,所選取的三類亞科的19種植物均屬于茜草科,可直觀對(duì)樣品茜草與同科植物、同屬植物之間的親緣關(guān)系進(jìn)行分析;同時(shí),選擇玄參科植物Buddlejaalternifolia(MN395662)和Buddlejacolvilei(NC_042766)作為外類群,利用MAFFT version 7[24]軟件進(jìn)行序列多重比對(duì),輸出注釋好的文件,檢查所得結(jié)果并進(jìn)行校驗(yàn);采用最大似然法(maximum likelihood method,ML)分析系統(tǒng)演化關(guān)系。用MEGA11軟件生成系統(tǒng)發(fā)育樹,除自展值Bootstrap value設(shè)為1 000外[33],其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 茜草的葉綠體基因測(cè)序結(jié)果分析

茜草葉綠體基因組共測(cè)得47 407 072條total reads,質(zhì)控后獲得47 404 064條高質(zhì)量的clean reads,占比率高達(dá)99.99%,組裝、拼接后獲得葉綠體基因組序列(圖1)。如圖所示,茜草葉綠體基因組為典型的四分環(huán)狀結(jié)構(gòu),基因組整體GC含量為37.2%;序列長(zhǎng)度為153 959 bp,包括1個(gè)83 844 bp的大單拷貝區(qū)(large single-copy,LSC)、1個(gè)17 083 bp的小單拷貝區(qū)(small single-copy,SSC)和1對(duì)長(zhǎng)度為26 516 bp反向重復(fù)區(qū)(inverted repeat region,IRs)。SSC、LSC和IR區(qū)的GC含量依次為30.9%、34.7%和40.3%(表1)。

表1 茜草葉綠體基因組堿基組成

圖1 茜草葉綠體基因組圖譜Fig.1 Gene map of Rubia cordifolia chloroplast genome

2.2 基因組成

茜草葉綠體基因組共注釋得到124個(gè)基因,包括與植物光合作用相關(guān)的基因、與自我復(fù)制相關(guān)的基因,以及一些功能未知的基因,分別為79個(gè)蛋白編碼基因、37個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因(表2)。其中,6個(gè)tRNA基因(trnA-、trnI-、trnK-、trnL-、trnS-、trnV)、7個(gè)蛋白編碼基因(rps16、rpl2、rpoC1、ndhA、ndhB、atpF、ycf1)中各包含1個(gè)內(nèi)含子, 而rps12、clpP和ycf3基因則各包含2個(gè)內(nèi)含子。

表2 茜草葉綠體基因組基因

2.3 密碼子偏好性分析

茜草葉綠體基因組有64種密碼子,總長(zhǎng)78 113 bp,GC含量為37.67%。除終止密碼子外,20種氨基酸由其他密碼子編碼而來。其中,以亮氨酸(Leu)使用最為頻繁,其數(shù)量為3 680;其次是絲氨酸(Ser),數(shù)量為2 188;使用次數(shù)最少的是半胱氨酸(Cys),數(shù)量為402。RSCU分析結(jié)果表明,在所示的64種密碼子中,有33種密碼子的RSCU>1,占總量的72.39%,其中29種以A/U結(jié)尾,4種以G/C結(jié)尾(表3)。

表3 茜草密碼子

2.4 重復(fù)序列檢測(cè)

重復(fù)序列(SSR)廣泛存在于葉綠體基因組中,常用于植物物種鑒定的研究中。在茜草葉綠體基因組中共檢測(cè)到169個(gè)SSRs,包括129個(gè)單核苷酸、18個(gè)雙核苷酸、11個(gè)三核苷酸,9個(gè)四核苷酸和2個(gè)五核苷酸,六核苷酸SSR未檢測(cè)到;其中,單核苷酸居多,以A和T組成為主,表明在堿基形成過程中A和T被頻繁使用(表4)。

表4 茜草葉綠體基因組的SSR

2.5 邊界分析

文章選取了茜草科10種植物進(jìn)行葉綠體基因組邊界分析,分別為茜草亞科(6種)、仙丹花亞科(2種)和金雞納亞科(2種),從上至下依次為茜草Rubiacordifolia(OK326894)、糙葉野丁香Leptodermisscabrida(NC_049160)、雞屎藤Paederiascandens(NC_049155)、四葉葎Galiummollugo(KY562588)、原拉拉藤Galiumaparine(KY562587)、卵葉耳草Hedyotisovata(MK203877)、中?？Х菴offeacanephora(NC 030053)、小粒咖啡Coffeaarabica(NC_008535)、美麗帽柱木Mitragynaspeciosa(KY085908)、正雞納樹Cinchonaofficinalis(MZ151891),如圖2。結(jié)果顯示,所選取植物的葉綠體基因組共有4個(gè)邊界。茜草、四葉葎、原拉拉藤、中?？Х?、小?？Х群兔利惷敝镜腏LB(LSC/IRb)位于rps19基因編碼區(qū)內(nèi),且向IRb區(qū)有14～95 bp的擴(kuò)張;正雞納樹的JLB邊界則位于rpl16基因上,向IRb區(qū)擴(kuò)張了193 bp;糙葉野丁香JLB邊界位于rps19和trnH基因之間;雞屎藤的JLB邊界位于rps19和rps12之間;僅卵葉耳草JLB(LSC/IRb)邊界位于rps22和rps19之間。

圖2 茜草科植物葉綠體基因組的IR/SC邊界變化情況Fig.2 Changes of IR/SC boundary of chloroplast genomes of Rubiaceae species

在JSB(IRb/SSC)邊界區(qū),茜草缺失ycf1基因;除中?？Х取⑿×？Х群兔利惷敝就?其他6種植物JSB邊界均位于在SSC區(qū)的ndhF基因之內(nèi),且向IRb邊界擴(kuò)張了5～76 bp。10種植物的JSA(SSC/IRa)邊界均位于ycf1基因內(nèi),長(zhǎng)度向IRa區(qū)域不同程度擴(kuò)張,為1 057～1 919 bp;在JLA(IRa/LSC)的邊界處,10種植物均含有trnH基因,但糙葉野丁香的trnH基因位于IRa區(qū)域,其他9種植物則位于LSC區(qū);茜草、雞屎藤、四葉葎和美麗帽柱木的JLA邊界位于rpl2與trnH基因之間;原拉拉藤、卵葉耳草、中粒咖啡和小?？Х鹊腏LA邊界則位于rps19與trnH基因之間;正雞納樹的JLA邊界位于rps3和trnH之間;僅有糙葉野丁香的JLA邊界位于trnH與psbA基因之間。

從以上分析結(jié)果來看,茜草屬不同亞科植物在進(jìn)化過程中IR邊界區(qū)中存在一定的收縮和擴(kuò)張,且不同物種之間存在部分差異,但總體來說,IR區(qū)的變化幅度較小,葉綠體基因組較為保守。

2.6 茜草葉綠體基因組序列變異分析

以茜草(OK326894)葉綠體基因組作注釋,使用mVISTA在線工具進(jìn)行葉綠體基因組全序列對(duì)比分析(圖3)。如圖3所示,茜草科植物葉綠體基因組的基因區(qū)間組成差異性較小,較為一致。結(jié)合邊界分析,可見本文所選茜草科植物總體上LSC、SSC區(qū)域變異程度高,大于IR區(qū);從四大區(qū)段來看,LSC區(qū)變化異性最大,IRA區(qū)變化差異性最小,最為保守。從非基因編碼區(qū)和基因編碼區(qū)來看,非基因編碼區(qū)變異程度較高,基因編碼區(qū)較為保守,但在rps16、rpoB、ycf3、clpP、ndhF、ndhA和ycf1等基因編碼區(qū)變異程度較大,存在顯著差異。

圖3 茜草科植物葉綠體基因組序列比對(duì)分析Fig.3 Genome sequence alignment of Rubiaceae chloroplasts

2.7 系統(tǒng)發(fā)育分析

以茜草科3個(gè)亞科(茜草亞科、仙丹花亞科、金雞納亞科)共20種植物為內(nèi)類群,同時(shí)選取玄參科2種植物為外類群,采用最大似然法(ML法)構(gòu)建植物系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果表明,茜草Rubiacordifolia(OK326894)與登錄號(hào)為KY378689的Rubiahorrida以100%支持率聚為一類,兩者親緣關(guān)系好;茜草屬、拉拉藤屬、雞屎藤屬共6種植物與糙葉野丁香、卵葉耳草聚為一小支;羊角藤屬2種植物與海濱木巴戟、虎刺、瓊島染木樹聚為一小支;兩小支構(gòu)成姐妹類群,支持率均為100%,為茜草亞科組。仙丹花亞科組4種植物與金雞納亞科組3種植物共同聚為一支,除咖啡屬粗毛玉葉金花、美麗帽柱木正雞納樹這個(gè)節(jié)點(diǎn)支持率分別為97%、81%外,其他節(jié)點(diǎn)均為100%。

圖4 基于22個(gè)物種葉綠體基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed with 22 species chloroplast genome sequences

3 討 論

茜草是一種分布廣泛的多年生植物,最初以天然植物染料見于《詩(shī)經(jīng)》中,后其根及根莖作為中藥被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中[34]。作為天然植物染料用,茜草染色效果好、著色牢固,中國(guó)、印度、波斯等地區(qū)曾先后將其用于棉、麻、絲、皮革的染色[35]?，F(xiàn)代研究中,茜草也可用于合成材料如滌綸的染色[36]。作中藥用,茜草具有涼血、止血、化瘀、通經(jīng)的作用,臨床多用于治療血熱引起的各種崩漏出血、腫瘤以及跌打損傷腫痛等癥狀[2]?？芍?茜草具有極高的藥用價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值,應(yīng)用歷史悠久。葉綠體基因組是被子植物中的保守結(jié)構(gòu),Daniell等[37]表明植物葉綠體基因組呈四分環(huán)狀,長(zhǎng)度在107～218 kb之間,包括小單拷貝區(qū)18～20 kb、大單拷貝區(qū)81～90 kb以及2個(gè)反向重復(fù)區(qū)20～30 kb。本研究中,通過測(cè)序、組裝和注釋獲得的茜草葉綠體全基因組序列長(zhǎng)度為153 959 bp(GC含量37.2%),其中大單拷貝區(qū)83 844 bp、小單拷貝區(qū)17 083 bp、反向重復(fù)序列區(qū)26 516 bp,符合被子植物葉綠體的特征結(jié)構(gòu)[38];同時(shí),與已發(fā)表的茜草同屬植物紫參(155 108 bp,36.98%)[39]、同科植物丁茜(152 407 bp,37.63%)[40]相比,三者基因組大小、結(jié)構(gòu)和組成以及GC含量高度相似,證明茜草科植物在進(jìn)化過程中有良好的保守性。

密碼子在生物體遺傳信息傳遞中起著重要的作用,作為紐帶聯(lián)系核酸、蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì),其偏好使用對(duì)研究基因功能、物種進(jìn)化等問題提供了可靠的信息[41-42]。本研究中茜草葉綠體基因組對(duì)A/U結(jié)尾密碼子的偏好性高于G/C結(jié)尾密碼子,這與李亞磷等[43]對(duì)茜草同科植物小?？Х鹊拿艽a子偏好分析一致,說明物種之間親緣關(guān)系越近,密碼子偏好性使用越類似,印證了Liu等[44]的結(jié)論。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)廣泛分布于大多數(shù)植物中,主要存在于基因外部和基因非編碼區(qū),常被用在物種鑒定、遺傳多樣性分析及分子標(biāo)記輔助育種等方面[45]。在本研究中茜草葉綠體基因組中共檢測(cè)到169個(gè)SSR位點(diǎn),單核苷酸最多,雙核苷酸次之,且SSR位點(diǎn)多以A/T、AT/AT、AAT/ATT、AAAT/ATTT組成,證明茜草葉綠體基因組在堿基形成中A、T被頻繁使用,這與已發(fā)表的其他植物葉綠體基因組結(jié)果[46]相似,檢測(cè)到的SSR位點(diǎn)可為后續(xù)茜草的物種鑒別、親緣關(guān)系分析和分子標(biāo)記提供理論依據(jù)。除此之外,反向重復(fù)區(qū)的收縮、擴(kuò)張和缺失都會(huì)引起葉綠體基因組的差異[47],對(duì)茜草科植物的 IR/SC 邊界和序列變異分析發(fā)現(xiàn),SSC/IR邊界區(qū)域差異性較大,LSC/IR區(qū)域差異變化小,但總體來說,整個(gè)基因組仍然較為保守;存在部分差異的區(qū)域,可為茜草科不同物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析提供分子依據(jù)。

為了進(jìn)一步揭示茜草科物種間親緣關(guān)系,本文選取了20種茜草科植物以及玄參科2種植物作為外類群建立ML系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示,樣品茜草(OK326894)與同屬植物Rubiahorrida以100%支持率聚為一類,茜草亞科、仙丹花亞科與金雞納亞科聚為姐妹類群,除咖啡屬-粗毛五葉金花、美麗帽柱木-正雞納樹這2個(gè)節(jié)點(diǎn)支持率分別為97%、81%,其他節(jié)點(diǎn)均為100%。此系統(tǒng)發(fā)育與同屬植物紫參[39]分析結(jié)果相似,但本文增加了除茜草亞科以外的其他兩種亞科的植物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,完善了茜草科植物的進(jìn)化關(guān)系,證明茜草科植物在進(jìn)化過程中保守發(fā)育。茜草科植物約有600多個(gè)屬,13 000余種,在中國(guó)約有98屬近700種[40],《中國(guó)藥典》中僅收錄有茜草RubiacordifoliaL.的根及根莖,部分同屬植物被地方所收錄;茜草偽品較多,除同屬之間物種形態(tài)相似易混用之外,還有非同屬植物被混作藥用,市場(chǎng)上常將茜草科植物蓬子菜GaliumverumL.、唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaB.作為茜草混偽品使用,陳一龍等[48]運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)茜草及其混偽品進(jìn)行了鑒別,但并未區(qū)分茜草屬其他物種;本研究通過對(duì)茜草葉綠體基因組的全面解析,明確了其葉綠體因組的序列特征和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,為準(zhǔn)確鑒定茜草及其近緣物種提供分子依據(jù),為茜草在藥材選用、市場(chǎng)流通以及真?zhèn)纹疯b別等實(shí)際應(yīng)用方面提供數(shù)據(jù)參考。