劉 銘,楊尚雯,馬維峰,盧世雄,梁國平,毛 娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,蘭州 730070)

植物非生物脅迫包括溫度、鹽、水分、UV輻射和重金屬等多種類型,這些將引起植物細(xì)胞膜損傷、電解質(zhì)滲漏、遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變性、酶促反應(yīng)紊亂、代謝活動失調(diào),導(dǎo)致植物生長發(fā)育不良,嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致死亡[1-2]。作為對脅迫條件的一種適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng),植物會通過增加相容性溶質(zhì)(如蔗糖、果糖、葡萄糖以及脯氨酸)的積累而提高脅迫環(huán)境下的存活。在植物中,糖的積累可以維持植物細(xì)胞中的水分平衡,同時不影響細(xì)胞的正常生理代謝,這種現(xiàn)象稱為滲透調(diào)節(jié)。在非生物脅迫下,滲透調(diào)節(jié)可以延長細(xì)胞生命力從而維持植物的正常生長,并增加其對活性氧的清除能力。光合作用產(chǎn)生的碳水化合物一部分以淀粉的形式儲存,一部分被轉(zhuǎn)運(yùn)到異養(yǎng)器官中保證正常的生長代謝[3-6]。蔗糖是短期非生物脅迫后積累的必需分子,與植物的非生物脅迫耐性呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在非生物脅迫下,當(dāng)光合作用減弱時,淀粉轉(zhuǎn)化為蔗糖作為能量供應(yīng)以支持植物的生長[7],但在利用前需被蔗糖轉(zhuǎn)化酶(invertase)或蔗糖合酶裂解成葡萄糖基和果糖基,因此INV被認(rèn)為是植物體內(nèi)調(diào)節(jié)蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一[8]。

根據(jù)在細(xì)胞器中行使的功能和最適pH值,蔗糖轉(zhuǎn)化酶(INV)可分為細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶(CwINV)、細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶(CINV)和液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶(VINV)[9]。盡管VINV和CwINV位于不同的區(qū)室,但它們具有共同的生化特性,例如兩者pH 在 4.5～5.5時能最有效地裂解蔗糖,因此VINV和CwINV被稱為β-呋喃果糖苷酶[10],也將其稱為酸性轉(zhuǎn)化酶;與VINV和CwINV不同,CINV在中性/堿性最佳pH值為7.0～7.8時會水解胞質(zhì)溶膠中的蔗糖,且缺乏N-端信號肽,無糖基化[11],也無β-呋喃果糖苷酶[12],將這種轉(zhuǎn)化酶稱為堿性轉(zhuǎn)化酶。CwINV對于花、種子和果實(shí)的發(fā)育是必不可少的[9],尤其對植物生殖發(fā)育極為重要,從煙草克隆的CwINVNin88在花藥中特異性表達(dá),特別是在發(fā)育中的小孢子和周圍的絨氈層,CwINVNin88的花藥特異性阻遏了花粉發(fā)育,從而導(dǎo)致雄性不育[13];VINV是己糖積累和細(xì)胞擴(kuò)增的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[9],例如,家養(yǎng)番茄果實(shí)成熟期間VINV活性增強(qiáng)使己糖積累較多,但野生番茄品種果實(shí)成熟期間由于VINV活性較低而使蔗糖積累較多[14]。Ross等[15]在植物莖中觀察到高VINV表達(dá)或活性,如發(fā)育中的馬鈴薯塊莖,因此認(rèn)為細(xì)胞生長與轉(zhuǎn)化酶活性有關(guān)。Roitsch等[16]卻認(rèn)為VINV利用調(diào)節(jié)滲透壓來控制細(xì)胞膨脹。VINV通過將蔗糖水解成2個己糖分子,使?jié)B透作用加倍,促進(jìn)水流入細(xì)胞使細(xì)胞體積增大;而CINV由于它的不穩(wěn)定性和低活性導(dǎo)致CINV功能的可用信息降低,但仍有很大的研究潛力[17]。

在已經(jīng)開展的INV基因克隆及生物信息學(xué)分析工作中,Wang等[18]發(fā)現(xiàn)幾乎所有甘蔗INV基因的表達(dá)都受到PEG和低溫處理的影響,并且推斷出響應(yīng)干旱脅迫或冷處理的甘蔗葉中INV基因表達(dá)的上調(diào)可能是由于需要更多的INV將蔗糖裂解成己糖,為細(xì)胞提供更多的能量來維持增加的呼吸活性。此外,己糖還釋放更多的碳和能量來合成不同的化合物,使細(xì)胞增強(qiáng)對環(huán)境壓力的抵抗力。Dahro等[19]發(fā)現(xiàn)INV參與了多種非生物脅迫反應(yīng),INV酶途徑是柑橘抗寒性的首選途徑。Trouverie等[20]發(fā)現(xiàn)在玉米植物經(jīng)受中度水分脅迫時,VINV活性早期增強(qiáng),且VINV依賴于晝夜節(jié)律。

葡萄(VitisviniferaL.) 是世界上種植最廣泛的水果作物之一,具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。然而,葡萄的生產(chǎn)往往受到低溫、干旱等各種非生物脅迫的嚴(yán)重限制。在中國北方,由于大陸性氣候,大多數(shù)葡萄品種不能夠在冬季低溫干燥的自然條件下生存。由于INV家族已被證明與許多物種的非生物脅迫耐受性有關(guān),本文通過使用生物信息學(xué)的方法對葡萄蔗糖轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行檢索,并對檢索到的家族成員的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、組織特異性表達(dá)、蛋白互作關(guān)系等進(jìn)行了分析。并通過qRT-PCR初步研究其激素和模擬非生物脅迫下的表達(dá)情況,為進(jìn)一步了解葡萄蔗糖轉(zhuǎn)化酶在激素和響應(yīng)非生物脅迫的功能及作用提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)材料選自保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)的果樹生理與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的‘黑比諾’葡萄(V.viniferaL.) ‘Pinot Noir’ 無菌健康的試管苗。取單芽莖段接于50 mL GS固體培養(yǎng)基上,置于 LED 白光下(溫度25 ℃光照16 h;溫度20 ℃黑暗8 h)繼代培養(yǎng)30 d后,選取長勢良好且無污染的試管苗,在超凈工作臺將其完整地從培養(yǎng)基上取出并用滅菌水沖洗根部。使用濾紙將其固定后繼續(xù)培養(yǎng)在分別含有400 mmol/L NaCl[21-22]、10% PEG[23-24]、0.2 mmol/L ABA[25]、50 mg/L GA3[26-27]、5 mmol/L SA[28]的GS液體培養(yǎng)基中,在低溫植物培養(yǎng)箱中進(jìn)行4 ℃低溫脅迫處理,并以正常生長的試管苗作為對照。處理時長為24 h,每個處理均設(shè)置3個重復(fù)。處理結(jié)束后對葉片進(jìn)行取樣,置于-80 ℃條件下保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方 法

1.2.1 葡萄INV基因家族鑒定及序列分析

從擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組數(shù)據(jù)庫 TAIR(https://www.arabi-dopsis.org/)中下載獲得擬南芥中已鑒定的17個蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族基因及氨基酸序列,在HMMER(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan)網(wǎng)站中使用氨基酸序列總共查找到4個功能結(jié)構(gòu)域和其相對應(yīng)的登錄號(PF08244、PF00251、PF11837、PF12899)。在植物基因組網(wǎng)站(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)中選擇葡萄物種并輸入4個登錄號,得到葡萄INV的家族基因并下載其氨基酸序列、CDS序列和蛋白質(zhì)序列。使用 DNAMAN 6.0 工具進(jìn)行篩選,剔除重復(fù)片段序列。

1.2.2 葡萄INV基因家族理化性質(zhì)、染色體定位和亞細(xì)胞定位預(yù)測

用ExPASy數(shù)據(jù)庫(https://web.expasy.org/ protparam/)對蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)、氨基酸大小、分子量等進(jìn)行分析[29]。用在線軟件MG2C(http://mg2c. iask.in/mg2c_v2.1/)進(jìn)行染色體定位預(yù)測。用在線軟件PRABI-GERLAND(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)對二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲)進(jìn)行預(yù)測;用在線軟件Cell-PLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/)對亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測。

1.2.3 葡萄INV基因家族保守基序、保守結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)

從phytozome網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載葡萄的基因注釋文件(gff.)。使用在線軟件Multiple Em for Motif Elicitation(MEME) Version 5.0.5(http://meme-suite.org/tools/meme)鑒定葡萄INV蛋白中保守的基序(設(shè)置10個motif),并運(yùn)用TBtools 1.6軟件進(jìn)行保守基序(motif)可視化;使用在線軟件NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載葡萄結(jié)構(gòu)域文件,利用Tbtools 1.6軟件查詢所需要的基因后將其可視化;用在線軟件GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析后利用Tbtools 1.6軟件使其可視化,利用軟件Adobe Illustrator CS5 美化。

1.2.4 葡萄INV基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹、組織特異性表達(dá)分析、順式作用元件、共線性分析、蛋白互作關(guān)系

從phytozome網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)獲取擬南芥氨基酸序列,從中國南瓜基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.cucurbitgenomics.org/)獲取西瓜(Citrulluslanatus)、甜瓜(Cucumismelo)、南瓜(Cucurbitamoschata)的氨基酸序列(表1),用ClustalX 軟件對葡萄、擬南芥、西瓜、甜瓜、南瓜的氨基酸序列進(jìn)行多重比對,用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行自檢,(bootstrap)重復(fù)設(shè)定默認(rèn)值為1 000[30],并使用在線工具iTOL(https://itol.embl.de/)美化;將整理后的葡萄INV蛋白序列放入STRING(https://cn.string-db.org/cgi/input?sessionId=bnIFpGp71DqG&input_page_active_form=multiple_sequences)網(wǎng)站獲取葡萄蛋白質(zhì)登錄號,再將蛋白質(zhì)登錄號放入Grape eFP Browser(https://bar.utoronto.ca/efp_grape/cgi-bin/efpWeb.cgi)網(wǎng)站進(jìn)行比對,獲得了19個不同葡萄器官和組織在不同發(fā)育階段的表達(dá)數(shù)據(jù),利用TBtools 1.6軟件完成葡萄INV基因組織特異表達(dá)數(shù)據(jù)的可視化;利用TBtools 1.6軟件提取葡萄INV家族基因(fasta.gff.文件)上游2 000 bp的序列后,利用在線軟件Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行順式作用元件預(yù)測分析,再用TBtools 1.6軟件對預(yù)測順式調(diào)控元件進(jìn)行可視化;選取葡萄、擬南芥、西瓜和甜瓜INV基因家族的氨基酸序列,利用在線軟件(http://www.infspire.org/)分析葡萄與其他物種之間的共線性,以不同顏色的線條表示序列相似性,其中綠色≤50%,橙色≤75%,紅色=100%;對19個葡萄INV家族蛋白通過STRING蛋白互作數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/cgi/input?sessionId=bnIFpGp71DqG&input_page_active_form=multiple_sequences)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析和參數(shù)默認(rèn)。

表1 葡萄、擬南芥、西瓜、甜瓜和南瓜INV基因家族基本信息

1.2.5 葡萄INV基因家族熒光定量qRT-PCR分析

使用生工生物工程股份有限公司(上海)設(shè)計合成的19個基因 qPCR 引物 (表 2),以NaCl、PEG、ABA、GA3、SA、4 ℃低溫脅迫處理以及對照(正常生長的生長苗)葉片為材料提取RNA。通過試劑盒(Prime Script RT reagent Kit, Perfect Real Time,TaKaRa)轉(zhuǎn)化為 cDNA。以 6 μL ddH2O、2 μL cDNA、上+下游引物 2 μL 和 10 μL SYBR 酶作為反應(yīng)體系,以GAPDH作為內(nèi)參基因[31],通過 PCR儀(LightCycler?96 Real-Time PCR System,Roche,瑞士)分析。基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析[32]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用Excel 2010和SPSS 22.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析[33],采用單因素 (one-way ANOVO) 的Duncan’s法進(jìn)行顯著性差異分析, 顯著性水平為P<0.05[22], 使用OriginPro 9.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄INV基因家族亞細(xì)胞定位和理化性質(zhì)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

通過同源對比共檢索到19個葡萄INV基因,分別位于葡萄13條染色體上。其中有4個定位在液泡上(VvINV1～VvINV4),有5個定位在細(xì)胞壁上(VvCwINV1～VvCwINV5),有10個定位在葉綠體上(VvCINV1～VvCINV10)。6號染色體上最多有4個基因,4號、18號和Chrun染色體有2個基因,其余染色體上均有1個基因。4號染色體上存在VvCwINV1和VvCwINV42個相鄰位點(diǎn)的基因,6號染色體上存在VvCINV3和VvCINV42個相鄰位點(diǎn)的基因(圖1)。氨基酸長度介于150～766 aa之間,等電點(diǎn)介于4.43～9.1之間。分子量為16.249 30～86.378 08 kD,基因外顯子介于1～6之間。葡萄INV基因家族編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主。在VvINV中α-螺旋在10.99～49.03之間、β-折疊在4～26.7之間、不規(guī)則卷曲在32.68～65.33之間(表3)。

表3 葡萄INV基因家族信息、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測

2.2 葡萄INV基因家族的基因結(jié)構(gòu)和保守基序、保守結(jié)構(gòu)域分析

保守基序分析(圖2)顯示,除了VvCwINV3,其余葡萄INV基因都含有家族中最基本的motif 9,說明motif 9是葡萄INV基因家族重要的保守域。8個基因含有3個motif;VvINV9只含有1個motif 9;9個基因含有8個motif;VvCwINV3含有4個motif。除了VvCINV9和VvCwINV32個基因外,含有3個motif的基因成員和含有8個motif的基因成員都具有相同的保守基序列,且有一定的排列規(guī)律。VvCINV多有3個保守基序,VvCwINV多有8個保守基序。同時VvCwINV包含了所有的保守基序,說明VvCwINV基因序列高度保守,其在葡萄繁衍進(jìn)化中有重要意義。

不同顏色的方塊代表不同的基序(1-10);Glyco_32、INV_N、Glyco_hydro_100為葡萄INV基因家族的主要結(jié)構(gòu)域。圖2 葡萄INV基因家族的保守基序、保守結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)Different colored blocks represent different motifs(1-10); Glyco_32 and Glyco_hydro_100 were the main domains of VvINV genesFig.2 Conserved motifs, conserved structural domains, and gene structures of the grape INV gene family

葡萄INV基因家族共有3個保守結(jié)構(gòu)域(圖2),每個基因都有1個結(jié)構(gòu)域,8個VvINV成員有共同結(jié)構(gòu)域Glyco_32,VvCINV9結(jié)構(gòu)域?yàn)镮NV_N(β-呋喃果糖苷酶,N-端結(jié)構(gòu)域),10個VvINV成員結(jié)構(gòu)域?yàn)镚lyco_hydro_100。說明Glyco_32和Glyco_hydro_100是葡萄INV基因的重要結(jié)構(gòu)域。通過繪制葡萄INV基因家族的基因結(jié)構(gòu)(圖2),發(fā)現(xiàn)該基因家族的基因結(jié)構(gòu)差異較大。葡萄INV基因家族的CDS序列長度為453～2 301 bp,氨基酸長度為150～766 aa。其中基因序列最長的為VvCwINV4,最短的為VvCINV9,VvCwINV2、VvCINV9、VvCINV10的CDS與基因序列等長。VvCwINV2、VvCINV9、VvCINV10只有CDS沒有內(nèi)含子,其他基因內(nèi)含子為3～5不等,所有鑒定出的基因均不含有上下游序列。

2.3 葡萄INV基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹和組織特異性表達(dá)分析

用葡萄、擬南芥、西瓜、甜瓜、南瓜等5個物種INV基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,用于分析INV基因的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果(圖3)顯示該基因家族可分為3個亞族(Group1～Group3),Group1有10個基因,CmChCwINV最多有5個;Group2有10個基因,AtINV最多有3個;Group1和Group2都只含1個VvINV,Group3中VvINV基因最多有17個,根據(jù)進(jìn)化樹關(guān)系看,葡萄跟西瓜、甜瓜、南瓜INV基因家族有較高的同源性,進(jìn)化關(guān)系較近。為分析葡萄INV基因家族的特異性和功能,對VvINV基因成員在不同發(fā)育時期組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析(圖4)。

Vv. 葡萄;At. 擬南芥;Cl. 西瓜;Cm. 甜瓜;CmoCh. 南瓜。圖3 葡萄、擬南芥、西瓜、甜瓜、南瓜INV基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹Vv. V. vinifera; At. A. thaliana; CL. C. lanatus;Cm. C. melo; CmoCh. C. moschata.Fig.3 The phylogenetic tree of INV gene family in V. vinifera, A. thaliana, C. lanatus, C. melo, and C. moschata

圖4 葡萄INV基因家族的組織特異性表達(dá)分析Fig.4 Tissue specific expression of INV genes family in grape

在INV基因家族成員中根據(jù)表達(dá)模式分為2種類型:第一種類型有9個基因只在部分組織中有表達(dá),比如VvCINV2在雄蕊期、花粉期、花Ⅲ期和花Ⅳ期有較高表達(dá) 、VvCwINV3在雄蕊期和花粉期有較高表達(dá)、VvCINV4在花粉期高表達(dá);第二種類型有10個基因在葡萄的各個不同發(fā)育時期均有較高表達(dá),其中VvVINV3和VvINV192個基因在不同發(fā)育時期有相同的表達(dá)量,其在幼葉期、坐果期葉期、老葉期、種子Ⅲ期、種子Ⅳ期、果肉Ⅴ期、果肉Ⅵ期表達(dá)量較低而在其他時期表達(dá)量高。

2.4 葡萄INV基因家族的順式作用元件分析

為了進(jìn)一步明確葡萄INV基因家族的潛在功能,本研究分析了葡萄INV基因家族上游2 kb區(qū)域的順式作用元件。結(jié)果(圖5)表明,葡萄INV基因家族含有3種類型的順式作用元件,包括激素響應(yīng)元件、防御和應(yīng)激響應(yīng)元件、生長發(fā)育相關(guān)元件。激素響應(yīng)元件有脫落酸響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件;防御和應(yīng)激響應(yīng)元件有低溫響應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)能力響應(yīng)元件、防御和應(yīng)激反應(yīng)響應(yīng)元件;生長發(fā)育相關(guān)元件有生長素反應(yīng)響應(yīng)元件。

圖5 葡萄INV基因家族的順式作用元件Fig.5 Cis-acting elements of grape INV gene family

在葡萄INV基因中,除VvCINV1、VvCwINV2、VvVINV3、VvCINV6、VvCINV2、VvCINV8外,其余基因都含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件。尤以VvCINV7和VvVINV4最多;除VvCINV1、VvCINV5、VvCINV9、VvCINV3、VvCwINV5、VvCwINV3外,其余基因都含有脫落酸響應(yīng)元件,尤以VvCwINV4和VvVINV4最多。1/2以上的基因含有低溫、干旱、防御和應(yīng)激元件,8個基因有水楊酸和赤霉素響應(yīng)元件。

2.5 葡萄INV基因家族共線性分析、蛋白互作關(guān)系和熒光定量分析

為了探討不同物種INV基因家族的進(jìn)化關(guān)系,對葡萄、西瓜、甜瓜以及模式植物擬南芥之間的同源基因進(jìn)行分析,結(jié)果(圖6)表明VvCINV存在復(fù)制現(xiàn)象。而且VvCINV與CICINV和CmCINV間關(guān)聯(lián)性較強(qiáng),表明葡萄與西瓜和甜瓜的INV基因家族親緣關(guān)系較近。

Vv. 葡萄;At. 擬南芥;Cl. 西瓜;Cm. 甜瓜。圖6 葡萄與擬南芥、西瓜、甜瓜INV基因家族的共線性關(guān)系Vv. V. vinifera; At. A. thaliana;Cl. C. lanatus; Cm. C. melo.Fig.6 Collinearity of INV gene family between V. vinifera, A. thaliana, C. lanatus and C. melo

值得注意的是,INV基因關(guān)聯(lián)性強(qiáng)只表現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)上,在其他細(xì)胞器上共線性較弱,推測INV基因家族在進(jìn)化過程中在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制現(xiàn)象的頻率較高。

在19個葡萄INV家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明(圖7),除了VvVINV1、VvVINV2、VvCINV7、VvCINV8外,其余15個成員蛋白互作,表明各蛋白發(fā)揮調(diào)控作用的方式不是獨(dú)自的,而是協(xié)同作用。除了葡萄INV家族,還有蔗糖合酶(VIT_07s0005g00750.t01、VIT_11s0016g00470.t01)的2個蛋白,說明蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合酶具有一定相似功能。

圖7 葡萄INV蛋白的互作關(guān)系Fig.7 Interaction relationship of grape INV proteins

取處理后的葡萄葉片對葡萄INV基因家族19個基因進(jìn)行熒光定量分析,結(jié)果(圖8)表明,其對激素和非生物脅迫的響應(yīng)程度有明顯差異。用0.2 mmol/L的ABA處理時,VvCINV1、VvCINV5、VvCINV7、VvCwINV4和VvCwINV5表達(dá)下調(diào),其余基因表達(dá)上調(diào),最顯著的基因是VvCINV4,為對照的9.9倍;用0.1 mmol/L GA3處理時,所有基因均表達(dá)量顯著,VvVINV1表達(dá)極顯著,是對照的175.5倍;用5 mmol/L SA處理時,有9個基因表達(dá)下調(diào),其余10個基因表達(dá)上調(diào)但不明顯,最高的是VvVINV3,是對照的5.5倍。用400 mmol/L NaCl處理時所有基因均表達(dá)上調(diào),最高為VvVINV4,是對照的9.2倍;在4 ℃低溫脅迫下,除VvCwINV5表達(dá)下調(diào)外,其余基因均表達(dá)上調(diào),VvCwINV2最為明顯,是對照的37.3倍;在10% PEG處理下,所有基因上調(diào)表達(dá)顯著,尤其以VvVINV1極為明顯,是對照的180.7倍。

小寫字母表示同一組織中不同處理間差異顯著(P<0.05);CK.對照(4 ℃處理以常溫作為對照,其余處理以蒸餾水作為對照)。圖8 不同處理下葡萄葉片INV基因的相對表達(dá)Different normal letters indicate significant difference among treatments (P< 0.05); CK. Control (4 ℃ treatment with normal temperature as control, and other treatments with distilled water as control).Fig.8 The relative expression of INV genes in leaf tissues of grape under different treatments

3 討 論

蔗糖轉(zhuǎn)化酶作為植物生長不可或缺的重要酶之一,其基因參與植物形態(tài)建成和生長發(fā)育,是蔗糖代謝的關(guān)鍵編碼蛋白和碳水化合物代謝的關(guān)鍵構(gòu)成部分[34]。前人研究鑒定得到的擬南芥、海島棉[35],南瓜[36],西瓜、甜瓜[37]INV基因家族成員分別為17,65,18,12,12個,與本研究中通過對葡萄基因組數(shù)據(jù)分析鑒定得到19個葡萄INV基因家族成員相比,除了海島棉INV基因家族數(shù)量因?yàn)榘l(fā)生物種的特異性擴(kuò)增而數(shù)量遠(yuǎn)超其他物種外[35],其余物種數(shù)量差異較小或相似。

通過葡萄、擬南芥、西瓜、甜瓜和南瓜INV基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),葡萄INV基因在Group3中成員最多,葡萄與西瓜、甜瓜、南瓜INV基因家族有較高的同源性,進(jìn)化關(guān)系較近。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示,葡萄INV基因家族序列氨基酸數(shù)量存在差異,介于150～766 aa之間,等電點(diǎn)在4.43～9.1之間,與西瓜甜瓜INV基因家族結(jié)果[37]相似。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示,葡萄INV蛋白主要集中在液泡、細(xì)胞壁、葉綠體,這與南瓜INV蛋白家族和海島棉INV蛋白家族結(jié)果相似。

蛋白互作關(guān)系圖顯示蔗糖轉(zhuǎn)化酶蛋白和蔗糖合酶蛋白間有互作關(guān)系,這是因?yàn)?種酶同樣可以催化蔗糖的裂解反應(yīng)。Chourey等[38]發(fā)現(xiàn)蔗糖合酶主要參與糖聚合物的生物合成,包括淀粉和纖維素以及能量(ATP)的產(chǎn)生,Ruan等[9]發(fā)現(xiàn)蔗糖轉(zhuǎn)化酶在植物生長和發(fā)育中具有廣泛的調(diào)節(jié)功能,并在初級碳代謝中有重要作用。蔗糖轉(zhuǎn)化酶的作用是通過獲得不同的生化特性,以適應(yīng)多個細(xì)胞區(qū)室中的蔗糖代謝,最終響應(yīng)植物的生長、發(fā)育和抗逆性[34]。Husain等[39]發(fā)現(xiàn)酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶家族中的液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶主要參與碳水化合物運(yùn)輸代謝途徑調(diào)控纖維發(fā)育,將蔗糖催化為葡萄糖和果糖,從而增加細(xì)胞滲透壓,促進(jìn)果實(shí)膨大和組織伸長。韓玉慧等[35]也證明液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶對棉花纖維發(fā)育具有重要影響力。根據(jù)組織特異性圖譜顯示,VvINV1基因在葡萄幼葉期、生根期、花期、發(fā)芽期表達(dá)上調(diào),VvINV2、VvINV3、VvINV4在葡萄各個不同發(fā)育時期都表達(dá)上調(diào),推測VvINV基因在葡萄組織生長和纖維發(fā)育中發(fā)揮作用。VvCwINV3在雄蕊和花粉期表達(dá)上調(diào),VvCwINV1和VvCwINV4在花粉期,種子期和果實(shí)期均表達(dá)上調(diào),推測其參與植物生殖發(fā)育,這與Ruan等[9]發(fā)現(xiàn)CwINV對于花、種子和果實(shí)的發(fā)育是必不可少的結(jié)論相似。

激素參與調(diào)控植物在非生物脅迫中的適應(yīng)性反應(yīng)已有大量報道。GA3作為一種植物生長和發(fā)育的重要內(nèi)源調(diào)節(jié)因子,能夠正向調(diào)節(jié)種子萌發(fā)、莖的伸長、葉的展開、花和果實(shí)發(fā)育等過程。研究發(fā)現(xiàn),GA3施用不僅能夠提高庫強(qiáng)度和糖信號刺激,而且調(diào)節(jié)生長素的極性運(yùn)輸,進(jìn)而增加葡萄葉片中碳水化合物進(jìn)入幼果的通量,促進(jìn)了座果[40]。在本研究中,GA3處理后的葉片INV基因高表達(dá),這可能與其糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和內(nèi)源激運(yùn)輸有關(guān)。Wang等[18]在干旱、低溫處理甘蔗蔗糖酶活性的變化中發(fā)現(xiàn),ShCwINV3、ShCwINV7、ShCwINV9和ShN/AINV4等表達(dá)被上調(diào)以應(yīng)對干旱和寒冷脅迫下分解更多蔗糖的需要。本研究中,通過PEG模擬干旱處理葡萄試管苗,qRT-PCR結(jié)果顯示葡萄19個VvINV基因都被上調(diào),其中VvVINV1、VvVINV4、VvCINV2、VvCINV4、VvCwINV2和VvCwINV3被極顯著上調(diào),推測在干旱脅迫下其需要分解更多蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓并提供能量以支持植物體正常的機(jī)體功能運(yùn)轉(zhuǎn)。在低溫處理下,除VvCwINV4和VvCwINV5表達(dá)被下調(diào),其余17個均被上調(diào)表達(dá),這可能是為了維持低溫下細(xì)胞內(nèi)的滲透平衡和能量供應(yīng),保證植物的正常生長。

綜上所述,本研究從葡萄基因組中鑒定到19個INV基因家族成員,Glyco_32和Glyco_hydro_100是VvINV基因主要結(jié)構(gòu)域,其中組織特異性分析表明VvCwINV1、VvCwINV4對果實(shí)膨大和組織伸長可能有重要的影響。此外,VvVINV1、VvVINV3、VvVINV4和VvCwINV4均參與激素和鹽、低溫、干旱對葡萄的逆境脅迫響應(yīng),這些結(jié)果將為葡萄INV基因家族在非生物脅迫下的功能鑒定提供了一定的理論依據(jù)。