張曉頔，戴志遠

（1 浙江工商大學海洋食品研究院 浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室 杭州310035 2 河北省農(nóng)林科學院生物技術與食品科學研究所 石家莊050035 3 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連 116000）

近年來，自由基介導的氧化應激和抗氧化劑的研究備受關注[1]。自由基的大量生成會破壞細胞膜、蛋白質和DNA，與機體的衰老和免疫系統(tǒng)的削弱密切相關[2]?？寡趸钚晕镔|可清除體內(nèi)多余的自由基，防止氧化應激。食品在貯存過程中易發(fā)生氧化，導致食品質量下降，因此需要使用抗氧化劑以延長其貨架期。而常用的合成抗氧化劑具有潛在毒性，被嚴格控制使用[2]。亟需尋找安全、無毒的抗氧化活性物質。

2020 年我國水產(chǎn)總產(chǎn)量為6 545 萬t[3]，其中副產(chǎn)物占40%～55%。水產(chǎn)品副產(chǎn)物含有大量蛋白質，水解后的多肽具有較高的抗氧化活性，有望成為合成抗氧化劑的安全替代品，已成為近年來制備抗氧化肽的重要原料[4-5]。研究表明，抗氧化肽的肽鏈通常含有1 個或多個疏水性氨基酸殘基或芳香族氨基酸殘基，氨基酸的組成會造成多肽抗氧化活性的差異[5]。盡管國內(nèi)外對抗氧化活性的多肽進行了大量研究，其結構特性還需進一步研究。

三文魚刺身、鱘魚子醬和鳙魚頭是三文魚、鱘魚和鳙魚的主要銷售形式，在加工過程中會產(chǎn)生魚皮等副產(chǎn)物，這些魚皮的附加值及利用率較低。研究表明，魚皮多肽具有較高的抗氧化活性[6-7]，而不同魚皮多肽在抗氧化活性和結構特性上存在一定差異。本研究采用堿性蛋白酶分別水解三文魚皮、鱘魚皮和鳙魚皮，對其水解效果、氨基酸組成和結構特性進行比較，分析它們之間的差異性，并評價魚皮多肽的抗氧化活性，為提高魚皮的利用價值提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三文魚皮，悅勝行貿(mào)易有限公司；鳙魚皮，千島湖海苗森生態(tài)食品有限公司；鱘魚皮，鱘鰉生物科技有限公司；堿性蛋白酶（Alcalase，酶活力為1.2×105U/mg），丹麥Novozymes 公司；菲洛嗪、碳酸酐酶（29 000 u）、細胞色素C（12 400 u）、抑肽酶（6 500 u）和馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL，429 u），美國Sigma 公司；三氯乙酸（TCA）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、8-苯胺-1-萘磺酸（ANS）、FeCl2和過氧化氫（H2O2）等均為分析純級，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 設備與儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋，邦西儀器科技（上海）有限公司；LYNX-4000 高速冷凍離心機、Evolution 60S紫外可見分光光度計，美國Thermo 公司；冷凍干燥機，美國Labconco 公司；Spectra MAX190 酶標儀，美國Molecular Devices 公司；高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；F-4500 熒光分光光度計，日本Hitachi 公司。

1.3 方法

1.3.1 魚皮肽的制備 將新鮮魚皮切成小塊，置于40 ℃干燥箱中烘干，粉碎成粉末后密封保存。經(jīng)前期試驗篩選得到堿性蛋白酶制得的魚皮多肽抗氧化活性最優(yōu)，因此本試驗選擇堿性蛋白酶水解魚皮。魚皮粉末與蒸餾水按1∶8（m/V）的比例混勻，調節(jié)混合液溫度至55 ℃和pH 值至8.0，添加1%的堿性蛋白酶（m/V）。水解過程中連續(xù)加入0.1 mol/L NaOH 以維持反應液的最適pH。反應結束后，95 ℃加熱10 min 滅活蛋白酶，8 000 r/min離心10 min 后，收集上清液真空冷凍干燥后，計算得率并于-20 ℃保存。

1.3.2 水解度的測定 水解度采用pH-stat 法測定[8]。

1.3.3 TCA-氮溶指數(shù)（TCA-NSI）的測定 取20%TCA 將蛋白沉淀，利用BCA 試劑盒測定樣品的TCA-NSI[7]。

1.3.4 分子質量的測定 采用高效液相色譜（HPLC）測定抗氧化肽的分子質量[7]。色譜柱為TSK-gel G2000SWxl（7.8 mm×30 mm）；流動相為V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=45 ∶55 ∶0.1；流速為0.5 mL/min；檢測波長為280 nm；進樣量為10 μL。

1.3.5 氨基酸組成的測定 取1.00 g 樣品在110℃用6 mol/L HCl 水解22 h，離心過濾后用HPLC測定氨基酸[9]。

1.3.6 DPPH 自由基清除率 參考Lin 等[10]的方法測定DPPH 自由基清除率。取不同濃度的樣品溶液1.5 mL 與DPPH 溶液1 mL（0.02%，m/V，溶于95%乙醇）混勻，室溫避光反應30 min，于517 nm 波長處測定吸光度值。式中，A1——樣品的吸光度；A2——95%乙醇與樣品反應的吸光度；A3——蒸餾水與DPPH 溶液反應的吸光度。按式（1）計算DPPH 自由基清除率：

1.3.7 ·OH 自由基清除率 參考張曉頔等[7]的方法測定·OH 自由基清除率。

1.3.8 Fe2+螯合活性 參考Lin 等[10]的方法測定Fe2+螯合活性。取0.1 mL 20 mmol/L FeCl2溶液與不同濃度的4.7 mL 樣品溶液混勻，室溫靜置30 min 后，加入0.2 mL 5 mmol/L 菲洛嗪，靜置10 min 后于562 nm 波長處測定吸光度值。式中，A1——樣品的吸光度值；A2——空白組的吸光度值。按式（2）計算Fe2+螯合活性：

1.3.9 還原力 參考Alavi 等[8]的方法測定還原力。

1.3.10 疏水性的測定 在4 mL 樣品溶液（0.3 mg/mL）中加入20 μL ANS（8 mmol/L）作為熒光探針。熒光光譜激發(fā)波長為375 nm，發(fā)射波長為485 nm，波長范圍為380～650 nm，狹縫寬度為5 nm[9]。

1.3.11 熒光發(fā)射光譜的掃描 用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）配制成0.2 mg/mL 的樣品溶液。熒光光譜激發(fā)波長為290 nm，發(fā)散光譜掃描范圍為300～500 nm，狹縫寬度為5 nm[11]。

1.3.12 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）的測定 取2 mg 樣品加入0.2 g KBr，充分研磨混勻、壓片，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)測定FTIR[10]。

1.3.13 Zeta-電位的測定 將樣品溶解到50 mmol/L pH 7.0 PBS 中，配成10 mg/mL 的溶液。使用Zeta-電位分析儀測定，測試體積為1 mL，測試溫度為25 ℃[12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個處理重復3 次，結果以“平均數(shù)±標準差”表示，用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行方差分析，采用多重比較分析法對各組進行顯著性檢驗（P〈0.05），用Origin 2019b 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同魚皮肽的水解程度

為評價3 種魚皮肽的水解效果，在最適的pH和溫度條件下水解魚皮肽4 h，3 種魚皮肽的水解曲線如圖1a 所示。DH 是衡量蛋白質水解程度的重要參數(shù)[13]，表示水解物中斷裂的肽鍵占底物中總肽鍵的百分比[14]。堿性蛋白酶可作用于芳香族或疏水性氨基酸的C 端肽鍵，是非特異性內(nèi)切蛋白酶。前期研究表明，堿性蛋白酶為制備魚皮多肽的最適蛋白酶[7，15]。結果表明，隨著水解時間的延長，各魚皮肽的DH 值呈上升趨勢；在3 h 后，DH曲線變得平緩。其中，鱘魚皮肽具有較高的DH值。水解4 h 后，三文魚皮肽、鱘魚皮肽、鳙魚皮肽的DH 值分別為19.51%，22.34%，20.37%。3 種魚皮肽的水解趨勢與魚骨蛋白肽[16]和核桃蛋白肽[17]相似。

圖1 不同魚皮肽的DH（a）、TCA-NSI 和得率（b）Fig.1 DH（a），TCA-NSI and yield（b）of different fsh skin peptide

圖2 標準品相對分子質量色譜圖Fig.2 Chromatogram of relative molecular weight of standard substance

TCA-NSI 也可反映蛋白質的水解情況，TCANSI 越高表明多肽得率越高。水解程度會影響水解物的分子質量、氨基酸組成、結構特性和生物活性[18-19]。3 種魚皮肽水解4 h 后的TCA-NSI 和得率如圖1b 所示。3 種魚皮肽的TCA-NSI 之間存在顯著性差異（P〈0.05）。鱘魚皮肽的TCA-NSI 值最高（48.65%），其次是鳙魚皮肽（45.41%）和三文魚皮肽（40.98%）。與其它魚皮肽相比，鱘魚皮肽的得率最高（70.36%）。對DH 和TCA-NSI 進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，3 種魚皮肽中DH 與TCA-NSI 均呈正相關。

2.2 不同魚皮肽的分子質量分布

圖1 為標準品相對分子質量色譜圖，根據(jù)其對數(shù)與Kav值作曲線，得到標準曲線方程為y=-0.2099x+7.0174（R2=0.9907），說明線性關系良好。由表1 可知，3 種魚皮肽分子質量分布表現(xiàn)出一定的差異，小分子肽（180～3 000 u）含量為鱘魚皮肽〉鳙魚皮〉三文魚皮肽，表明鱘魚皮肽水解更為徹底。本研究表明，魚多肽分子質量分布與DH值呈負相關，這與Zhang 等[15]和Alavi 等[8]的研究結果一致。此外，Wu 等[2]發(fā)現(xiàn)，分子質量〈3 000 u的多肽具有較好的抗氧化活性，分子質量大小與抗氧化活性呈負相關。本研究制備的鱘魚皮肽具有較低的分子質量，推測其可能具有較高的抗氧化活性。

表1 不同魚皮肽的分子質量Table 1 Molecular weight of different fish skin peptides

2.3 不同魚皮肽的氨基酸組成

不同魚皮肽的氨基酸組成如表2 所示。鱘魚皮肽的總氨基酸含量最高（82.44 g/100 g），其次是鳙魚皮肽（78.14 g/100 g）和三文魚皮肽（77.44 g/100 g）。三文魚皮肽、鱘魚皮肽和鳙魚皮肽的酸性氨基酸（Glu 和Asp）分別占總氨基酸的15.98%，16.50%，15.5%，堿性氨基酸（Arg、Lys、His）分別占總氨基酸的11.41%，11.78%，11.31%，疏水性氨基酸（Trp、Phe、Val、Leu、Ile、Ala、Met 和Pro）分別占總氨基酸的26.74%，30.73%，31.30%。多肽中的疏水性氨基酸可清除自由基，與抗氧化活性相關[20]，水解過程中疏水性氨基酸C 末端的肽鍵斷裂，裂解后疏水性氨基酸處于新肽鏈的端基，可發(fā)揮其抗氧化效果[21]。His 的咪唑環(huán)可螯合金屬離子，進而抑制由金屬離子催化產(chǎn)生的氧化反應，使多肽具有良好的抗氧化活性[20]；Trp 可將質子提供給缺少電子的自由基，從而使自由基淬滅[22]；Gly 是強抗氧化劑谷胱甘肽的重要組成氨基酸，同時也是3 種魚皮肽含量最多的氨基酸。此外，短鏈多肽C端的Leu 也可增強其抗氧化活性[21]。綜上所述，不同魚皮肽的氨基酸含量和組成有所差異，魚皮肽的氨基酸組成與抗氧化活性有關。

表2 不同魚皮肽氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of different fish skin peptides

2.4 不同魚皮肽抗氧化肽活性的比較

以DPPH 自由基清除率、·OH 自由基清除率、Fe2+螯合活性和還原力評價多肽的抗氧化活性。不同抗氧化試驗的作用機制有所不同。DPPH 自由基遇到抗氧化劑時，會與含氫供體的抗氧化劑結合，結合強度可反映抗氧化活性的強弱[10]；·OH 的化學性質極其活躍，易與氨基酸、蛋白質、DNA 等生物分子發(fā)生反應，一旦與物質接觸，可在瞬間發(fā)生反應[5]；過渡金屬離子引發(fā)活性氧的產(chǎn)生，加速脂質過氧化連鎖反應，抗氧化劑對其螯合作用會延緩氧化反應[20]；還原力可表征抗氧化劑提供電子的能力，是評價抗氧化活性的重要指標[23]。

不同質量濃度（1.0～8.0 mg/mL）魚皮肽的抗氧化活性如圖3 所示?？寡趸囼灲Y果表明，魚皮肽的DPPH、·OH 自由基清除率、Fe2+螯合活性和還原力均呈濃度依賴性，這一結果與之前的報道一致[7，23]。雖然3 種魚皮肽均具有一定的抗氧化活性，但對比3 種魚皮肽發(fā)現(xiàn)，不同質量濃度下鱘魚皮肽的抗氧化活性顯著高于三文魚皮肽和鳙魚皮肽（P〈0.05）。胡曉等[5]研究表明，一定范圍內(nèi)羅非魚酶解肽的抗氧化活性隨水解程度的增加而增加，對其活性組分氨基酸含量進行鑒定發(fā)現(xiàn)，Trp、Gly 和His 為其含量較高的氨基酸，抗氧化活性可能與水解過程中多肽鏈的長度和氨基酸排列有關，本試驗也證明了這一觀點。水解之后，魚皮蛋白表面暴露了更多的非特異性蛋白組分，這些組分在二級結構中的α-螺旋和β-折疊中，可將Fe3+還原成Fe2+。魚皮肽還原力的不同與氨基酸側鏈基團中暴露的電子密度有關，電子密度起著極性或電荷部分的作用[6]。一般來說，多肽的抗氧化活性不僅與原料和蛋白質的一級結構有關，也與芳香族或疏水性氨基酸殘基的含量相關[24]。

圖3 不同質量濃度下不同魚皮肽的抗氧化活性比較Fig.3 Comparison of antioxidant activity of different fish skin peptides at different concentrations

2.5 不同魚皮肽結構特性的對比

2.5.1 疏水性分析 疏水性可表示蛋白質的疏水基團含量，是反映蛋白質分子結構的重要指標之一[25]。Wani 等[26]研究表明，多肽疏水性的差異主要取決于疏水性氨基酸的含量，這在抗氧化活性中起重要作用。不同魚皮肽的表面疏水性如圖4 所示。結果表明，鱘魚皮肽（431）和鳙魚皮肽（427）的表面疏水性顯著高于三文魚皮肽（387）（P 〈0.05），鱘魚皮肽和鳙魚皮肽中有較多的疏水性氨基酸，這與之前氨基酸分析結果一致。Noman 等[25]表明，疏水性與蛋白質的空間構象和暴露的氨基酸殘基有關。在水解過程中，蛋白酶對埋藏的疏水區(qū)進行了高特異性的切割，使蛋白分子內(nèi)部的疏水基團釋放出來[27]。

圖4 不同魚皮肽的疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of different fish skin peptides

2.5.2 熒光發(fā)射光譜分析 在蛋白質氨基酸中，Trp 具有熒光特性，且Trp 殘基對微環(huán)境的變化很敏感，其熒光強度可表征蛋白質的三級結構[28]。Trp殘基的特征峰為λ＝360 nm，熒光光譜峰位、峰強的改變都反映了色氨酸所處環(huán)境的變化。不同魚皮肽的熒光光譜如圖5 所示。三文魚皮肽、鱘魚皮肽和鳙 魚皮肽 的λmax分別為354.5，355.4，355.6 nm，3 種魚皮肽的熒光光譜峰位無顯著差異（P〉0.05）。3 種魚皮肽的λmax均在360 nm 附近，說明Trp 殘基位于蛋白質分子外部的極性環(huán)境中[29]。此外，在λ 最大值時，鱘魚皮肽熒光強度（357.2）〉鳙魚皮肽熒光強度（307.1）〉三文魚皮熒光強度（214.5）。結果表明，魚皮肽的熒光強度與水解度呈正相關。水解程度越大，魚皮蛋白會暴露出越多的Trp 殘基，這與氨基酸分析結果相一致，這對多肽的抗氧化活性有著積極作用。不同熒光基團的活性部位、肽類和暴露氨基酸的變化不同，導致熒光峰強度和λmax值不同[29]。

圖5 不同魚皮肽的熒光光譜、λmax 和熒光強度Fig.5 Fluorescence spectroscopic，λmax and fluorescence intensity of different fish skin peptides

2.5.3 FTIR 分析 FTIR 可表征大分子中官能團的振動和蛋白質的二級結構，波數(shù)的變化顯示了分子結構的變化，信號強度可代表相關官能團的濃度[30]。由圖6 可看出，魚皮肽的光譜相當復雜，包含許多不同官能團貢獻的譜帶，3 種魚皮肽在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)具有相似的吸收模式。3 種魚皮肽在3 500～3 000 cm-1之間存在較強吸收峰，表明多肽分子內(nèi)形成了C=O-N-H 的氫鍵[31]，且氫鍵含量為鳙魚皮肽〉鱘魚皮肽〉三文魚皮肽。3 000～2 800 cm-1的吸收峰與CH3和CH2的伸縮振動相關，這種伸縮振動通常發(fā)生在蛋白質的脂肪族側鏈中[18]，其中峰值位于2 924 cm-1和2 850 cm-1的振動吸收分別屬于CH2的對稱和非對稱拉伸振動[19]。同時，圖中SBPHs 的酰胺I 帶（1 700～1 600 cm-1）信號較強，這與C=O 鍵和肽鍵的C-N 伸縮振動有關，其峰型受蛋白質二級結構的影響[32]。這些結果表明，不同魚皮肽的內(nèi)部微環(huán)境和疏水區(qū)有一定差異。

圖6 不同魚皮肽的FTIR 譜圖Fig.6 FTIR spectra of different fish skin peptides

在FTIR 譜圖中，酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1）與C=O 鍵和肽鍵的C-N 伸縮振動有關，可反映蛋白質的二級結構[11]。圖6 中魚皮抗氧化肽的酰胺Ⅰ帶信號較強，其峰形受蛋白質二級結構的影響。利用Omnic 8.2 軟件和Peakfit 4.21 軟件得到高斯曲線擬合圖，根據(jù)各子峰峰面積計算魚皮肽二級結構的含量（表3）。各子峰與蛋白質二級結構歸屬關系為：1 664～1 646 cm-1為α-螺旋特征峰；1 700～1 682 cm-1和1 637～1 615 cm-1為β-折疊特征峰；1 681～1 664 cm-1為β-轉角特征峰；1 645～1 637 cm-1為無規(guī)卷曲特征峰[18]。α-螺旋結構是有序結構，易發(fā)生構象變化；β-折疊和β-轉角結構屬于相對伸展的有序結構，而無規(guī)卷曲結構是無序結構[9]。對比各二級結構含量發(fā)現(xiàn)魚皮肽中β-折疊結構的含量最高（34.14%～41.04%），無規(guī)卷曲結構含量最低（10.61%～11.80%），與已有報道一致[9]。前期研究表明，水解會使魚皮蛋白的二級結構由α-螺旋和β-折疊轉變?yōu)棣?轉角，魚皮的有序結構被破壞，蛋白分子變得柔韌疏松[23]。鳙魚皮肽中α-螺旋結構含量較高，三文魚皮和鳙魚皮肽的α-螺旋含量分別為24.41%和22.89%。α-螺旋是蛋白質二級結構中最穩(wěn)定的。鱘魚皮和鳙魚皮肽中β-折疊較低，表明蛋白質疏水相關位點暴露，暴露的疏水性氨基酸可促進多肽清除自由基的相關位點，進而提升抗多肽的抗氧化活性[11]。

表3 不同魚皮肽二級結構的含量Table 3 Estimated secondary structures of different fish skin peptides

2.5.4 Zeta-電位 蛋白質的Zeta-電位可表示溶液中蛋白分子的靜電相互作用，反映溶液的穩(wěn)定性[30]，其大小與帶電基團和氨基酸殘基的分布有關[33]。由圖7 可知，3 種魚皮肽的Zeta-電位均為負值，說明蛋白分子表面帶有大量負電荷，靜電斥力使顆粒散落分布而不易發(fā)生聚集[34]。鱘魚皮肽的Zeta-電位絕對值顯著高于鳙魚皮肽和三文魚皮肽（P〈0.05），可能是因為水解過程釋放的帶負電荷氨基酸多于帶正電荷的氨基酸所致。

圖7 不同魚皮肽的Zeta-電位Fig.7 Zeta-potential of different fish skin peptides

3 結論

研究表明，不同魚皮肽的氨基酸組成、蛋白質構象和微環(huán)境體系有一定的差異，造成其抗氧化活性有所差異。水解程度較高的鱘魚皮肽具有最高的抗氧化活性，同時鱘魚皮肽具有較高的熒光強度、疏水性和較低的Zeta-電位，表明其疏水性氨基酸含量較高。通過酶解技術挖掘了魚皮抗氧化肽，提升了魚皮副產(chǎn)物的應用價值和營養(yǎng)價值，可為水產(chǎn)源蛋白質加工深層次利用提供理論依據(jù)。隨著魚皮肽抗氧化活性研究的深入，下一步應對多肽-食物相互作用對其抗氧化活性和生物利用率展開研究。