張咚咚,趙金鳳,謝思源,胡鋒衛(wèi),吳 瓊,周顯青
(糧食儲(chǔ)藏與安全教育部工程研究中心 河南工業(yè)大學(xué)糧食和物資儲(chǔ)備學(xué)院 鄭州 450001)
糧食安全始終是全社會(huì)共同關(guān)注的重大問題之一,糧食安全的一大影響因素是微生物大量繁殖而導(dǎo)致的糧食腐敗變質(zhì),如霉變[1]。糧食自身含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),即使在收獲后也是一個(gè)活的生命體,會(huì)不斷地進(jìn)行新陳代謝,加之糧食籽粒表面攜帶大量的微生物,一旦儲(chǔ)藏不當(dāng)極易引起微生物的大量快速繁殖,從而造成糧食發(fā)熱、霉變,甚至代謝產(chǎn)生大量生物毒素,不但使糧食的食用品質(zhì)下降,還直接威脅人們的身體健康[2-3]。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì),全球每年有2%的糧食因霉變而不能食用。我國(guó)糧食霉變的情況也十分嚴(yán)重,尤其是在一些高溫陰雨時(shí)節(jié),糧食存放不當(dāng)極易引起吸濕、霉變。從數(shù)量上來看糧食表面的微生物細(xì)菌最多,霉菌次之;從危害程度上來看,雖然霉菌數(shù)量相對(duì)較少,但是其對(duì)生存環(huán)境的要求不高,在相對(duì)惡劣的環(huán)境下也能快速生長(zhǎng)繁殖,是引起糧食腐敗變質(zhì)的主要微生物類群,同時(shí)代謝生成的真菌毒素也嚴(yán)重威脅人們的身體健康,對(duì)糧食儲(chǔ)藏安全的影響較大[4-5]。
玉米是我國(guó)的主要糧食作物之一,產(chǎn)量約占全國(guó)糧食總產(chǎn)量的1/4,是主要的商品糧和戰(zhàn)略儲(chǔ)備糧種之一,也是我國(guó)重要的飼料原料和食品工業(yè)原料。玉米籽粒的胚部較大,營(yíng)養(yǎng)豐富,吸濕性強(qiáng),表面帶菌量大,加上玉米收獲時(shí)水分較高等多種因素,使其成為最易受到微生物侵害的糧種,導(dǎo)致其儲(chǔ)藏過程中極易出現(xiàn)發(fā)熱、霉變、真菌毒素超標(biāo)[6-7]。玉米儲(chǔ)藏過程中常見的霉菌有青霉屬、曲霉屬、根霉屬、鐮刀霉屬等[8],它們可代謝產(chǎn)生如黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等真菌毒素,直接威脅人們的生命健康[9]。
在保障玉米安全儲(chǔ)藏過程中,較多采用的是烘干、充氮?dú)庹{(diào)、低溫儲(chǔ)藏等手段來降低環(huán)境中的水分、氧氣含量、環(huán)境溫度等以抑制微生物的生長(zhǎng)和霉變[10-11]。然而,這些手段不僅耗能高、費(fèi)用高,還會(huì)出現(xiàn)局部?jī)?chǔ)藏環(huán)境異常,導(dǎo)致玉米表面微生物的快速生長(zhǎng)繁殖,出現(xiàn)發(fā)熱、霉變現(xiàn)象,并不可避免地導(dǎo)致真菌毒素超標(biāo)。這其中有一大因素是玉米表面的微生物種群和生長(zhǎng)、繁殖以及代謝規(guī)律不明確,不能提前感知、預(yù)測(cè)微生物的發(fā)生、發(fā)展及代謝規(guī)律[12-13]。
明確玉米中微生物種群特征及其多樣性,是闡明其儲(chǔ)藏過程中微生物發(fā)生、發(fā)展規(guī)律的首要條件。本研究采用經(jīng)典的微生物學(xué)手段對(duì)玉米表面可培養(yǎng)微生物進(jìn)行分離、純化,然后針對(duì)所得菌種進(jìn)行測(cè)序,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Phylogenetic trees),進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。環(huán)境中可培養(yǎng)微生物種類只占微生物總量的10%以下[14]。高通量測(cè)序技術(shù)是目前微生物多樣性研究中使用最廣泛的測(cè)序技術(shù),具有高通量、低成本、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn),不僅能夠快速分析復(fù)雜微生物群落多樣性,還能檢測(cè)到較低豐度及不可培養(yǎng)的微生物[15-17]。本文采用高通量測(cè)序技術(shù)分析玉米表面的細(xì)菌和真菌群落,揭示其儲(chǔ)藏過程中細(xì)菌和真菌的演替規(guī)律。
玉米:2021 年購于鄭州市高新區(qū)古滎村。
營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(LB)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA),北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;瓊脂粉、丙三醇、Ezup 柱式細(xì)菌、真菌基因組DNA抽提試劑盒、RnaseA 酶、6×Loding dye、瓊脂糖BBI、50×TAE、無毒核酸染料、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker、引物、ddH2O,1×TE、Big 2×super pcr mix,生工生物工程(上海)股份有限公司。
2720 thermal cycler PCR 儀,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;DYCP-31DNDNA 電泳槽、DYY-5 穩(wěn)壓電泳儀、紫外分析儀,北京六一儀器廠;DW-86L630 低溫保存箱,澳柯瑪股份有限公司;凝膠成像系統(tǒng),BIO-RAD 公司。
1.3.1 玉米中微生物的分離與純化 稱取玉米樣品25 g,在無菌環(huán)境中加入裝有225 mL 無菌水的三角瓶中,搖床振蕩30 min,得到菌懸液。采用稀釋平板法[18],取1 mL 菌懸液于9 mL 無菌蒸餾水中,依次稀釋成10-2,10-3,10-4,10-5濃度梯度的菌懸液。取不同稀釋梯度的菌懸液100 μL,加入標(biāo)記好的LB 和PDA 培養(yǎng)基平板中,用無菌涂布棒涂布均勻后,將LB 和PDA 平板分別置于37 ℃和28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。菌落形態(tài)觀察包括:菌落大小、顏色、高度,菌絲長(zhǎng)短,氣生菌絲質(zhì)地(絨毛狀、棉絮狀、粉粒狀、氈狀或毯狀等),菌落表面紋飾(皺紋、輻射溝紋或同心紋),菌落背面顏色等特征。挑取單個(gè)菌落在相應(yīng)的培養(yǎng)基多次純化,然后將菌落置30%甘油中,于-80 ℃冰箱保藏,備用。
1.3.2 細(xì)菌菌株的分子生物學(xué)鑒定 菌株活化:取1 管冰箱中保藏的菌株,室溫解凍,在平板上活化兩代。
引物序列:27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3')、1492R(5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3')。
PCR 擴(kuò)增:PCR 擴(kuò)增體系:25 μL 2×高保真PCR 預(yù)混反應(yīng)液(Big 2×super pcr mix),濃度為10 μmol/L 的引物各1 μL,模板DNA 2 μL,加dd H2O 至總體積50 μL。擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延 伸1 min,30 次循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),凝膠成像分析儀觀察電泳結(jié)果,將亮度清晰且條帶長(zhǎng)度1 500 bp 的PCR 產(chǎn)物送華大基因科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果輸入美國(guó)國(guó)家生物信息技術(shù)中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對(duì),比對(duì)和查找親源關(guān)系較近菌株的基因序列并下載。使用MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定菌株的分類地位。
1.3.3 真菌菌株的分子生物學(xué)鑒定 DNA 模板的制備:將純化的菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后,刮取約0.2 g 菌絲體,置于1.5 mL 滅菌離心管中,然后將菌體放入研缽(-80 ℃預(yù)冷)中,反復(fù)液氮研磨至細(xì)粉狀,迅速平均分裝至2 個(gè)1.5 mL 離心管中。用Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒,按其操作步驟提取真菌基因組DNA。使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 的濃度。檢測(cè)合格后將DNA 樣品保存在-20 ℃,備用。
ITS 序列擴(kuò)增引物:ITS1:5'-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3' 和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3'。
PCR 擴(kuò)增:PCR 擴(kuò)增體系:25 μL Big 2×super pcr mix,濃度為10 μmol/L 的引物各1 μL,模板DNA 2 μL,加dd H2O 至總體積50 μL。擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30 次循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電脈檢測(cè),用凝膠成像分析儀觀察電泳結(jié)果。將亮度清晰且條帶長(zhǎng)度600 bp 的PCR 產(chǎn)物送華大基因科技有限公司測(cè)序。
1.3.4 微生物的多樣性分析 樣品準(zhǔn)備:稱取玉米50 g,置于450 mL 無菌水中,密封后在恒溫?fù)u床中振蕩30 min。用0.22 μm 濾膜抽濾菌懸液,獲得的菌體吸附在濾膜上。將該濾膜在4 ℃下送武漢菲沙基因有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。
數(shù)據(jù)分析:根據(jù)細(xì)菌和真菌的不同,采用PCR方法對(duì)其高度保守序列如16S/18S/ITS 進(jìn)行擴(kuò)增,用PacBio 測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。PacBio SMRT 測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù),通過比對(duì)自我糾錯(cuò),得到高質(zhì)量的環(huán)狀一致性序列(CCS),然后經(jīng)去嵌合體序列等步驟,得到有效數(shù)據(jù)(Clean Data)。將最終有效數(shù)據(jù)用QIIME[19]軟件中的UCLUS 在97%的相似度水平下進(jìn)行可操作分類單元(Operational taxonomic units,OTU)聚類,并基于細(xì)菌NCBI 和真菌UNITE分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)OTU 進(jìn)行分類學(xué)注釋,再對(duì)OTU進(jìn)行物種組成分析、多樣性指數(shù)等分析[11,20]。在OTU 水平上計(jì)算覆蓋度指數(shù)(Coverage)、豐富度指數(shù)(Chao1 和Ace)和多樣性指數(shù)(Shannon-wienner 和Simpson),并在門和屬分類水平上統(tǒng)計(jì)群落組成。
經(jīng)分離與純化,共得到11 株不同的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌株,分別編號(hào)為B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6、B-7、B-8、B-9、B-10、B-11,其菌落都具有細(xì)菌的典型菌落特征(圖1)。分別提取每株細(xì)菌的DNA,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,獲得1 500 bp 左右的清晰條帶,電泳條帶清晰,符合測(cè)序要求,其特征如圖2 所示。將相應(yīng)的PCR 產(chǎn)物序列送往華大基因科技有限公司測(cè)序。
圖2 細(xì)菌PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoretic results of bacterial PCR amplification products
經(jīng)分離與純化,共得到12 株不同霉菌的優(yōu)勢(shì)菌株,分別編號(hào)為M-2、M-3、M-4、M-5、M-7、M-10、M-18、M-21、M-24、M-30、M-31、M-33,其菌落都具有真菌的典型群落特征(圖3)。采用ITS 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,獲得600 bp 左右的清晰條帶,符合測(cè)序要求,其特征如圖4 所示。將相應(yīng)的PCR 產(chǎn)物序列送往華大基因科技有限公司測(cè)序。
圖3 分離純化的優(yōu)勢(shì)霉菌菌落特征Fig.3 Colony characteristics of the isolated and purified dominant mould
圖4 真菌PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoretic results of fungal PCR amplification products
將華大基因科技有限公司反饋的每個(gè)菌株的基因序列上傳至Genbank,獲得相應(yīng)的序列號(hào)(Accession number)。同時(shí)采用MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,獲得親緣關(guān)系最近的菌株名稱。該序列對(duì)應(yīng)的名稱即該菌株種屬,所分離的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌、霉菌菌株的Genbank 序列號(hào)和菌株名稱見表1。
表1 玉米中部分細(xì)菌和霉菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果Table 1 Molecular biological identification results of some bacteria and fungi in maize
2.3.1 細(xì)菌α-多樣性分析
1)稀釋曲線 采用隨機(jī)抽取序列的方法,利用qiime 構(gòu)建稀釋曲線圖(Rarefaction curve)。從樣品中細(xì)菌的稀釋曲線(圖5)可以看出,隨著測(cè)序數(shù)量的增加,它們所能代表構(gòu)建的OTUs 數(shù)量也增加,曲線的斜率先上升后變得平坦,說明該樣本的測(cè)序量充足,測(cè)序結(jié)果可靠,能夠反映樣品中微生物群落的種類和結(jié)構(gòu)。
圖5 細(xì)菌樣品的序列稀釋曲線圖Fig.5 Dilution curve of bacterial sample
2)秩-豐度曲線 秩-豐度曲線可直觀反映樣品中包含的物種分類豐富度和均勻度,該樣品的秩-豐度曲線(Rank abundance)較寬且平坦,表明儲(chǔ)藏玉米中的細(xì)菌群落具有良好的豐富度和均勻度(圖6)。
圖6 細(xì)菌樣品的秩-豐度曲線Fig.6 Rank-abundance curve of bacteria sample
3)α-多樣性指數(shù) 細(xì)菌群落多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)見表2。α-多樣性指數(shù)反映樣品內(nèi)部物種的豐富度和多樣性。根據(jù)97%相似性水平下的OTU 信息,采用α-多樣性指標(biāo)的覆蓋率、Chao1、ACE,Shannon 指 數(shù)、Simpson、PD-whole-tree 指數(shù)對(duì) 樣品微生物物種的豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估。
表2 細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)Table 2 Diversity index of bacterial community
每個(gè)樣 品的覆蓋率、Chao1、ACE,指數(shù)和Simpson、Shannon 指數(shù)分別用于評(píng)估物種的測(cè)序深度、豐度和多樣性。覆蓋率反映樣本的真實(shí)情況,該指數(shù)越高,樣本中序列未被測(cè)出的概率越低。Chao1、ACE 指數(shù)是群落豐度指數(shù),Chao1、ACE指數(shù)越大,樣品微生物群落豐度越高。Shannon、Simpson 指數(shù)是群落分布多樣性指數(shù),Simpson 指數(shù)越大,群落多樣性越低,而Shannon 指數(shù)越大,樣品微生物多樣性越高。由表2 可知樣品中的序列基本被測(cè)出,即樣本測(cè)序結(jié)果可以反映樣品的真實(shí)情況,并具有較高的豐富度和均勻性。
2.3.2 屬分類水平上的物種組成分析 采用軟件SMRT Link v8.0 對(duì)PacBio SMRT 測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和過濾,經(jīng)測(cè)序分析得到14 734 條有效序列數(shù)據(jù),序列長(zhǎng)度在1 300~1 600 bp 之間,平均長(zhǎng)度1 452 bp。用qiime 軟件對(duì)有效序列進(jìn)行OTU 聚類,結(jié)果顯示14 734 條有效序列數(shù)據(jù)分歸于176 個(gè)OTU 單元。
根據(jù)OTU 物種注釋結(jié)果,可以了解每個(gè)樣品的物種組成及其相對(duì)豐度。將檢測(cè)合格的序列在97%的相似度下被劃分至176 個(gè)OTU 中,從每個(gè)OTU 中挑選1 條代表性序列進(jìn)行比對(duì),然后統(tǒng)計(jì)其界、門、綱、目、科和屬的種類和數(shù)量。在屬分類水平上豐度排名前20 的群落中(圖7),豐度最高的細(xì)菌屬是泛菌屬(Pantoea),所占比例為14.8%,腸球菌屬(Enterococcus)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)所占比例均占10%以上,這與Liu 等[21]和陳澤斌等[22]研究結(jié)果基本一致。腸球菌屬(Enterococcus)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)差異較小,不足0.5%。其它組分如黃桿菌屬(Flavobacterium)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、無色桿菌屬(Achromobacter)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、鞘脂菌屬(Sphingobium)、乳球菌屬(Lactococcus)等含量較低,均不足1%。Others 表示圖中這30 個(gè)物種之外的其它所有物種的相對(duì)豐度之和,占微生物總量的27.1%。較多的研究認(rèn)為玉米表面細(xì)菌的變化不會(huì)影響其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性,而作為玉米粒內(nèi)部菌群的主要來源,其表面細(xì)菌的變化直接影響玉米內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu),從而影響玉米籽粒的生理和病理特性。該研究中豐度較高的泛菌屬、腸球菌屬、鞘氨醇桿菌屬、伯克霍爾德菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、短波單胞菌屬都是玉米內(nèi)生菌的主要來源[23]。也有研究表明,在儲(chǔ)藏過程中不控制玉米中細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖,其生長(zhǎng)過程對(duì)周圍環(huán)境的影響,比如增加底物的水解,造成環(huán)境溫度升高等,也會(huì)影響真菌的生長(zhǎng)和群落結(jié)構(gòu)[24]。同時(shí),玉米中細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖會(huì)直接影響玉米中微生物含量,從而影響玉米粉的質(zhì)量與安全[25]。
圖7 玉米中細(xì)菌群落在屬分類水平上的組成分布Fig.7 The composition distribution of bacteria in maize on genus classification level
2.4.1 生物信息學(xué)分析 采用Illumina MiSeq 平臺(tái)對(duì)群落DNA 片段進(jìn)行雙端(Paired-end)測(cè)序,共得到120 580 條序列。通過qiime 軟件,采用DADA2 方法對(duì)原始序列去噪。去除低質(zhì)量序列后得到112 912 條序列,去噪后得到112 772 條序列,拼接后得到112 288 條序列,去除嵌合體后得到104 589 條序列(表3)。
表3 樣本測(cè)序量統(tǒng)計(jì)表Table 3 Statistical table of sample sequencing amount
對(duì)去除嵌合體后的高質(zhì)量片段進(jìn)行序列長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)高質(zhì)量序列長(zhǎng)度大都在200~250 bp 間,如圖8 所示。
圖8 序列長(zhǎng)度分布圖Fig.8 Sequence length distribution
圖9 真菌豐度等級(jí)曲線圖Fig.9 Fungal abundance grade curve
2.4.2 α-多樣性分析
2.4.2.1 α-多樣性指數(shù) 真菌群落多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)見表4。樣本的α-多樣性指數(shù)中Chao1 和Observed specie 與群落的豐富度有關(guān),OTU 數(shù)量亦可以代表樣品物種的豐度。Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)與群落的多樣性有關(guān)。Pielou's evenness 指數(shù)和Good's coverage 指數(shù)(測(cè)序深度指數(shù))分別表征群落的均勻度和檢出的物種所占比例。由表4 可知,Good's coverage 指數(shù)大于0.9,說明樣品文庫中序列基本被測(cè)出。由其它指數(shù)可以看出所測(cè)樣本中真菌菌群有較好的豐富度、多樣性和均勻性。
表4 真菌群落的多樣性指數(shù)Table 4 Diversity index of fungal community
2.4.2.2 豐度等級(jí)曲線 樣品的群落豐度等級(jí)曲線(Rank abundance curve)的折線總體較為平緩(圖10),說明樣本中各真菌群落OTU 間的豐度差異小,群落組成的均勻度較高,豐度分布較為均勻。
圖10 玉米中真菌群落在屬分類水平上的組成分布Fig.10 The composition distribution of fungi in maize on genus classification level
2.4.3 屬分類水平上的物種組成分析 針對(duì)真菌的ITS 序列,采用UNITE 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋,各分類水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表5。經(jīng)分析比對(duì)OTUs,共鑒定到2 門、9 綱、10 目、14 科、21 屬、22 種。
表5 各水平微生物分類單元數(shù)統(tǒng)計(jì)表Table 5 Statistical table of microbial taxa number at each level
統(tǒng)計(jì)在屬(Genus)分類水平上豐度大于0.1%的群落,得到儲(chǔ)藏玉米中真菌物種組成餅圖(圖9)。真菌中豐度最高的菌群為鐮刀菌屬(Fusarium),所占比例為50.1%,其次為帚枝霉屬(Sarocladium),所占比例為28.2%,籃狀菌屬(Talaromyces)占9.6%,青霉屬(Penicillium)占2.7%,曲霉屬0.2%等。這與文獻(xiàn)[26]和[27]研究結(jié)果一致。其它組分如念珠菌屬(Candida)、節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia)、季也蒙畢赤酵母(Meyerozyma)、赤霉菌屬(Gibberella)等含量較低,所占比例均不足1%,未分類霉菌屬(unclassified_Fungi)占總量的8%。在玉米中的優(yōu)勢(shì)菌屬中,帚枝霉屬(Sarocladium)主要有玉米類帚枝霉(S.zeae)、糾纏帚枝霉(S.implicatum)和未分類種共3 個(gè)種,籃狀菌屬(Talaromyces)主要有沃特曼籃狀菌(T.wortmannii)、產(chǎn)紫籃狀菌(T.purpureogenus)、白雙輪籃狀菌(T.albobiverticillius)和2 個(gè)未分類種,共5 個(gè)種。青霉屬(Penicillium)主要有P.bissettii、草酸青霉(P.oxalicum)和類阿達(dá)青霉(P.adametzioides)3 個(gè)種,曲霉屬(Aspergillus)主要有黃曲霉(A.flavus)、黑曲霉(A.niger)、赤曲霉(A.ruber)3 個(gè)種。霉菌在生長(zhǎng)過程中,一方面代謝產(chǎn)生一些淀粉酶、蛋白酶、普魯蘭酶、木聚糖酶等酶類水解底物供自身利用,另一方面產(chǎn)生一些諸如酮類、肽類、毒素類等代謝產(chǎn)物來抑制其它微生物,尤其是細(xì)菌的生長(zhǎng)[28]。玉米中富含的曲霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬等霉菌屬,是黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、展青霉素、T-2 毒素等真菌毒素污染的主要代謝產(chǎn)物。如果能夠有效抑制玉米表面的優(yōu)勢(shì)霉菌的生長(zhǎng)代謝,則有助于控制玉米中的真菌毒素污染問題[29]。
對(duì)玉米表面的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和真菌進(jìn)行分離純化,共獲得11 株細(xì)菌菌株和12 株霉菌菌株。通過其保守序列的PCR 測(cè)序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,初步鑒定其菌株名稱。通過高通量測(cè)序技術(shù)分析玉米中細(xì)菌和真菌的多樣性。結(jié)果表明,玉米中主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為泛菌屬、腸球菌屬、鞘氨醇桿、金黃桿菌屬,主要的優(yōu)勢(shì)真菌為鐮刀菌屬、帚枝霉、籃狀菌屬、青霉屬、曲霉屬。高通量測(cè)序分析所得結(jié)果中高豐度細(xì)菌和真菌種類與分離純化得到的菌株結(jié)果基本一致。表明鐮刀菌、青霉、曲霉等是玉米中主要的污染真菌,這些菌株也是代謝產(chǎn)生真菌毒素的重要菌群,對(duì)儲(chǔ)糧安全有重要影響[30-31]。