張咚咚，趙金鳳，謝思源，胡鋒衛(wèi)，吳 瓊，周顯青

（糧食儲藏與安全教育部工程研究中心 河南工業(yè)大學糧食和物資儲備學院 鄭州 450001）

糧食安全始終是全社會共同關(guān)注的重大問題之一，糧食安全的一大影響因素是微生物大量繁殖而導致的糧食腐敗變質(zhì)，如霉變[1]。糧食自身含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，即使在收獲后也是一個活的生命體，會不斷地進行新陳代謝，加之糧食籽粒表面攜帶大量的微生物，一旦儲藏不當極易引起微生物的大量快速繁殖，從而造成糧食發(fā)熱、霉變，甚至代謝產(chǎn)生大量生物毒素，不但使糧食的食用品質(zhì)下降，還直接威脅人們的身體健康[2-3]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，全球每年有2%的糧食因霉變而不能食用。我國糧食霉變的情況也十分嚴重，尤其是在一些高溫陰雨時節(jié)，糧食存放不當極易引起吸濕、霉變。從數(shù)量上來看糧食表面的微生物細菌最多，霉菌次之；從危害程度上來看，雖然霉菌數(shù)量相對較少，但是其對生存環(huán)境的要求不高，在相對惡劣的環(huán)境下也能快速生長繁殖，是引起糧食腐敗變質(zhì)的主要微生物類群，同時代謝生成的真菌毒素也嚴重威脅人們的身體健康，對糧食儲藏安全的影響較大[4-5]。

玉米是我國的主要糧食作物之一，產(chǎn)量約占全國糧食總產(chǎn)量的1/4，是主要的商品糧和戰(zhàn)略儲備糧種之一，也是我國重要的飼料原料和食品工業(yè)原料。玉米籽粒的胚部較大，營養(yǎng)豐富，吸濕性強，表面帶菌量大，加上玉米收獲時水分較高等多種因素，使其成為最易受到微生物侵害的糧種，導致其儲藏過程中極易出現(xiàn)發(fā)熱、霉變、真菌毒素超標[6-7]。玉米儲藏過程中常見的霉菌有青霉屬、曲霉屬、根霉屬、鐮刀霉屬等[8]，它們可代謝產(chǎn)生如黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等真菌毒素，直接威脅人們的生命健康[9]。

在保障玉米安全儲藏過程中，較多采用的是烘干、充氮氣調(diào)、低溫儲藏等手段來降低環(huán)境中的水分、氧氣含量、環(huán)境溫度等以抑制微生物的生長和霉變[10-11]。然而，這些手段不僅耗能高、費用高，還會出現(xiàn)局部儲藏環(huán)境異常，導致玉米表面微生物的快速生長繁殖，出現(xiàn)發(fā)熱、霉變現(xiàn)象，并不可避免地導致真菌毒素超標。這其中有一大因素是玉米表面的微生物種群和生長、繁殖以及代謝規(guī)律不明確，不能提前感知、預測微生物的發(fā)生、發(fā)展及代謝規(guī)律[12-13]。

明確玉米中微生物種群特征及其多樣性，是闡明其儲藏過程中微生物發(fā)生、發(fā)展規(guī)律的首要條件。本研究采用經(jīng)典的微生物學手段對玉米表面可培養(yǎng)微生物進行分離、純化，然后針對所得菌種進行測序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Phylogenetic trees），進行分子生物學鑒定。環(huán)境中可培養(yǎng)微生物種類只占微生物總量的10%以下[14]。高通量測序技術(shù)是目前微生物多樣性研究中使用最廣泛的測序技術(shù)，具有高通量、低成本、準確率高等優(yōu)點，不僅能夠快速分析復雜微生物群落多樣性，還能檢測到較低豐度及不可培養(yǎng)的微生物[15-17]。本文采用高通量測序技術(shù)分析玉米表面的細菌和真菌群落，揭示其儲藏過程中細菌和真菌的演替規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米：2021 年購于鄭州市高新區(qū)古滎村。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（LB）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；瓊脂粉、丙三醇、Ezup 柱式細菌、真菌基因組DNA抽提試劑盒、RnaseA 酶、6×Loding dye、瓊脂糖BBI、50×TAE、無毒核酸染料、DNA 分子量標準Marker、引物、ddH2O，1×TE、Big 2×super pcr mix，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2720 thermal cycler PCR 儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DYCP-31DNDNA 電泳槽、DYY-5 穩(wěn)壓電泳儀、紫外分析儀，北京六一儀器廠；DW-86L630 低溫保存箱，澳柯瑪股份有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，BIO-RAD 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米中微生物的分離與純化 稱取玉米樣品25 g，在無菌環(huán)境中加入裝有225 mL 無菌水的三角瓶中，搖床振蕩30 min，得到菌懸液。采用稀釋平板法[18]，取1 mL 菌懸液于9 mL 無菌蒸餾水中，依次稀釋成10-2，10-3，10-4，10-5濃度梯度的菌懸液。取不同稀釋梯度的菌懸液100 μL，加入標記好的LB 和PDA 培養(yǎng)基平板中，用無菌涂布棒涂布均勻后，將LB 和PDA 平板分別置于37 ℃和28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。菌落形態(tài)觀察包括：菌落大小、顏色、高度，菌絲長短，氣生菌絲質(zhì)地（絨毛狀、棉絮狀、粉粒狀、氈狀或毯狀等），菌落表面紋飾（皺紋、輻射溝紋或同心紋），菌落背面顏色等特征。挑取單個菌落在相應(yīng)的培養(yǎng)基多次純化，然后將菌落置30%甘油中，于-80 ℃冰箱保藏，備用。

1.3.2 細菌菌株的分子生物學鑒定 菌株活化：取1 管冰箱中保藏的菌株，室溫解凍，在平板上活化兩代。

引物序列：27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'）、1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）。

PCR 擴增：PCR 擴增體系：25 μL 2×高保真PCR 預混反應(yīng)液（Big 2×super pcr mix），濃度為10 μmol/L 的引物各1 μL，模板DNA 2 μL，加dd H2O 至總體積50 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延 伸1 min，30 次循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析儀觀察電泳結(jié)果，將亮度清晰且條帶長度1 500 bp 的PCR 產(chǎn)物送華大基因科技有限公司測序。測序結(jié)果輸入美國國家生物信息技術(shù)中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對，比對和查找親源關(guān)系較近菌株的基因序列并下載。使用MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的分類地位。

1.3.3 真菌菌株的分子生物學鑒定 DNA 模板的制備：將純化的菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，刮取約0.2 g 菌絲體，置于1.5 mL 滅菌離心管中，然后將菌體放入研缽（-80 ℃預冷）中，反復液氮研磨至細粉狀，迅速平均分裝至2 個1.5 mL 離心管中。用Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒，按其操作步驟提取真菌基因組DNA。使用紫外分光光度計檢測DNA 的濃度。檢測合格后將DNA 樣品保存在-20 ℃，備用。

ITS 序列擴增引物：ITS1：5'-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3' 和ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3'。

PCR 擴增：PCR 擴增體系：25 μL Big 2×super pcr mix，濃度為10 μmol/L 的引物各1 μL，模板DNA 2 μL，加dd H2O 至總體積50 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 次循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電脈檢測，用凝膠成像分析儀觀察電泳結(jié)果。將亮度清晰且條帶長度600 bp 的PCR 產(chǎn)物送華大基因科技有限公司測序。

1.3.4 微生物的多樣性分析 樣品準備：稱取玉米50 g，置于450 mL 無菌水中，密封后在恒溫搖床中振蕩30 min。用0.22 μm 濾膜抽濾菌懸液，獲得的菌體吸附在濾膜上。將該濾膜在4 ℃下送武漢菲沙基因有限公司進行高通量測序。

數(shù)據(jù)分析：根據(jù)細菌和真菌的不同，采用PCR方法對其高度保守序列如16S/18S/ITS 進行擴增，用PacBio 測序平臺測序。PacBio SMRT 測序得到的原始數(shù)據(jù)，通過比對自我糾錯，得到高質(zhì)量的環(huán)狀一致性序列（CCS），然后經(jīng)去嵌合體序列等步驟，得到有效數(shù)據(jù)（Clean Data）。將最終有效數(shù)據(jù)用QIIME[19]軟件中的UCLUS 在97%的相似度水平下進行可操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU）聚類，并基于細菌NCBI 和真菌UNITE分類學數(shù)據(jù)庫對OTU 進行分類學注釋，再對OTU進行物種組成分析、多樣性指數(shù)等分析[11，20]。在OTU 水平上計算覆蓋度指數(shù)（Coverage）、豐富度指數(shù)（Chao1 和Ace）和多樣性指數(shù)（Shannon-wienner 和Simpson），并在門和屬分類水平上統(tǒng)計群落組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢菌株的分離純化與保守序列的提取

經(jīng)分離與純化，共得到11 株不同的細菌優(yōu)勢菌株，分別編號為B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6、B-7、B-8、B-9、B-10、B-11，其菌落都具有細菌的典型菌落特征（圖1）。分別提取每株細菌的DNA，進行PCR 擴增，獲得1 500 bp 左右的清晰條帶，電泳條帶清晰，符合測序要求，其特征如圖2 所示。將相應(yīng)的PCR 產(chǎn)物序列送往華大基因科技有限公司測序。

圖2 細菌PCR 擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoretic results of bacterial PCR amplification products

經(jīng)分離與純化，共得到12 株不同霉菌的優(yōu)勢菌株，分別編號為M-2、M-3、M-4、M-5、M-7、M-10、M-18、M-21、M-24、M-30、M-31、M-33，其菌落都具有真菌的典型群落特征（圖3）。采用ITS 通用引物進行PCR 擴增，獲得600 bp 左右的清晰條帶，符合測序要求，其特征如圖4 所示。將相應(yīng)的PCR 產(chǎn)物序列送往華大基因科技有限公司測序。

圖3 分離純化的優(yōu)勢霉菌菌落特征Fig.3 Colony characteristics of the isolated and purified dominant mould

圖4 真菌PCR 擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoretic results of fungal PCR amplification products

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與比對

將華大基因科技有限公司反饋的每個菌株的基因序列上傳至Genbank，獲得相應(yīng)的序列號（Accession number）。同時采用MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得親緣關(guān)系最近的菌株名稱。該序列對應(yīng)的名稱即該菌株種屬，所分離的優(yōu)勢細菌、霉菌菌株的Genbank 序列號和菌株名稱見表1。

表1 玉米中部分細菌和霉菌的分子生物學鑒定結(jié)果Table 1 Molecular biological identification results of some bacteria and fungi in maize

2.3 玉米中細菌群落多樣性分析

2.3.1 細菌α-多樣性分析

1）稀釋曲線 采用隨機抽取序列的方法，利用qiime 構(gòu)建稀釋曲線圖（Rarefaction curve）。從樣品中細菌的稀釋曲線（圖5）可以看出，隨著測序數(shù)量的增加，它們所能代表構(gòu)建的OTUs 數(shù)量也增加，曲線的斜率先上升后變得平坦，說明該樣本的測序量充足，測序結(jié)果可靠，能夠反映樣品中微生物群落的種類和結(jié)構(gòu)。

圖5 細菌樣品的序列稀釋曲線圖Fig.5 Dilution curve of bacterial sample

2）秩-豐度曲線 秩-豐度曲線可直觀反映樣品中包含的物種分類豐富度和均勻度，該樣品的秩-豐度曲線（Rank abundance）較寬且平坦，表明儲藏玉米中的細菌群落具有良好的豐富度和均勻度（圖6）。

圖6 細菌樣品的秩-豐度曲線Fig.6 Rank-abundance curve of bacteria sample

3）α-多樣性指數(shù) 細菌群落多樣性指數(shù)統(tǒng)計見表2。α-多樣性指數(shù)反映樣品內(nèi)部物種的豐富度和多樣性。根據(jù)97%相似性水平下的OTU 信息，采用α-多樣性指標的覆蓋率、Chao1、ACE，Shannon 指 數(shù)、Simpson、PD-whole-tree 指數(shù)對 樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估。

表2 細菌群落的多樣性指數(shù)Table 2 Diversity index of bacterial community

每個樣 品的覆蓋率、Chao1、ACE，指數(shù)和Simpson、Shannon 指數(shù)分別用于評估物種的測序深度、豐度和多樣性。覆蓋率反映樣本的真實情況，該指數(shù)越高，樣本中序列未被測出的概率越低。Chao1、ACE 指數(shù)是群落豐度指數(shù)，Chao1、ACE指數(shù)越大，樣品微生物群落豐度越高。Shannon、Simpson 指數(shù)是群落分布多樣性指數(shù)，Simpson 指數(shù)越大，群落多樣性越低，而Shannon 指數(shù)越大，樣品微生物多樣性越高。由表2 可知樣品中的序列基本被測出，即樣本測序結(jié)果可以反映樣品的真實情況，并具有較高的豐富度和均勻性。

2.3.2 屬分類水平上的物種組成分析 采用軟件SMRT Link v8.0 對PacBio SMRT 測序得到的原始數(shù)據(jù)進行預處理和過濾，經(jīng)測序分析得到14 734 條有效序列數(shù)據(jù)，序列長度在1 300～1 600 bp 之間，平均長度1 452 bp。用qiime 軟件對有效序列進行OTU 聚類，結(jié)果顯示14 734 條有效序列數(shù)據(jù)分歸于176 個OTU 單元。

根據(jù)OTU 物種注釋結(jié)果，可以了解每個樣品的物種組成及其相對豐度。將檢測合格的序列在97%的相似度下被劃分至176 個OTU 中，從每個OTU 中挑選1 條代表性序列進行比對，然后統(tǒng)計其界、門、綱、目、科和屬的種類和數(shù)量。在屬分類水平上豐度排名前20 的群落中（圖7），豐度最高的細菌屬是泛菌屬（Pantoea），所占比例為14.8%，腸球菌屬（Enterococcus）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）所占比例均占10%以上，這與Liu 等[21]和陳澤斌等[22]研究結(jié)果基本一致。腸球菌屬（Enterococcus）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）差異較小，不足0.5%。其它組分如黃桿菌屬（Flavobacterium）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、無色桿菌屬（Achromobacter）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）、新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、葡糖桿菌屬（Gluconobacter）、鞘脂菌屬（Sphingobium）、乳球菌屬（Lactococcus）等含量較低，均不足1%。Others 表示圖中這30 個物種之外的其它所有物種的相對豐度之和，占微生物總量的27.1%。較多的研究認為玉米表面細菌的變化不會影響其儲藏穩(wěn)定性，而作為玉米粒內(nèi)部菌群的主要來源，其表面細菌的變化直接影響玉米內(nèi)生細菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)，從而影響玉米籽粒的生理和病理特性。該研究中豐度較高的泛菌屬、腸球菌屬、鞘氨醇桿菌屬、伯克霍爾德菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、短波單胞菌屬都是玉米內(nèi)生菌的主要來源[23]。也有研究表明，在儲藏過程中不控制玉米中細菌的生長繁殖，其生長過程對周圍環(huán)境的影響，比如增加底物的水解，造成環(huán)境溫度升高等，也會影響真菌的生長和群落結(jié)構(gòu)[24]。同時，玉米中細菌的生長繁殖會直接影響玉米中微生物含量，從而影響玉米粉的質(zhì)量與安全[25]。

圖7 玉米中細菌群落在屬分類水平上的組成分布Fig.7 The composition distribution of bacteria in maize on genus classification level

2.4 玉米中真菌群落多樣性分析

2.4.1 生物信息學分析 采用Illumina MiSeq 平臺對群落DNA 片段進行雙端（Paired-end）測序，共得到120 580 條序列。通過qiime 軟件，采用DADA2 方法對原始序列去噪。去除低質(zhì)量序列后得到112 912 條序列，去噪后得到112 772 條序列，拼接后得到112 288 條序列，去除嵌合體后得到104 589 條序列（表3）。

表3 樣本測序量統(tǒng)計表Table 3 Statistical table of sample sequencing amount

對去除嵌合體后的高質(zhì)量片段進行序列長度統(tǒng)計，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高質(zhì)量序列長度大都在200～250 bp 間，如圖8 所示。

圖8 序列長度分布圖Fig.8 Sequence length distribution

圖9 真菌豐度等級曲線圖Fig.9 Fungal abundance grade curve

2.4.2 α-多樣性分析

2.4.2.1 α-多樣性指數(shù) 真菌群落多樣性指數(shù)統(tǒng)計見表4。樣本的α-多樣性指數(shù)中Chao1 和Observed specie 與群落的豐富度有關(guān)，OTU 數(shù)量亦可以代表樣品物種的豐度。Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)與群落的多樣性有關(guān)。Pielou's evenness 指數(shù)和Good's coverage 指數(shù)（測序深度指數(shù)）分別表征群落的均勻度和檢出的物種所占比例。由表4 可知，Good's coverage 指數(shù)大于0.9，說明樣品文庫中序列基本被測出。由其它指數(shù)可以看出所測樣本中真菌菌群有較好的豐富度、多樣性和均勻性。

表4 真菌群落的多樣性指數(shù)Table 4 Diversity index of fungal community

2.4.2.2 豐度等級曲線 樣品的群落豐度等級曲線（Rank abundance curve）的折線總體較為平緩（圖10），說明樣本中各真菌群落OTU 間的豐度差異小，群落組成的均勻度較高，豐度分布較為均勻。

圖10 玉米中真菌群落在屬分類水平上的組成分布Fig.10 The composition distribution of fungi in maize on genus classification level

2.4.3 屬分類水平上的物種組成分析 針對真菌的ITS 序列，采用UNITE 數(shù)據(jù)庫進行注釋，各分類水平的統(tǒng)計結(jié)果見表5。經(jīng)分析比對OTUs，共鑒定到2 門、9 綱、10 目、14 科、21 屬、22 種。

表5 各水平微生物分類單元數(shù)統(tǒng)計表Table 5 Statistical table of microbial taxa number at each level

統(tǒng)計在屬（Genus）分類水平上豐度大于0.1%的群落，得到儲藏玉米中真菌物種組成餅圖（圖9）。真菌中豐度最高的菌群為鐮刀菌屬（Fusarium），所占比例為50.1%，其次為帚枝霉屬（Sarocladium），所占比例為28.2%，籃狀菌屬（Talaromyces）占9.6%，青霉屬（Penicillium）占2.7%，曲霉屬0.2%等。這與文獻[26]和[27]研究結(jié)果一致。其它組分如念珠菌屬（Candida）、節(jié)擔菌屬（Wallemia）、季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma）、赤霉菌屬（Gibberella）等含量較低，所占比例均不足1%，未分類霉菌屬（unclassified_Fungi）占總量的8%。在玉米中的優(yōu)勢菌屬中，帚枝霉屬（Sarocladium）主要有玉米類帚枝霉（S.zeae）、糾纏帚枝霉（S.implicatum）和未分類種共3 個種，籃狀菌屬（Talaromyces）主要有沃特曼籃狀菌（T.wortmannii）、產(chǎn)紫籃狀菌（T.purpureogenus）、白雙輪籃狀菌（T.albobiverticillius）和2 個未分類種，共5 個種。青霉屬（Penicillium）主要有P.bissettii、草酸青霉（P.oxalicum）和類阿達青霉（P.adametzioides）3 個種，曲霉屬（Aspergillus）主要有黃曲霉（A.flavus）、黑曲霉（A.niger）、赤曲霉（A.ruber）3 個種。霉菌在生長過程中，一方面代謝產(chǎn)生一些淀粉酶、蛋白酶、普魯蘭酶、木聚糖酶等酶類水解底物供自身利用，另一方面產(chǎn)生一些諸如酮類、肽類、毒素類等代謝產(chǎn)物來抑制其它微生物，尤其是細菌的生長[28]。玉米中富含的曲霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬等霉菌屬，是黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、展青霉素、T-2 毒素等真菌毒素污染的主要代謝產(chǎn)物。如果能夠有效抑制玉米表面的優(yōu)勢霉菌的生長代謝，則有助于控制玉米中的真菌毒素污染問題[29]。

3 結(jié)論

對玉米表面的優(yōu)勢細菌和真菌進行分離純化，共獲得11 株細菌菌株和12 株霉菌菌株。通過其保守序列的PCR 測序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，初步鑒定其菌株名稱。通過高通量測序技術(shù)分析玉米中細菌和真菌的多樣性。結(jié)果表明，玉米中主要優(yōu)勢細菌為泛菌屬、腸球菌屬、鞘氨醇桿、金黃桿菌屬，主要的優(yōu)勢真菌為鐮刀菌屬、帚枝霉、籃狀菌屬、青霉屬、曲霉屬。高通量測序分析所得結(jié)果中高豐度細菌和真菌種類與分離純化得到的菌株結(jié)果基本一致。表明鐮刀菌、青霉、曲霉等是玉米中主要的污染真菌，這些菌株也是代謝產(chǎn)生真菌毒素的重要菌群，對儲糧安全有重要影響[30-31]。