王澤亮，范智義，張 敏，張星燦，陳相杰，宋小焱，鄧維琴，張其圣，4，李 恒，4，5*

（1 四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院有限公司 成都611130 2 四川振興產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司 成都610023 3 成都圣恩生物科技股份有限公司 成都611130 4 四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 四川眉山620030 5 江南大學(xué) 江蘇無錫 214000）

香辛料作為一種天然的食品添加劑，有改善食品風(fēng)味、掩蓋不良?xì)馕兜淖饔肹1-3]，是川鹵鹵汁揮發(fā)性風(fēng)味的重要來源[4]。解析其在鹵汁中的風(fēng)味貢獻作用，對實現(xiàn)川鹵標(biāo)準(zhǔn)化有著重要意義。當(dāng)前，川鹵鹵汁中的香辛料種類達20 余種，多種香辛料及原輔料的共同作用使得川鹵鹵汁風(fēng)味體系相對復(fù)雜，而對鹵汁中單一香辛料的風(fēng)味貢獻機理尚不明確，這在一定程度上阻礙了川鹵鹵汁及川鹵制品標(biāo)準(zhǔn)化的進程。

目前，尹樂斌等[5]和伍濤等[1]分別對鹵汁中揮發(fā)性成分進行了研究，初步解析了鹵水揮發(fā)性成分構(gòu)成及其在鹵制過程中的變化規(guī)律。賀文杰[6]通過3 種常用香辛料主效成分對鹵鴨腿品質(zhì)的影響研究，確定辣椒、花椒、八角可有效增強鹵鴨腿風(fēng)味，改善產(chǎn)品品質(zhì)。蔡玉潔[7]解析了辣椒、花椒等6種香辛料主效成分在鹵制過程中的變化規(guī)律。張圳等[8]和孫靈霞等[9]對鹵制食品風(fēng)味的研究發(fā)現(xiàn)，鹵制食品中的揮發(fā)性風(fēng)味成分大多來源于鹵汁，而鹵汁中香辛料的添加量對鹵汁及鹵制食品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量有著重要影響。上述研究多集中于鹵汁風(fēng)味構(gòu)成與香辛料主效成分解析等方面，對鹵汁復(fù)雜條件下單一香辛料風(fēng)味的貢獻作用研究較少。

本文基于川鹵香辛料風(fēng)味貢獻分析模型，開展缺失實驗及差異性分析，解析川鹵鹵汁風(fēng)味形成關(guān)鍵香辛料及其風(fēng)味的貢獻作用，以期為川鹵鹵汁標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4-甲基-2-戊醇（色譜純），阿法埃莎（中國）化學(xué)有限公司；八角、小茴香、桂皮、香茅、排草、靈草、陳皮、肉蔻、川砂仁、山奈、丁香、紅花椒、干朝天椒、香通由成都圣恩生物科技股份有限公司提供；植物油購自成都市當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

1.2 設(shè)備與儀器

DZKW-4 型電子恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；FW-400A 粉碎機，青島聚創(chuàng)嘉恒分析儀器有限公司；TQ8040 三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，島津（上海）實驗器材有限公司；固相微萃取裝置，美國Supelco 公司；DB-WAXms（60 m×0.25 μm×2.5 mm）色譜柱，美國安捷倫公司；50/30 μmDVB/CAR/PDMS 固相萃取纖維，Supelco 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 川鹵香辛料風(fēng)味貢獻分析模型及鹵汁樣品制備 川鹵香辛料風(fēng)味貢獻分析模型建立：參考典型川式鹵汁制備工藝，經(jīng)工藝簡化及輔料去除后進行構(gòu)建，其具體制備步驟為：將香辛料粉碎后按表1 的比例混合，并將質(zhì)量比為1∶5 的混合香辛料粉和植物油混合均勻，加熱至200 ℃后持續(xù)攪拌5 min，自然冷卻至常溫，加入料液比為1∶18（香辛料∶水）的水煮沸，保持95 ℃以上加熱30 min，取濾液-20 ℃冷藏備用。

表1 川鹵鹵汁香辛料用量（以250 mL 計）Table 1 Spice dosage in the Sichuan seasoning stew（calculated as 250 mL）

鹵汁樣品制備：以風(fēng)味貢獻分析模型制得鹵汁為對照組，香辛料缺失后制得鹵汁為試驗組，共15 組。在此基礎(chǔ)上，通過對照組與試驗組間差異性分析確定不同種類香辛料對川鹵鹵汁的風(fēng)味貢獻作用。

1.3.2 感官評價 以未缺失鹵汁樣品為參考樣，選取15 位受過“偏好檢測”和“三點檢驗”培訓(xùn)和考核的感官品評員，參考標(biāo)準(zhǔn)《Sensory analysis-Methodology-Triangle test》（ISO-4120-2021）[10]以嗅聞的方式對樣品進行差異性感官評價，其具體步驟為：于30 ℃恒溫條件下放置3 個帶標(biāo)簽的受試樣品（包含對照組鹵汁和1 組試驗組鹵汁），在告知感官評價人員受試樣品中存在1 個差異樣品的前提下，受試者以嗅聞的方式對樣品進行感官評價并選出存在差異的樣品，試驗人員通過統(tǒng)計受試人員回答正確次數(shù)進行樣品間顯著性差異判別。

1.3.3 鹵汁樣品揮發(fā)性成分測定 參考范智義等[11]、鄧維琴等[12]方法略作修改后進行鹵汁樣品中揮發(fā)性成分測定，具體步驟如下：取2 mL 鹵汁注入固相微萃取瓶中，加入10 μL 5 μg/mL 4-甲基-2-戊醇甲醇溶液作為內(nèi)標(biāo)，密封萃取瓶，混合均勻后于60 ℃水浴平衡20 min，然后置入固相微萃取纖維，60 ℃萃取30 min。萃取完成后，將固相微萃取纖維插入GC 氣化室中進行分析。

1.3.3.1 色譜條件 升溫程序：初始溫度40 ℃，保持1 min，10 ℃/min 升溫至90 ℃，保持0.5 min，2℃/min 升溫至120 ℃，保持0.5 min，10 ℃/min 升溫至140 ℃，2 ℃/min 升溫至202 ℃，7.6 ℃/min 升溫至250 ℃，保持2 min。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件 氣相色譜分析以高純氦氣為載氣，質(zhì)譜離子源溫度：230 ℃，定性采用Q3 Scan掃描模式，質(zhì)荷比掃描范圍為30～500 m/z。電子轟擊能量70 eV，檢測電壓0.1 kV。揮發(fā)性化物的鑒定利用NIST17、FFNSC1 譜庫檢索結(jié)果（相似度大于80%）和人工圖譜解析共同確定。

1.3.3.3 揮發(fā)性物質(zhì)相對含量及OAV（Odor activity value，OAV）計算 相對含量計算公式如式1 所示。

式中，RC——揮發(fā)性成分相當(dāng)于內(nèi)標(biāo)當(dāng)量的相對含量（μg/kg）；A1——目的物質(zhì)的峰面積；c——內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度（μg/mL）；V——內(nèi)標(biāo)添加的體積（μL）；A2——內(nèi)標(biāo)峰面積；m——鹵汁的取樣質(zhì)量（g）。

揮發(fā)性成分OAV 值計算

OAV 計算公式如式2 所示[13]。

式中，RC——揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量（mg/kg）；OT——化合物的水中嗅覺閾值（mg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2021 繪 制heatmap 圖；采 用SIMCA 進行PLS-DA 分析（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評價差異性分析

三點檢驗適用于對1 種或多種官感官指標(biāo)是否存在差別的判定[14]，該方法可通過統(tǒng)計學(xué)的方法對兩個樣品間是否存在顯著性差異做出判別。表2 為香辛料缺失鹵汁樣品感官評價結(jié)果，同對照組相比，八角、小茴香、陳皮、肉蔻、川砂仁及靈草缺失后鹵汁樣品與對照組樣品的感官存在顯著差異（P〈0.05），說明上述6 種香辛料缺失后將對鹵汁風(fēng)味造成較大影響，其余香辛料缺失后并未導(dǎo)致鹵汁顯著感官差異。因此，八角、小茴香等6種香辛料為川鹵鹵汁風(fēng)味形成的關(guān)鍵香辛料成分。

表2 香辛料缺失鹵汁樣品感官評價結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results of missing spices and seasoning stew samples

2.2 川鹵鹵汁揮發(fā)性成分解析

對對照組鹵汁及6 種關(guān)鍵香辛料缺失后鹵汁進行揮發(fā)性成分測定，共檢測出鹵汁樣品中揮發(fā)性物質(zhì)93 種，相對含量在0.01～70.57 μg/kg 之間，包括萜類47 種、醛酮類12 種、醇類10 種、酯類7種、烷烴類6 種、酚類7 種及其它類別化合物3種。對照組鹵汁中，萜類物質(zhì)含量最高，達114.82 μg/kg，其次依次為烷烴類、酚類化合物，其含量分別為74.94 μg/kg 和34.17 μg/kg，其余種類揮發(fā)性化合物含量相對較低（〈20 μg/kg），同尹樂斌等[5]研究結(jié)果一致。

試驗組中揮發(fā)性物質(zhì)含量（90.56～185.37 μg/kg）較對照組（258.98 μg/kg）出現(xiàn)明顯下降（圖1），各試驗組間存在一定差異。其中，八角、小茴香缺失后鹵汁烷烴類物質(zhì)含量明顯降低。肉蔻、川砂仁缺失后鹵汁中萜類及烷烴類物質(zhì)含量均出現(xiàn)明顯降低，靈草、陳皮中萜類、烷烴類物質(zhì)含量出現(xiàn)一定程度下降。張根生等[15]研究認(rèn)為，不同種類香辛料所含活性成分存在一定差異，對鹵制品中風(fēng)味物質(zhì)的貢獻作用也有所不同。本研究中，試驗組中揮發(fā)性成分含量較對照組出現(xiàn)不同程度降低，表明各關(guān)鍵香辛料對鹵汁中揮發(fā)性成分種類及含量的貢獻作用存在差異，與張根生等[15]研究結(jié)果一致。

圖1 鹵汁樣品中揮發(fā)性物質(zhì)含量熱圖Fig.1 Heatmap of volatile compound contents in seasoning stew

表3 為對照組中重要香氣化合物（OAV〉1）篩選結(jié)果。OAV 反映了化合物對于物質(zhì)總體香氣的貢獻程度，一般認(rèn)為OAV 大于1 便對物質(zhì)總體風(fēng)味形成具有貢獻作用，且OAV 越大貢獻作用就越明顯[16-17]。本研究重點解析鹵汁中重要香氣化合物36 種，包括萜類物質(zhì)21 種（83.31 μg/kg），醛酮類物質(zhì)5 種（5.21 μg/kg），醇類1 種（4.55 μg/kg），酯類2 種（0.73 μg/kg），烷烴類2 種（72.60 μg/kg），酚類3 種（0.99 μg/kg）和其它類別化合物2 種（4.68 μg/kg）。其中，萜類和烷烴類物總量達155.91 μg/kg，占鹵汁重要香氣化合物總量的90%以上，是鹵醛類物質(zhì)含量均出現(xiàn)明顯下降，說明，3 種香辛料的共同作用將抑制或消耗鹵汁中醛類物質(zhì)抑制物，進而增加鹵汁中醛類物質(zhì)含量，豐富鹵汁香氣。

風(fēng)味修飾化合物中，桃金娘烯醇、α-水芹烯、α-松油烯、香芹酮、3-乙基-3，6-二甲基-吡嗪、乙酸香葉酯、苯酚、水楊酸甲酯及百里香酚在部分香辛料缺失后未檢出，將對鹵汁風(fēng)味豐富度造成一定影響。其中，除香芹酮和百里香酚是由川砂仁直接貢獻外，其余風(fēng)味修飾化合物均由兩種或以上香辛料協(xié)同產(chǎn)生，其具體形成機制還需進一步研究。

2.3 關(guān)鍵差異性香氣成分鑒定

PLS-DA 是一種監(jiān)督性的差異分析[26]，可對各組差異性進行判別，各組在得分圖上間距越大，表明組間差異越大。選取關(guān)鍵香辛料缺失后鹵汁與未缺失鹵汁樣品中重要香氣化合物（OAV〉1）進行PLS-DA 分析，以明確各試驗組間差異性成分，結(jié)果如圖2 所示?？煽闯觯麝P(guān)鍵香辛料缺失后鹵汁樣品與未缺失鹵汁樣品間存在較明顯差異（P〈0.05），表明各香辛料缺失后將導(dǎo)致鹵汁中重要香氣化合物出現(xiàn)較大變化，進而對鹵汁風(fēng)味造成較大影響。

圖2 關(guān)鍵香辛料缺失鹵汁與未缺失鹵汁差異性分析Fig.2 Difference analysis of key spices in seasoning stew with missing and complete recipes

圖3 為鹵汁樣品PLS-DA 分析變量重要性因子VIP 值。本次共篩選出各組間重要差異性化合物（VIP 值〉1）15 種，分別為茴香烯、桃金娘烯醇、水楊酸甲酯、糠醛、反式-2-辛烯-1-醇、桉樹腦、草蒿腦、α-松油醇、反式-2-庚醛、反式-2-辛醛、辛醛、苯酚、α-松油烯、樟腦及芳樟醇。

圖3 鹵汁樣品PLS-DA 分析變量重要性因子（VIP 值）Fig.3 Significance factor of the PLS-DA analysis variables in the seasoning stew（VIP value）

圖4 為鹵汁中重要差異性化合物含量熱圖。與未缺失鹵汁樣品相比，八角缺失后鹵汁中茴香烯、水楊酸甲酯、桃金娘烯醇及苯酚含量出現(xiàn)明顯降低，表明八角對鹵汁中上述4 種揮發(fā)性成分貢獻作用相對突出；同理可得，小茴香對苯酚貢獻作用較為明顯，靈草對苯酚、糠醛貢獻作用較為突出，陳皮對鹵汁中糠醛具備一定貢獻作用，肉蔻、川砂仁對鹵汁中多種物質(zhì)均有貢獻作用。

圖4 重要差異性化合物含量熱圖Fig.4 Heatmap of important differential compounds

3 結(jié)論

川鹵鹵汁風(fēng)味形成是鹵汁中主體風(fēng)味化合物、關(guān)鍵風(fēng)味化合物及風(fēng)味修飾化合物共同作用的結(jié)果，反式-2，4-癸二烯醛、芳樟醇、草蒿腦、黃樟素、對傘花烴、茴香烯及反式-2-壬烯醛為川鹵鹵汁的主體風(fēng)味來源。

結(jié)合感官評定及OAV 分析認(rèn)為，八角、小茴香、陳皮、靈草、川砂仁及肉蔻對鹵汁中部分重要香氣化合物具有較為突出的貢獻作用，為川鹵鹵汁的關(guān)鍵香辛料成分。其中，八角對鹵汁中茴香烯、桃金娘烯醇、水楊酸甲酯及苯酚貢獻相對突出，小茴香對苯酚貢獻作用較為明顯，靈草對苯酚、糠醛貢獻作用較為突出，陳皮對鹵汁中糠醛具備一定貢獻作用，肉蔻、川砂仁對鹵汁中多種物質(zhì)均有貢獻作用。本研究可為川鹵鹵汁標(biāo)準(zhǔn)化、定量化發(fā)展提供一定數(shù)據(jù)參考。