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        基于蛋白質/肽組學的三文魚物種溯源

        2023-12-05 08:10:10蔣冰雪張曉梅張鴻偉陳桂東
        中國食品學報 2023年10期
        關鍵詞:物種特征

        蔣冰雪,張曉梅,丁 矛,王 萍,張鴻偉*,陳桂東*

        (1 中國海洋大學食品科學與工程學院 山東青島266003 2 青島海關技術中心 山東青島266114 3 青島海關風險防控分局 山東青島 266114)

        三文魚 是鮭形 目(Salmoniformes),鮭 科(Salmonidae)魚類的商品名,生長在高緯度冷海水域,其肉色呈橘紅色,肉質鮮美,被譽為“冰海之皇”[1]。目前,消費量最大的三文魚有大西洋鮭魚(Salmo salar)、大馬哈魚(Oncorhynchus keta)和虹鱒(Oncorhynchus mykiss)。其中,大西洋鮭魚為鮭屬(Salmo),口感鮮美且富含多種氨基酸和不飽和脂肪酸,被譽為“魚中至尊”;大馬哈魚和虹鱒同為大馬哈魚屬(Oncorhynchus),肉質較為粗糙,且生產(chǎn)成本低,市場價值與大西洋鮭魚相差甚遠[2]。經(jīng)過加工切片的3 種魚肉在外觀上均為白橘相間,消費者很難憑肉眼辨別。受利益驅使,市場上時常出現(xiàn)將大馬哈魚和虹鱒魚貼簽大西洋鮭魚的現(xiàn)象[3-4]。

        目前針對大西洋鮭魚、大馬哈魚和虹鱒魚物種鑒別的技術手段,大多是通過分子生物學和光譜法[5-6],特別是DNA 分析技術最為常見[7]。Rasmussen 等[8]對種商業(yè)鮭魚和鱒魚進行DNA 測序,確定細胞色素c 的標準650 bp 條形碼區(qū)域氧化酶亞基Ⅰ基因(COI)可用于區(qū)分三文魚物種。之后,團隊又開發(fā)一種基于COI DNA 條形碼序列的物種特異性多重PCR 方法,用于快速鑒別三文魚種屬[9]。Li 等[10]采用環(huán)介導的等溫擴增技術并結合自猝滅熒光方法進行三文魚的物種鑒定。然而,DNA 分析不適合深加工食品樣本多通道并行的分析。隨著質譜-組學技術的快速發(fā)展,具有多目標高通量、高選擇性和高靈敏度等特點的質譜分析,作為一種可選技術在物種鑒別領域得到推廣應用和發(fā)展[11]。Yu 等[12]采用親水相互作用色譜串聯(lián)質譜法建立脂質組學方法,通過統(tǒng)計分析揭示帝王鮭(Oncorhynchus tshawytscha)、大西洋鮭和虹鱒之間的磷脂分子種類差異,結果確定m/z 802.8 和m/z 834.8 的磷脂分子可作為物種標志物。同樣,蛋白質作為食品中重要的營養(yǎng)組分,基于質譜平臺的蛋白質/肽組學近些年也成為食品物種鑒別的分析手段之一,廣泛應用于肉類[13-15]、谷物[16]、水產(chǎn)品[17-19]、乳制品[20]、石斛[21]、燕窩[22]等食品的物種溯源分析。數(shù)據(jù)依賴型采集(Data dependent acquisition,DDA)可將理論肽段序列直接和實際譜圖匹配,得到蛋白質和肽段的鑒定信息?;谌碚撍槠|譜離子連續(xù)窗口采集模式(Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra,SWATH-MS)的高分辨質譜蛋白組學分析可用于目標樣本的特征肽段篩查,基于特征肽段的多反應監(jiān)測(Multiple reaction monitoring,MRM)采集模式的串聯(lián)四極桿質譜肽組學分析可用于更精準的定性、定量分析[23-24]。兩者的結合使用可有效實現(xiàn)食品的物種溯源。Qiu 等[25]基于鳥槍法蛋白質組學和MRM 肽組學分析方法,對非可食動物和可食肉動物進行研究,得到9 種肽作為區(qū)分物種的標志物,以及能用于區(qū)分皮毛動物非食用肉的特征肽段。Fornal 等[26]通過高分辨質譜尋找特征肽段,并利用三重四極桿質譜建立準確區(qū)分雞、鴨、鵝種家禽肉類的基于特定肽段的MRM 分析方法。

        本研究基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間(Ultrahigh-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight,UHPLC-Q/TOF)質譜和超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質譜(UHPLCtandem quadrupole mass spectrometry,UHPLCQqQ)的蛋白質組學/肽組學分析策略,結合生物信息學工具篩選大西洋鮭魚、大馬哈魚和虹鱒魚潛在的物種特征肽段,建立基于MRM 的鑒別分析方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        大西洋鮭魚(Salmo salar)、大馬哈魚(Oncorhynchus keta)購于青島麥德龍超市,具有麥哲達產(chǎn)品追溯二維碼;虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)購于青島共和縣龍羊峽養(yǎng)殖基地。所有樣品均經(jīng)過相關形態(tài)學鑒定。

        LC-MS 級乙腈,德國Merck 公司;LC-MS 級甲酸,美國Sigma 公司;碘代乙酰胺(Iodoacetamide,IAA)和二硫 蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT),北京索萊寶公司產(chǎn)品;尿素和碳酸氫銨,國藥集團化學試劑公司;測序級胰蛋白酶(比活18 523 U/mg),美國Promega 公司。

        1.2 儀器與設備

        1.3 試驗方法

        1.3.1 樣品前處理 三文魚樣品清理魚骨和魚皮,液氮浴研磨成粉。蛋白質提取參考等[27]和Zhang 等[28]方法。取2 g 樣品,加入20 mL蛋白提取液(8 mol/L 尿素和50 mmol/L 碳酸氫銨),垂直振蕩,離心取上清。取400 μL 上清液于分子質量10 ku 截留超濾離心管(Millipore,愛爾蘭),分別加入8 μL 1 mol/L DTT,于60 ℃靜置反應1 h。待溫度降至常溫,加入40 μL 1 mol/L IAA,室溫避光1 h。12 000×g 離心20 min 后,加入200 μL 50 mmol/L 碳酸氫銨溶液離心以沖洗膜上蛋白,重復3 次。再加入200 μL 碳酸氫銨溶液作為緩沖液,按照酶與底物質量比1∶50 加酶,37 ℃下酶解16 h。12 000×g 離心20 min 收集膜下肽段待測。

        1.3.2 UHPLC-Q/TOF 分析 色譜條件:色譜柱為Agilent Advance Bio Peptide Plus C18column(150 mm×2.1 mm,130 ?,2.7 μm);流動相A 0.1%甲酸-水,流動相B 0.1%甲酸-乙腈,流速0.25 mL/min,洗脫梯度:0~2min,5%B;2~27 min,5%~20%B;27~37 min,20%~35%B;37~39 min,35%~80%B;39~42 min,80%B;42~46 min,5%B。進樣量40 μL,柱溫40 ℃。

        DDA 分析參數(shù):DuoSprayTM離子源,電噴霧正離子模式(ESI+);噴霧電壓5 500 V;質譜TOF 質荷比(m/z 掃描范圍:350~1 500;碎片掃描觸發(fā)條件:質荷比(m/z)掃描范圍:350~1 200,強度閾值150 cps;質量精度閾值:50 mDa;碎片離子采集質荷比(m/z)掃描范圍:100~1 500;每次采集循環(huán)中監(jiān)測前20 個最強離子;選擇高靈敏度模式:離子源參數(shù)條件:霧化氣壓力:413.7 kPa,輔助加熱氣壓力:344.75 kPa,氣簾壓力:241.33 kPa,離子源溫度525 ℃,解簇電壓100 V,子離子掃描碰撞能量隨著質荷比(m/z)動態(tài)變動。

        SWATH-MS 分析參數(shù):目標窗口數(shù):60;質荷比范圍:350~1350;碰撞能量擴展:15 V。進樣量:30 μL,其色譜的參數(shù)條件與DDA 方法一致;質譜條件中除采集方法不同外,其參數(shù)設置與DDA 采集參數(shù)相同。

        1.3.3 UHPLC-QqQ 分析 色譜條件:色譜柱為Phenomenex Kinetex C18column(50 mm×2.1 mm,100 ?,1.3 μm);流動相A 0.1%甲酸-水,流動相B 0.1%甲酸-乙腈,流速0.35 mL/min。洗脫梯度:0~10 min,10%~10.5%B;10~10.5 min,10.5%~45%B;10.5~13 min,45%~95%B;13~13.1 min,95%~10%B;13.1~15 min,10%B。柱溫:40 ℃;進樣量:20 μL。

        質譜條件:電噴霧離子源,正離子反應模式,檢測方式MRM,噴霧電壓5 500 V,離子傳輸管溫度575 ℃;霧化氣壓力413.7 kPa,輔助加熱氣壓力344.75 kPa,氣簾壓力241.33 kPa。

        1.4 數(shù)據(jù)生物信息學分析

        ProteinPilotTM軟件(版本5.0.1,AB Sciex)用于蛋白質鑒定,蛋白信息數(shù)據(jù)庫“Salmoniformes”下載于NCBI 網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),總條目數(shù)678 175(下載于2020 年7 月26 日)。PeakView 軟件(版本2.1,AB Sciex)用于SWATHMS 數(shù)據(jù)分析;使用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)進行Venn 分析以尋找特征蛋白;Skyline 軟件(版本3.7.0)用于預測MRM傳輸離子對。

        2 結果與分析

        2.1 蛋白質鑒定及潛在生物標志物的篩選

        基于UHPLC-Q/TOF 采集的DDA 數(shù)據(jù)進行蛋白質鑒定在95%置信水平上鑒定到912 個蛋白質,13 615 個肽段,用于構建SWATH-MS 分析質譜庫和劃分SWATH-MS 采集窗口。大西洋鮭魚、大馬哈魚和虹鱒魚的鑒定結果見表1。

        表1 三文魚樣本的蛋白質和多肽鑒定結果(95%置信水平)Table 1 Identification of proteins and peptides from salmon samples(Confidence 95%)

        根據(jù)韋恩分析(圖1),大西洋鮭魚樣本鑒定到特征蛋白質395 個,大馬哈魚樣本鑒定到特征蛋白質269 個,虹鱒魚樣本鑒定到特征蛋白質218個。

        圖1 三文魚樣本蛋白質鑒定結果韋恩圖Fig.1 Venn diagram of protein identification results of salmon samples

        采用Peakview 軟件對SWATH-MS 數(shù)據(jù)進行相對定量分析依據(jù)SWATH-MS 相關特征蛋白質的高分辨提取離子流(Extraction ion chromatograms,XIC)圖和定量數(shù)據(jù),選取無明顯基質干擾、無檢測交叉反應的肽段為初步篩選的物種特征肽段。

        2.2 物種特征肽段篩選

        使用初步篩選得到的物種特征肽段,在NCBI網(wǎng)站采用Blastp 檢索進行物種特異性的數(shù)據(jù)庫驗證,將與備選的潛在特征肽段氨基酸序列100%匹配且對應物種具有唯一性作為肽段特異性篩選規(guī)則,得到備選大西洋鮭魚特征肽段18 條,大馬哈魚特征肽段5 條,虹鱒魚特征肽段10 條,詳細見表2。

        2.3 MRM 方法建立

        采用skyline 軟件預測上述篩選獲得的備選物種特征肽段的MRM 傳輸離子對[29],基于UHPLC-QqQ 質譜建立分析方法,優(yōu)化分離梯度洗脫程序和流速確定相關肽段MRM 采集方法的最佳碰撞能量、解聚電壓和保留時間。具體優(yōu)化參數(shù)結果見表3。基于響應強度、交叉特異性和色譜峰形,最終篩選得到滿足質譜鑒別的大西洋鮭魚物種特征肽段10 條、大馬哈魚物種特征肽段2 條、虹鱒魚物種特征肽段3 條,各物種特征肽段組MRM 提取離子流圖,如圖2、圖3、圖4 所示。

        圖2 大西洋鮭魚物種特征肽段提取離子流圖Fig.2 XICs of marker peptides of Salmo salar

        圖3 大馬哈魚物種特征肽段提取離子流圖Fig.3 XICs of marker peptides of Oncorhynchus keta

        圖4 虹鱒魚物種特征肽段提取離子流圖Fig.4 XICs of marker peptides of Oncorhynchus mykiss

        2.4 實際樣品的驗證

        為進一步驗證方法的適用性,使用建立的質譜鑒別分析方法對在青島水產(chǎn)市場隨機購買的三文魚樣品進行測定,結果表明市售樣品1 含有大西洋鮭魚全部特征肽段(圖5),市售樣品2(圖6)含有虹鱒魚全部特征肽段,圖中紅框表示鑒定到肽段。可能會出現(xiàn)類似肽段SAGEIEEYQR,有部分響應峰的假陽性現(xiàn)象,因使用肽段組進行物種判別更加穩(wěn)定可靠。分析結果證明市場以三文魚標識的售賣產(chǎn)品中確有不同的物種構成,提示建立相關鑒別分析方法的必要性。

        圖5 市售樣品1 特征肽段的提取離子流圖Fig.5 XIC of marker peptides for real-life sample 1

        圖6 市售樣品2 特征肽段的提取離子流圖Fig.6 XIC of marker peptides for real-life sample 2

        此外,對購于青島麥德龍超市(具有麥哲達產(chǎn)品追溯二維碼)標識來自智利、丹麥、荷蘭和挪威的大西洋鮭魚產(chǎn)品,使用本試驗建立的方法進行鑒別,結果顯示相關產(chǎn)品均含有大西洋鮭魚的相關特征肽段,表明方法不受樣本產(chǎn)地的影響,進一步證明所建立的鑒別分析方法可靠。

        3 結論

        本研究基于UHPLC-Q/TOF 質譜的非靶向蛋白質組學研究,結合生物信息學方法,對大西洋鮭魚、大馬哈魚和虹鱒魚進行物種特征肽段的篩選,得到各物種的特征肽段共15 條,其中大西洋鮭魚10 條、大馬哈魚2 條、虹鱒魚3 條。通過靶向肽組學分析使用相應物種特征肽段,采用UHPLC-QqQ液質聯(lián)用技術建立了MRM 快速鑒別方法,并通過實際樣品分析結果顯示方法準確可靠特異性好,適用性強,可作為現(xiàn)有DNA 分析技術方法的有效補充,適于實驗室商品三文魚種屬的鑒別。

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