楊艷歌，王 帥，2，李紅娜，李 濤，吳占文，2，孫冬梅，袁 飛*

（1 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 國家市場監(jiān)管重點實驗室（食品質(zhì)量與安全）北京100176 2 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 黑龍江大慶 163000）

沙門氏菌（Salmonella）是環(huán)境中廣泛存在的一類食源性致病菌，能夠引起人畜食物中毒[1]，引起腸道內(nèi)疾病，表現(xiàn)為急性發(fā)熱、腹痛、嘔吐等癥狀[2]，也可導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎的發(fā)生[3]。據(jù)報道，全球每年約有9 000 多萬例的沙門氏菌感染事件[4]。我國現(xiàn)行的國標(biāo)GB 29921-2021 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》[5]中明確規(guī)定，肉制品、水產(chǎn)制品、即食蛋制品等食品中不得檢出沙門氏菌。目前沙門氏菌的檢測方法主要有培養(yǎng)法[6]、免疫分析法[7]、PCR 檢測法[8]、芯片檢測法[9]、質(zhì)譜分析法[10]、光譜測定法等[11]。其中傳統(tǒng)培養(yǎng)法耗時費力，PCR 法、芯片法、質(zhì)譜光譜法等均需依賴精準(zhǔn)控溫的儀器、設(shè)備和專業(yè)的操作，不適合室外環(huán)境快速檢測。

酶促等溫擴增技術(shù)（Enzymatic recombinase amplification，ERA）是我國自主研發(fā)的一種新型等溫擴增技術(shù)，誕生時間較晚，其反應(yīng)原理與RPA技術(shù)類似[12-13]，都是在37～42 ℃的常溫環(huán)境下，重組酶與引物DNA 緊密結(jié)合的聚合物在模板DNA上搜索到完全匹配的互補序列，然后在單鏈DNA結(jié)合蛋白的幫助下打開DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)，最后在DNA 聚合酶的作用下完成擴增產(chǎn)物的指數(shù)級擴增。目前關(guān)于ERA 技術(shù)的研究主要集中在病毒和臨床疾病檢測等方面。如曾宇晨等[14]建立了非洲豬瘟病毒B646L、EP402R、MGF505/360 基因ERA檢測方法，并應(yīng)用到臨床樣品的檢測。Zhang 等[15]建立了一種檢測豬圓環(huán)病毒3 型的ERACRISPR/Cas12a 方法。Yang 等[16]建立了一種鑒別豬流行性腹瀉病毒PEDV 野生型的ERACRISPER/Cas12a 方法。Liu 等[17]使用ERA 試劑盒結(jié)合CRISPR 技術(shù)建立一種快速檢測癌癥細(xì)胞耐藥基因FLT3-F691L 的方法，40 min 即可獲得檢測結(jié)果。Meng 等[18]基于ERA 試劑盒結(jié)合CRISPR技術(shù)建立便捷、即時的檢測啤酒腐敗菌的方法。然而，目前未見該技術(shù)在食源性致病菌快速檢測中的報道。

本研究將文獻(xiàn)報道的沙門氏菌RPA 引物探針應(yīng)用到ERA 快速檢測體系，擬建立熒光法和顯色法兩種沙門氏菌ERA 可視化高效快速檢測方法，旨在為沙門氏菌可視化快速檢測提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉，購于北京某超市。熱貼和自熱包，購于某電商平臺。試驗用菌，分別購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）、中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）和中國檢驗檢疫微生物菌種保藏管理中心（Inspection and Quarantine Culture Collections，IQCC），詳見表1。

表1 試驗用菌株信息Table 1 Information about the strains used in this study

腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（Brain heart infusion，BHI）、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基（Brain heart infusion agar，BHIA），英國Oxoid 公司；PrepManTMUltra樣品制備試劑，美國Thermo Fisher 公司；基礎(chǔ)型核酸擴增試劑盒（ERA 法）、熒光型核酸擴增試劑盒（ERA 法），蘇州先達(dá)基因科技有限公司；酚∶氯仿∶異戊醇（體積比為25 ∶24 ∶1）、10000×SYBR Green I，北京索萊寶科技有限公司；中性紅、苯酚紅、鈣黃綠素，天津福晨化學(xué)試劑廠；羥基萘酚藍(lán)，山東酷爾化學(xué)有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

Pico 17 離心機，Thermo Fisher Scientific 公司；掌上離心機，美國SCILOGEX 公司；渦旋混合器，德國IKA 公司；拍擊式均質(zhì)器，法國Interscience 公司；高壓滅菌鍋，以色列Tuttnauer 公司；DH-420 電熱恒溫培養(yǎng)箱，美國Memmert 公司；水浴鍋，金壇市白塔新寶儀器廠；BioSpec-nano 核酸蛋白分析儀，日本島津公司；便攜式迷你qPCR儀，上海翊輝生物科技有限公司；電泳儀、全自動凝膠成像系統(tǒng)PharosFX，美國伯樂（BIO-RAD）公司。

1.3 方法

1.3.1 引物來源 按參考文獻(xiàn)[19]～[22]合成引物及探針序列，所有引物和探針均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，序列見表2。

表2 引物探針序列信息Table 2 The information of primers and probes

1.3.2 沙門氏菌培養(yǎng)及基因組DNA 提取 將凍干菌粉接種到5 mL BHI 培養(yǎng)基中，置恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)20 h。取菌液，平板劃線接種至BHIA 培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h，挑取單菌落加入5 mL BHI 培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。取1 mL 菌液置于1.5 mL 離心管中16 000×g 離心2 min，去上清，加入100 μL PrepManTMUltra 樣品制備試劑提取液，渦旋振蕩混勻，然后100 ℃水浴10 min，16 000×g 離心2 min，取上清液50 μL，即提取的DNA，采用核酸蛋白分析儀測其濃度后-20 ℃保存[23]。

1.3.3 反應(yīng)體系與檢測程序 ERA 熒光法反應(yīng)體系參照熒光型核酸擴增試劑盒（ERA 法）使用說明書制備預(yù)混液，基礎(chǔ)型ERA 體系（顯色法）參照基礎(chǔ)型核酸擴增試劑盒（ERA）說明書制備預(yù)混液，模板量均為1 μL。預(yù)混液混勻后取48 μL 轉(zhuǎn)移至ERA 酶粉反應(yīng)管，向管蓋滴加2 μL 激活劑，蓋緊后渦旋瞬時離心，ERA 熒光反應(yīng)體系放入便攜式迷你qPCR 儀。設(shè)置反應(yīng)程序為：39 ℃反應(yīng)1 s；39℃反應(yīng)14 s，40 個循環(huán)。在第二反應(yīng)階段收集FAM 熒光信號，檢測閾值設(shè)為自動。ERA 顯色法反應(yīng)程序設(shè)置為：39 ℃擴增15 min。反應(yīng)結(jié)束，取25 μL 擴增產(chǎn)物加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25 ∶24∶1），振蕩混勻后充分離心，上清用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。其余擴增產(chǎn)物用于后續(xù)顯色法試驗。

1.3.4 引物探針篩選 以表1 中5 株沙門氏菌為模板，采用表2 中編號1、2、4 的3 套引物探針進(jìn)行ERA 熒光法檢測，采用表2 中的4 組引物（編號1，2，3，4）進(jìn)行基礎(chǔ)型ERA 檢測，比較擴增效果。對擴增效率較好的引物和探針進(jìn)行特異性分析。以腸炎沙門氏菌為檢測對象，以表1 中編號6～17 的12 種菌為特異性分析的陰性對照菌株。通過上述試驗，篩選擴增效率高、特異性好的引物探針組合進(jìn)行后續(xù)試驗。所有DNA 樣品質(zhì)量濃度統(tǒng)一為10 ng/μL，以無菌ddH2O 為陰性對照，做3次重復(fù)試驗。

1.3.5 顯色法的建立 為滿足基礎(chǔ)型ERA 快速的需求，需建立一種現(xiàn)場可視化分析方法以取代電泳法。分別配制100 μmol/L 的中性紅、羥基萘酚藍(lán)、苯酚紅、鈣黃綠素，以及1000× SYBR Green I溶液。ERA 反應(yīng)后，分別向管中添加1，1.5，2.5，2.5 μL 和3.5 μL 上述顯色液，選擇能明顯區(qū)分陽性和陰性結(jié)果的顯色劑和劑量。所有DNA 樣品質(zhì)量濃度統(tǒng)一為10 ng/μL，以無菌ddH2O 為陰性對照，做3 次重復(fù)試驗。

1.3.6 ERA 檢測方法反應(yīng)程序優(yōu)化 為建立可視化ERA 快速檢測方法，對ERA 檢測程序進(jìn)行優(yōu)化。

1）ERA 熒光法反應(yīng)程序優(yōu)化 將1.3.3 節(jié)ERA 熒光法反應(yīng)程序中的循環(huán)數(shù)分別縮短為35，30，25 和20，以腸炎沙門氏菌ATCC10708 的DNA（10 ng/μL）為模板，采用1.3.4 節(jié)篩選的最佳引物探針組合進(jìn)行ERA 反應(yīng)，比較擴增結(jié)果并確定熒光型ERA 快速反應(yīng)程序。試驗過程中以無菌ddH2O 為空白對照。每個反應(yīng)設(shè)置2 個平行，做重復(fù)試驗2 次（n=4）。

2）ERA 顯色法反應(yīng)程序優(yōu)化 將1.3.3 節(jié)基礎(chǔ)型ERA 反應(yīng)程序的擴增時間分別縮短到12，10，8，6 min 和4 min，以腸炎 沙門氏 菌ATCC10708 的DNA（10 ng/μL）為模板，以1.3.4 節(jié)篩選的最佳引物組合進(jìn)行ERA 反應(yīng)，比較擴增結(jié)果并確定ERA 顯色法快速反應(yīng)程序。以無菌ddH2O 為空白對照，做3 次重復(fù)試驗。

1.3.7 不依賴儀器的ERA 顯色法的建立 為滿足現(xiàn)場檢測的需求，對DNA 提取和ERA 檢測中需要依賴傳統(tǒng)實驗室設(shè)備的步驟進(jìn)行改良。以腸炎沙門氏菌ATCC10708 為研究對象，采用自熱盒加熱的方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)水浴鍋進(jìn)行DNA 提取，同時用溫度計監(jiān)測沸騰時的溫度和維持時間。采用核酸蛋白分析儀測定DNA 濃度和純度。使用熱帖加熱的方式代替PCR 儀或等溫擴增儀進(jìn)行ERA 檢測，同時用溫度計監(jiān)測熱帖達(dá)到ERA 反應(yīng)最適溫度的時間，采用顯色法進(jìn)行結(jié)果分析，電泳法驗證檢測效果。以上試驗均重復(fù)3 次。

1.3.8 ERA 可視化快速檢測方法靈敏度分析 為分析建立的ERA 可視化快速檢測方法的靈敏度，將腸炎沙門氏菌ATCC10708 的DNA 稀釋至102，101，100，10-1，10-2ng/μL，采用1.3.6 節(jié)確定的快速反應(yīng)程序進(jìn)行熒光法和顯色法ERA 反應(yīng)，分析兩種ERA 快速可視化方法的檢測靈敏度。以無菌ddH2O 為空白對照，做3 次重復(fù)試驗。

1.3.9 ERA 可視化快速檢測法對人工污染樣品的檢出限分析 以雞肉為基質(zhì)，按GB 4789.4-2016[24]方法制備人工污染沙門氏菌的樣品。向均質(zhì)液中添加1 mL 濃度為103，102，101，100CFU/mL 的腸炎沙門氏菌ATCC10708 培養(yǎng)液，37 ℃增菌培養(yǎng)0，2，4 h 后，按1.3.7 節(jié)步驟提取DNA。分析人工污染樣品的檢出限。以無菌ddH2O 為空白對照，做3次重復(fù)試驗。

2 結(jié)果

2.1 ERA 熒光法的建立

2.1.1 ERA 熒光法檢測引物探針的篩選結(jié)果 采用表2 中3 組引物探針（編號1#、2#和4#）進(jìn)行ERA 擴增效果分析，發(fā)現(xiàn)1#引物探針不僅能同時擴增5 種沙門氏菌，而且擴增效率比2#和4#的效果好（圖1a～1c）。為進(jìn)一步分析該引物探針組合在ERA 熒光法反應(yīng)體系中的特異性，以腸炎沙門氏菌ATCC10708 為檢測對象，對食品中常見的食源性致病菌，如枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等12 種陰性對照菌，使用1#引物探針進(jìn)行ERA 特異性分析。結(jié)果顯示，1#引物探針僅能特異性擴增腸炎沙門氏菌ATCC10708，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等12 種非沙門氏菌的食源性致病菌均未擴增（圖1d），表明該引物探針在ERA 反應(yīng)體系中對沙門氏菌特異，可用于ERA 熒光法快速檢測體系的建立。

圖1 沙門氏菌引物探針篩選結(jié)果Fig.1 Results of Salmonella primer probe screening

2.1.2 ERA 熒光法快速反應(yīng)程序的建立 為縮短檢測時間，以腸炎沙門氏菌ATCC10708 為模板，依托便攜式迷你qPCR 儀，對ERA 熒光法的檢測程序進(jìn)行優(yōu)化。擴增結(jié)果顯示，當(dāng)擴增循環(huán)數(shù)設(shè)為40 時，ERA 結(jié)果的重復(fù)性最好，擴增效率最高，此時檢測時間為17 min（圖2a）。隨著反應(yīng)時間的縮短，ERA 結(jié)果重復(fù)性雖有所降低，但起峰時間和熒光值變化不大，擴增效率仍較好（圖2b～2d）。當(dāng)擴增循環(huán)數(shù)降到20 時，反應(yīng)時間雖僅需9 min，但擴增曲線的重復(fù)性較差，熒光值也降低較多（圖2e），說明該程序?qū)U增效果有影響。從節(jié)約時間的角度考慮，在保證檢測效率的情況下，ERA 熒光法快速反應(yīng)程序設(shè)定為：39 ℃反應(yīng)1 s；39 ℃反應(yīng)14 s，25 個循環(huán)。此時，檢測時間僅需11 min。

圖2 ERA 熒光法快速反應(yīng)程序優(yōu)化Fig.2 Optimization of rapid reaction procedure for ERA fluorescence method

2.1.3 ERA 熒光法檢測的靈敏度分析 分析建立的ERA 熒光法對沙門氏菌的檢測靈敏度，分別以DNA 質(zhì)量濃度為102，101，100，10-1，10-2ng/μL的腸炎沙門氏菌ATCC10708 為模板，檢測結(jié)果見圖3。當(dāng)DNA 質(zhì)量濃度為10-2ng/μL 時仍被檢出，擴增效果良好。最終確定本研究建立的ERA 熒光法檢測沙門氏菌的最低靈敏度為10-2ng/μL。

圖3 建立的ERA 熒光法的靈敏度分析結(jié)果Fig.3 Sensitivity analysis results of fluorescent ERA reaction

2.2 ERA 顯色法的建立

2.2.1 基礎(chǔ)型ERA 引物篩選 采用表2 中4 組沙門氏菌PRA 引物進(jìn)行ERA 反應(yīng)，擴增效果如圖4a 所示。1F1R 和3F3R 的擴增效果較好。對這兩組引物的特異性以及對5 種沙門氏菌的覆蓋性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：1F1R 對5 種鼠傷寒沙門氏菌的擴增效果較好，且其它12 種非沙門氏菌的食源性致病菌均無擴增。引物3F3R 雖也對沙門氏菌特異，但對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 的擴增效果較差（圖4b）。后續(xù)試驗以1F1R 為沙門氏菌基礎(chǔ)型ERA 檢測的引物。

圖4 沙門氏菌基礎(chǔ)型ERA 引物篩選Fig.4 Primers screening of basic ERA method for Salmonella

2.2.2 顯色劑的篩選 對基礎(chǔ)型ERA 檢測結(jié)果的傳統(tǒng)分析需采用電泳檢測和凝膠呈像。為滿足現(xiàn)場檢測的要求，本研究欲建立一種現(xiàn)場顯色法以取代電泳法。常見的顯色劑包括：中性紅、羥基萘酚藍(lán)、苯酚紅、鈣黃綠素和1000×SYBR Green I等。本試驗比較基礎(chǔ)型ERA 反應(yīng)后采用上述顯色劑的檢測效果，結(jié)果如圖5a 所示。添加中性紅、苯酚紅酸堿指示劑，以及羥基萘酚藍(lán)、鈣黃綠素離子檢測劑時無法區(qū)分陽性樣品和空白對照。若加入核酸染料SYBR Green I，則陽性樣品呈綠色，空白對照顯橙色，兩者形成明顯對照，并可通過肉眼觀察結(jié)果。后續(xù)選擇1000×SYBR Green I 作為基礎(chǔ)型ERA 反應(yīng)的顯色劑。

為分析顯色劑添加量對檢測結(jié)果的區(qū)分效果，對1000×SYBR Green I 的添加量進(jìn)行分析。分別向ERA 反應(yīng)后的產(chǎn)物中添加1，1.5，2.5，2.5，3.5 μL 的1000×SYBR Green I，顛倒混勻后觀察顏色變化，結(jié)果如圖5b 所示?？梢钥闯觯?dāng)添加量為1～2.5 μL 時，均能區(qū)分陽性結(jié)果與空白對照，其中添加量為2 μL 時，區(qū)分效果最明顯。而當(dāng)添加量增到3 μL 時，陽性樣品與空白的顏色差距不大，基本呈現(xiàn)1000×SYBR Green I 染料的顏色，無法區(qū)分二者。最終確定后續(xù)ERA 顯色法試驗1000×SYBR Green I 的添加量為2 μL/25 mL 反應(yīng)產(chǎn)物。

2.2.3 ERA 顯色法快速檢測反應(yīng)程序優(yōu)化 為縮短ERA 顯色法檢測的時間，以腸炎沙門氏菌ATCC10708 為模板，對基礎(chǔ)型ERA 的擴增程序進(jìn)行優(yōu)化，分別用電泳法和顯色法觀察結(jié)果。如圖6所示，擴增時間從原始擴增程序的15 min 降到4 min 的過程中均可明顯區(qū)分陽性結(jié)果與空白對照，即ERA 顯色法只需4 min 即可進(jìn)行結(jié)果分析。從節(jié)約時間的角度，在滿足檢測要求的情況下，后續(xù)基礎(chǔ)型快速檢測的反應(yīng)程序設(shè)定為：39 ℃等溫擴增4 min。

圖6 ERA 顯色法反應(yīng)時間優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Reaction time optimization results of ERA chromogenic method

2.2.4 不依賴儀器的ERA 顯色法的建立 無論是采用煮沸法提取致病菌的DNA，還是ERA 檢測都需要加熱設(shè)備，如水浴鍋、PCR 儀或等溫擴增儀等。為擺脫現(xiàn)場檢測對傳統(tǒng)實驗室設(shè)備的依賴，以自熱盒取代水浴鍋，提供DNA 提取所需溫度環(huán)境。結(jié)果顯示：自熱盒1 min 30 s 開始出現(xiàn)氣泡（84 ℃，圖7a 左），20 min 內(nèi)保持80～84 ℃。提取的DNA 質(zhì)量濃度（285.44±2.13）ng/μL 與傳統(tǒng)煮沸法（315.65 ± 10.99）ng/μL 差異不大，純度平均值幾乎相同，可滿足后續(xù)ERA 反應(yīng)的要求。然后，使用熱帖代替PCR 儀或等溫擴增儀，以提供現(xiàn)場ERA 反應(yīng)所需溫度。撕開熱帖包裝5 min 后溫度可達(dá)37 ℃（圖7a 右），即ERA 反應(yīng)要求的溫度下限；20 min 后可達(dá)42 ℃，即ERA 反應(yīng)的上限溫度。采用此法進(jìn)行ERA 快速檢測，顯色結(jié)果如圖7b 所示，陽性樣品呈現(xiàn)明顯的綠色，而空白為橙色，區(qū)分效果良好。電泳結(jié)果也顯示良好的擴增條帶，證實建立的不依賴儀器的ERA 顯色法可行。

圖7 不依賴儀器的ERA 顯色法檢測結(jié)果Fig.7 Results of ERA chromogenic method without instruments

2.2.5 不依賴儀器的ERA 顯色法靈敏度分析 為分析上述建立的不依賴儀器的ERA 顯色法的檢測靈敏度，分別以模板質(zhì)量濃度為102，101，100，10-1，10-2ng/μL 的腸炎沙門氏菌ATCC10708 進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖8。當(dāng)模板質(zhì)量濃度低至10-2ng/μL 時顯色仍為綠色，與空白對照區(qū)分明顯，對應(yīng)的電泳結(jié)果有清晰的目的條帶。最終確定建立的不依賴儀器的ERA 顯色法對沙門氏菌的檢測靈敏度低至10-2ng/μL。

圖8 ERA 顯色法靈敏度檢測結(jié)果Fig.8 Sensitivity for Salmonella of ERA chromogenic method

2.3 人工污染試驗

對人工污染腸炎沙門氏菌ATCC10708 的污染量分別為103，102，101，100的樣品增菌0～4 h，并提取DNA，分析建立的2 種ERA 可視化快速檢測方法的實際檢出限。結(jié)果顯示：前增菌2 h，兩種方法最低可檢出濃度為100 CFU/mL 的沙門氏菌，前增菌4 h 最低可檢出1 CFU/mL 的沙門氏菌（表3）。圖9 顯示增菌4 h 的檢測結(jié)果。隨著污染量的降低，熒光法的擴增效率逐漸降低（圖9a）。顯色法結(jié)果顯示試驗組均有綠色熒光，與空白對照差別明顯，對應(yīng)的電泳條帶亮度逐漸下降。最終確定本研究建立的兩種ERA 可視化快速檢測方法前增菌4 h 的檢出限均為1 CFU/mL。

表3 人工污染樣品檢測結(jié)果Table 3 Test results of artificially contaminated samples

3 討論

在我國，每年都有因食源性致病菌導(dǎo)致的中毒事件發(fā)生。目前，食源性致病菌的檢測主要采用GB 4789 規(guī)定的培養(yǎng)法，檢測周期4～6 d，時間長、流程復(fù)雜且需經(jīng)驗豐富的檢測人員。面對當(dāng)今生鮮農(nóng)產(chǎn)品快速流通的現(xiàn)狀，這種耗時較長的檢測手段無法滿足市場快速篩查的需求。近年，已報道許多食源性致病菌快速檢測方法。例如，魏瑩等[25]根據(jù)CepA 基因設(shè)計了針對A 族乙型溶血性鏈球菌的RPA 引物和探針，在39 ℃恒溫下，20 min 內(nèi)可檢 出10 copies/μL 的 目的基 因。Yang等[26]綜述LAMP 在沙門氏菌檢測方面的研究進(jìn)展，并分析其在食品等領(lǐng)域的應(yīng)用前景。陳佳平等[27]通過rfbE 基因設(shè)計RPA 引物及探針，能夠快速、準(zhǔn)確區(qū)分大腸桿菌O157 血清型與非O157 血清型的菌株。Jiang 等[28]針對副溶血弧菌設(shè)計RPA 引物探針，將其應(yīng)用到生蠔中副溶血弧菌的檢測，針對實際樣品的檢測靈敏度達(dá)2 CFU/g。劉立兵等[29]基于RPA 技術(shù)建立了一種產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速檢測方法，僅需3～13 min 即可檢出人工污染樣品中的陽性樣品，檢出限為1×102CFU/mL。王妙姝等[30]建立了一種通過可視化單引物等溫擴增技術(shù)檢測發(fā)酵乳制品中沙門氏菌的方法，對純培養(yǎng)物的檢出限為3.2×101CFU/mL。

ERA 技術(shù)誕生時間較晚，目前研究主要集中在病毒和臨床疾病檢測等方面，在食源性致病菌快速檢測方面缺乏報道。本研究創(chuàng)新性地將文獻(xiàn)報道的RPA 引物探針應(yīng)用至ERA 檢測體系，首次建立沙門氏菌ERA 可視化快速檢測方法，為食源性病原菌的快速檢測提供了新思路和新方法。研究過程中，首先依托國產(chǎn)便攜式迷你qPCR 儀建立ERA 熒光法，檢測時間僅需11 min。該儀器僅A4 紙大小，可攜帶至現(xiàn)場檢測，且具有無運動光學(xué)部件，移動運輸無需校準(zhǔn)維護。目前已集成一個從DNA 提取到ERA 可視化快速檢測為一體的便攜式快速檢測箱，可為口岸、野外等應(yīng)用場景的現(xiàn)場快速檢測提供良好的技術(shù)裝備。其次，篩選基礎(chǔ)型ERA 檢測的顯色劑，建立ERA 顯色法，并且創(chuàng)新性地使用自熱包和熱帖進(jìn)行DNA 提取和ERA 反應(yīng)，集成了不依賴儀器的現(xiàn)場可視化快速檢測裝備，從而擺脫了對傳統(tǒng)設(shè)備如水浴鍋、PCR儀、等溫擴增儀等的依賴，不僅降低了檢測成本，而且自熱包的升溫速度更快，能夠顯著縮短DNA提取所需時間，從DNA 提取到可視化檢測整個流程僅需10 min 左右。本研究建立的沙門氏菌ERA可視化快速檢測方法特異性好、靈敏度高、操作簡單、成本低廉、不依賴設(shè)備，十分適合在現(xiàn)場和基層檢測中應(yīng)用推廣，可為我國食品安全監(jiān)管和口岸食品查驗提供技術(shù)支持。采用的ERA 檢測試劑和集成的便攜式現(xiàn)場快速檢測裝備均為我國自主研發(fā)，對打破國外試劑裝備壟斷，突破國外“卡脖子”技術(shù)具有重要的意義。