楊峻乙，張家濤，2，劉亮軍，李秀霞，王莉麗，楊 旭，孫 彤*，勵(lì)建榮

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧錦州121013 2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010018 3 民澤龍羊峽生態(tài)水殖有限公司 青海海南藏族自治州 811800）

細(xì)菌生物被膜（Biofilm，BF）是一種復(fù)雜的細(xì)菌聚集膜，由細(xì)菌分泌的胞外多糖、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等物質(zhì)組成，是地球上分布最廣、最成功的生命模式，被定義為“微生物的聚集體”，是細(xì)菌生長過程中形成的一種天然保護(hù)狀態(tài)[1-2]。物體表面99.9%的細(xì)菌以生物被膜形式存在[3]。生物被膜使菌體成為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高度組織化群體，其形成包括黏附期、生長期、成熟期、分散期4 個(gè)階段的動(dòng)態(tài)過程[1，4]，對(duì)細(xì)菌菌體具有強(qiáng)烈的保護(hù)作用。

1997 年，Neinhuis 等[5]和Barthlott 等[6]發(fā)現(xiàn)，植物表面的微觀結(jié)構(gòu)粗糙度及表皮蠟的疏水特性的結(jié)合使植物具有自清潔和超疏水性能，稱之為“蓮花效應(yīng)”?；谏锝绲倪@種發(fā)現(xiàn)，人們制備出水接觸角大于150°，滾動(dòng)角小于10°的超疏水表面，具有低表面能和特殊的浸潤性，能夠有效減少細(xì)菌細(xì)胞與材料表面之間的黏附[7-8]。由于超疏水表面具有獨(dú)特的浸潤性能，使其在自清潔、抗細(xì)菌黏附、防冰、油水分離等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[9]。然而，有研究表明，超疏水表面長期暴露于潮濕環(huán)境后仍有被浸潤的風(fēng)險(xiǎn)，隨著時(shí)間的推移，細(xì)菌會(huì)在材料表面附著，使其失去抗菌性能，這種現(xiàn)象在超疏水材料表面較為常見[7，10]?；诖?，人們通過對(duì)超疏水表面制備原理的認(rèn)識(shí)與研究，制備出超雙疏表面，然而其在實(shí)際應(yīng)用中的范圍較窄，這是由于其表面性能不太穩(wěn)定[11-12]。

納米SiOx 是一種無毒、無味的無機(jī)非金屬材料，易制備、易改性、粒徑可控，可作為抗拮劑加入脫水蛋制品、飲料、乳制品等食品中[13-15]。聚氨酯（Polyurethane，PU）是一種新興高分子聚合物，其鏈段結(jié)構(gòu)由軟段和硬段交替構(gòu)成，且主鏈中含有氨基甲酸酯（-NHCOO-）結(jié)構(gòu)單元[16]。水性聚氨酯（Waterborne polyurethane，WPU）是以水代替有機(jī)溶劑為分散相的二元膠態(tài)體系，無毒、無污染，在紡織、皮革、涂層、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[17-18]。水性聚氨酯涂料化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，無毒、無味，是一種環(huán)保型高分子聚合物彈性防水材料[19]。

腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）為耐冷革蘭氏陰性菌，能夠還原氧化三甲胺（TMAO）產(chǎn)生硫化氫、三甲胺（TMA）及氨基酸代謝產(chǎn)物等，易黏附于材料表面，從而形成生物被膜，有很強(qiáng)的致腐能力，是一種典型的水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌[20-22]。

本文采用St?ber 法在同一溶劑體系中制備和改性SiOx 微納米粒子，然后以水性聚氨酯為成膜材料，制備改性SiOx/WPU 涂膜。研究該涂膜對(duì)水產(chǎn)品中腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制機(jī)制，以拓寬超雙疏涂膜在食品保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用，并提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

疏水氣相納米SiOx 顆粒、微米級(jí)SiOx 顆粒，上海凜恩科技發(fā)展有限公司；腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens，ATCC 8071）為渤海大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室保存；超微量Na+/K+-ATP 酶測(cè)定試劑盒、堿性磷酸酶（AKPase）測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；考馬斯亮藍(lán)試劑盒，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；去離子水為實(shí)驗(yàn)室自制，電導(dǎo)率〈15 μS/cm；其它試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平（型號(hào)：FA2204C），上海天美天平儀器有限公司；磁力攪拌器（型號(hào)：SN-MS-3D），上海尚普儀器設(shè)備有限公司；真空干燥箱（型號(hào)：DZF-1B），鄄城威瑞科教儀器有限公司；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（型號(hào)：S-4800），日本日立公司；原子力顯微鏡（型號(hào)：XE-70），韓國Park Systems 公司；差示掃描量熱儀（型號(hào)：Q2000），上海蔡?？茖W(xué)儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀（型號(hào)：Scimitar 2000 Near FT-IR Spectrometer），美國安捷倫公司；X 射線粉末衍射儀（型號(hào)：Rigaku Ultima IV），日本理學(xué)株式會(huì)社；視頻光學(xué)接觸角測(cè)量儀（型號(hào)：OCA 25），德國數(shù)據(jù)物理儀器有限公司；X 射線光電子能譜儀（XPS）（型號(hào)：Thermo Scientific K-Alpha），賽默飛世爾科技公司；鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)：DHA-9423A），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；立式高壓滅菌鍋（型號(hào)：MLS-3030CH），日本三洋有限公司；生化培養(yǎng)箱（型號(hào)：LRH-150），上海一恒科技有限公司；臺(tái)式恒溫振蕩箱（型號(hào)：THZD），太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；酶標(biāo)儀（型號(hào)：Victor X3），上海珀金埃爾默儀器有限公司。

1.3 改性SiOx/WPU 涂膜的制備及表征

1.3.1 改性SiOx/WPU 涂膜的制備 將0.2400 g CTAB、24.00 mL 無水乙醇和3.00 mL 氨水（28%）依次加入24.00 mL 去離子水中，攪拌溶解后逐滴加入3.00 mL 正硅酸乙酯（TEOS），常溫繼續(xù)攪拌3 h，得SiOx 混懸液。過濾混懸液并用去離子水和無水乙醇分別洗滌濾渣3 次，濾渣在60 ℃，0.6 MPa 條件下真空干燥2 h，得C-SiOx 顆粒。

分別取0.3000 g 的氣相納米SiOx 顆粒、微米級(jí)SiOx 顆粒和C-SiOx 顆粒與30.00 mL 無水乙醇超聲后的懸濁液，逐滴加入3.00 mL 的TEOS 后依次加入6.00 mL 氨水（28%）和300 μL1H，1H，2H，2H-全弗辛基三氯硅烷（PFOTS），室溫條件下攪拌6 h，再次加入150 μL PFOTS，室溫條件下繼續(xù)攪拌2 h，反應(yīng)結(jié)束后過濾，并用10.00 mL 無水乙醇洗滌濾渣，重復(fù)3 次，隨后在55 ℃，0.6 MPa的條件下真空干燥2 h，分別得改性氣相納米SiOx顆粒、改性微米級(jí)SiOx 顆粒和C-SiOx 顆粒。

將4.0%（m/V）的改性SiOx 顆粒與0.1800 g WPU、2.30 mL 無水乙醇和2.70 mL 乙酸乙酯超聲混合溶液在室溫條件下攪拌1 h，得改性SiOx/WPU 涂膜液。采用滴涂法在5 cm×5 cm 的聚氯乙烯（PVC）薄片上滴涂1.20 mL 的涂膜液，室溫晾干后，于55 ℃烘箱烘干6 h，得改性SiOx/WPU 涂膜。

1.3.2 SiOx 顆粒及涂膜的表征分析 采用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）觀察改性SiOx 顆粒及改性SiOx/WPU 涂膜的微觀結(jié)構(gòu)。噴金條件為：20 kV，3 min；測(cè)定電壓為：1.5 kV 或1.0 kV。

在40 kV，50 mA，CuKα 輻射，步寬0.02°，掃描范圍5°～40°條件下，采用X 射線粉末衍射儀（XRD）對(duì)改性SiOx 微納米粒子及改性SiOx/WPU涂膜樣品進(jìn)行晶型分析。

采用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）對(duì)改性后的SiOx 顆粒進(jìn)行FT-IR 光譜掃描，波長范圍為4 000～500 cm-1，步寬為2 cm-1。

將滴涂有改性SiOx/WPU 涂膜的PVC 薄片裁成5 mm×5 mm 大小，在15 kV 和150 W 的條件下，以與樣品表面呈90°的起飛角收集光電子，采用X 射線光電子能譜（XPS）對(duì)樣品進(jìn)行元素分析。

SiOx/WPU 涂膜表面的3D 輪廓形貌及其平均粗糙度采用原子力顯微鏡（AFM）進(jìn)行表征。

稱取3～8 mg 樣品，采用差示掃描量熱儀（DSC）測(cè)定涂膜的熱穩(wěn)定性，測(cè)定條件：升溫速率為10.00 ℃/min，升溫范圍為20～250 ℃，氮?dú)猸h(huán)境。

稱取5～10 mg 樣品，采用熱重分析儀（TGA）在20.0 mL/min 的氮?dú)饬髁浚?0.00 ℃/min 的加熱速率下測(cè)定涂膜的熱穩(wěn)定性，測(cè)定溫度范圍為30～650 ℃。

1.3.3 浸潤性能和表面能測(cè)定 參考《納米材料超雙疏性能檢測(cè)方法》（GB/T 26490-2011）[23]，測(cè)定改性SiOx/WPU 涂膜的水接觸角和正十六烷接觸角。用Owens-Wendt-Rabel-Kaelble（OWRK）法計(jì)算表面自由能[24]。

1.4 腐敗希瓦氏菌生物被膜相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 涂膜表面腐敗希瓦氏菌生長曲線的測(cè)定 取在28 ℃、OD595nm值約為0.5 的腐敗希瓦氏菌菌懸液中培養(yǎng)一定時(shí)間的涂膜，用1 mL 無菌PBS 溶液（0.1 mol/L，pH=7.4）洗3 次，以除去其表面的浮游菌，隨后將涂膜置于裝有10 mL 無菌PBS 的離心管中，224 W 53 kHz 超聲處理10 min，以剝離涂膜表面的生物被膜。取1 mL 超聲后的菌懸液加入到9 mL 無菌PBS（0.1 mol/L，pH=7.4）中進(jìn)行10倍梯度稀釋，按照GB 4789.2-2016 的方法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)[25]。

1.4.2 涂膜表面腐敗希瓦氏菌生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)觀察 取培養(yǎng)4，12，24 h 后的涂膜，超聲剝離生物被膜，在4 ℃，3 000×g 條件下離心10 min，棄去上清液，立即加入1 mL 2.5%（體積分?jǐn)?shù)）戊二醛溶液固定2 h。1 mL 無菌水離心洗滌2 次后，依次用1 mL 50%，70%，80%，90%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液脫水處理30 min，最后用1 mL 無水乙醇脫水處理1 h。將已固定的被膜菌無水乙醇溶液少量多次的滴到細(xì)胞爬片上，室溫晾干后，于37 ℃干燥12 h。用SEM 觀察被膜菌的微觀形貌和黏附團(tuán)聚狀況。

1.4.3 涂膜表面腐敗希瓦氏菌生物被膜相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

1）胞外多糖（EPS）的測(cè)定 取在菌懸液中培養(yǎng)一定時(shí)間的涂膜，用1 mL 的無菌PBS（0.1 mol/L，pH=7.4）洗3 次，隨后加入2 mL 無菌PBS 超聲剝離生物被膜（224 W 53 kHz，10 min），取1 mL超聲后的菌懸液在4°C，20 000×g 條件下離心20 min，用0.22 μm 膜過濾器過濾，根據(jù)EPS 酶聯(lián)免疫分析試劑盒操作步驟測(cè)定上清液中胞外多糖含量。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長下的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的EPS 濃度。

2）代謝活性的測(cè)定 取在菌懸液中培養(yǎng)一定時(shí)間的涂膜，用1 mL 無菌PBS（pH=7.4，0.1 mol/L）洗3 次后，用100 μL LB 肉湯和50 μL XTT 試劑進(jìn)行培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h 后的OD490nm值。

3）總蛋白的測(cè)定 參照張家濤[26]和王多寧等[27]的方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取在菌懸液中培養(yǎng)24 h 的涂膜，超聲處理以剝離生物被膜。取1 mL超聲后的菌懸液，加入200 μL RIPA 裂解液，混勻后于4 ℃下靜置20 min，53 kHz 224 W 冰浴超聲處理40 min。4 ℃，10 000×g 條件下離心15 min，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μL 上清液與200 μL 考馬斯亮藍(lán)染色液混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定靜置5 min后溶液的OD595nm值。生物被膜中的總蛋白濃度根據(jù)所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

4）Na+/K+-ATP 酶活力和AKP 酶活力的測(cè)定

將超聲剝離生物被膜的菌懸液轉(zhuǎn)移至10 mL 無菌離心管中，在冰浴條件下用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲處理，細(xì)胞破碎液于-20 ℃保存。參照試劑盒試驗(yàn)步驟分別測(cè)定Na+/K+-ATP 的酶活力和AKP 的酶活力。

1.5 數(shù)據(jù)分析

接觸角分析測(cè)定樣品的6 個(gè)不同位置，其余試驗(yàn)重復(fù)3 次。使用Origin 9.1 軟件繪圖，采用SPSS 20.0 軟件中單因素方差分析的Duncan 多重比較法進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，P〈0.05 時(shí)有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 改性SiOx/WPU 涂膜的表征分析

2.1.1 改性SiOx/WPU 涂膜的微觀結(jié)構(gòu)表征 未改性的SiOx 顆粒及改性SiOx/WPU 涂膜表面的微觀形貌如圖1 所示。由圖1（a1）可見，氣相納米SiOx 顆粒呈球形，粒徑約為10 nm；而改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面SiOx 顆粒粒徑增加至30～50 nm，出現(xiàn)明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象（圖1（a2-a3））。由圖1（b1）可見，微米級(jí)SiOx 顆粒由微納米兩種級(jí)別的顆粒構(gòu)成，以直徑約1～3 μm 的顆粒為主；改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜表面微納米粒子交互存在，形成了微納米復(fù)合結(jié)構(gòu)（圖1（b2-b3））。圖1（c1）表明，由于制備過程中高濃度的表面活性劑起到了模板導(dǎo)向劑的作用，使C-SiOx 顆粒發(fā)生交聯(lián)，從而形成了六方相膠束[28]；而改性C-SiOx/WPU 涂膜表面均勻分布粒徑約為400 nm 的SiOx顆粒（圖1（c2-c3））。

圖1 未改性SiOx 顆粒（a1～c1）及其改性SiOx/WPU 涂膜（a2～c2，a3～c3）表面的SEM 圖Fig.1 SEM images of unmodified SiOx particles（a1-c1）and their modified SiOx/WPU coatings（a2-c2，a3-c3）

2.1.2 改性SiOx 和SiOx/WPU 涂膜XRD 和FIIR 分析 改性SiOx 顆粒及對(duì)應(yīng)的改性SiOx/WPU涂膜的XRD 譜圖如圖2A～2B 所示。改性SiOx 顆粒均在21.1°處出現(xiàn)SiOx 的非晶衍射峰[29]，表明SiOx 顆粒的微觀形貌不會(huì)影響其結(jié)晶性能。由圖2B 可見，改性SiOx/WPU 涂膜的非晶衍射峰移至20.8°處，然而并未出現(xiàn)WPU 的特征峰，這可能是由于WPU 為大分子有機(jī)物，分子鏈較長，其非晶態(tài)衍射峰與SiOx 顆粒的非晶衍射峰重合。

圖2 改性SiOx 顆粒、改性SiOx/WPU 涂膜的XRD 譜圖（A～B）及改性SiOx 顆粒的FI-IR 譜圖（C）Fig.2 XRD spectra of modified SiOx particels（A）and modified SiOx/WPU coatings（B），and FI-IR spectra of modified SiOx particels（C）

圖3C 為3 種改性SiOx 顆粒的FT-IR 譜圖。3 700～3 300 cm-1處的吸收峰為-OH 的伸縮振動(dòng)峰，1 635 cm-1附近的吸收峰為-OH 的彎曲振動(dòng)峰，-CH2的反對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在2 922 cm-1和2 852 cm-1處[30]；2 365 cm-1和2 345 cm-1處的峰為空氣中CO2的吸收峰；1 085 cm-1處和808 cm-1處分別屬于Si-O-Si 的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)和對(duì)稱伸縮振動(dòng)，947 cm-1處的峰歸因于Si-O 的伸縮振動(dòng)，在467 cm-1處為O-Si-O 的彎曲振動(dòng)峰[31]。由圖2C（a）可見，改性氣相納米SiOx 顆粒在3 655 cm-1處出現(xiàn)氣相納米SiOx 顆粒中游離-OH 的特征峰，在1 635 cm-1附近出現(xiàn)-OH 和-NH2的彎曲振動(dòng)峰；氣相納米SiOx 顆粒中-CH2的反對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在2 922 cm-1和2 852 cm-1處。由圖2C（b）可見，改性微米級(jí)SiOx 顆粒在3 700～3 300 cm-1處有較強(qiáng)的寬吸收峰，且吸收峰的中心位置向低波數(shù)移動(dòng)，在1 635 cm-1處有強(qiáng)度較弱的窄吸收峰，說明樣品中存在大量的締合-OH，即改性微米級(jí)SiOx 顆粒中有結(jié)合水的存在。由圖2C（c）可見，改性C-SiOx 顆粒在3 700～3 300 cm-1處出現(xiàn)的肩峰和寬峰分別為-OH 和CTAB 中-NH3的伸縮振動(dòng)峰；2 929 cm-1和2 855 cm-1處出現(xiàn)的峰與CTAB 中-CH2的反對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)有關(guān)。此外，對(duì)于各改性SiOx 顆粒PFOTS 中的-CF2和-CF3伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在747 cm-1和707 cm-1處，表明3 種SiOx 顆粒均已被氟化劑成功改性。

圖3 改性SiOx/WPU 涂膜的XPS 測(cè)量光譜（A）及高分辨率XPS 譜圖（B～F）Fig.3 XPS survey spectra（A）and high resolution XPS spectra（B-F）of modified SiOx/WPU coatings

2.1.3 改性SiOx/WPU 涂膜的XPS 分析 改性SiOx/WPU 涂膜的XPS 譜圖如圖3A 所示，由圖可見，各涂膜表面均含有F、O、C、Si 4 種元素，且由O 和Si 的相對(duì)含量可知，各涂膜表面單位面積上改性SiOx 顆粒的含量相近。而改性C-SiOx/WPU涂膜表面F 的相對(duì)含量最高，達(dá)到28.2%，改性氣相納米涂膜次之，為26.4%，改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜表面F 的相對(duì)含量最低，為24.9%。

圖3B～3E 為改性SiOx/WPU 涂膜的高分辨率XSP 譜圖。由圖3B 和3C 可見，各改性SiOx/WPU涂膜的F1s 峰分別出現(xiàn)在688.5，688.9，688.6 eV處，無顯著性差異。O1s 峰在532.5，532.8，532.6 eV處，屬于O-C（533.2 eV）、O-Si（532.4 eV）和O=C（531.7 eV）。由圖3D 可見，3 種涂分別在102.9，103.1，102.9 eV 處出現(xiàn)的Si2p 峰，可能屬于Si-C（102.0 eV）、Si-O-Si（103.4 eV）和Si-OH（104.5 eV）[32]。由圖3E 可見，3 種改性SiOx/WPU 涂膜的C1s 峰出現(xiàn)分峰現(xiàn)象。圖3F 為對(duì)改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜表面C1s 峰進(jìn)行分峰處理的XPS圖譜，294.1，291.8，285.3，284.3 eV 處的峰分別歸因于-CF3、-CF2、C-O 和C-C/C-H。涂膜表面的F1s、Si2p 和C1s 的檢測(cè) 結(jié)果表 明，涂膜已 被PFOTS 成功改性[33]。

2.1.4 改性SiOx/WPU 涂膜AFM 表征 圖4 為SiOx/WPU 涂膜的AFM 圖像。由圖4a 可知，改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面的微米級(jí)凸起完全由幾十納米的SiOx 顆粒聚集而成，其平均粗糙度Ra 值為273.1 nm，表面高度差約為2 μm。由圖4b可知，改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜表面高度差約為1.6 μm，Ra 值為212.3 nm，其表面凸起主要是由納米級(jí)的SiOx 顆粒相互聚集和微納米級(jí)的SiOx 顆粒相互堆疊而成。由圖4c 可知，改性CSiOx/WPU 涂膜與改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜相似，表面的凸起僅由粒徑約為400 nm 左右的SiOx 顆粒組成。此結(jié)果與SEM 檢測(cè)結(jié)果一致。

圖4 改性SiOx/WPU 涂膜高分辨率AFM 圖Fig.4 AFM images of modified SiOx/WPU coatings

2.1.5 改性SiOx/WPU 涂膜的熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 圖5a 為各改性SiOx/WPU 涂膜在20～250 ℃的DSC曲線圖。改性SiOx/WPU 涂膜的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）和熔化溫度（Tm）主要與WPU 中的軟段鏈和硬段鏈有關(guān)。WPU 中軟段鏈與硬段鏈的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度相差很大，其中軟段鏈的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tgs）遠(yuǎn)低于0 ℃，而硬段鏈的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tgh）則在80～100 ℃，遠(yuǎn)高于室溫[34]。由圖可見，改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜在81.96 ℃處出現(xiàn)第1個(gè)吸熱峰，而改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜和改性C-SiOx/WPU 涂膜分別在64.02 ℃和25.94 ℃處出現(xiàn)第1 個(gè)吸熱峰，在79.03 ℃和79.86 ℃處出現(xiàn)第2 個(gè)吸熱峰，表明3 種改性SiOx 顆粒均可與涂膜中WPU 的軟段鏈發(fā)生相互作用。而3 種改性SiOx/WPU 涂膜分別在146.08，140.36，153.27 ℃出現(xiàn)的吸熱峰對(duì)應(yīng)于涂膜中WPU 硬段鏈的熔化溫度（Tmh），與其硬段鏈的短程有序轉(zhuǎn)變有關(guān)[33]。3種涂膜中WPU 的硬段鏈短程有序化的焓變（ΔH）分別為14.49，15.82，19.48 J/g，表明C-SiOx 顆粒與WPU 的硬段鏈相互作用弱于改性氣相納米SiOx 顆粒和改性微米級(jí)SiOx 顆粒。此外，CTAB的熔化吸熱使改性C-SiOx/WPU 涂膜在210.75 ℃出現(xiàn)一個(gè)弱吸熱峰。

圖5 不同粒徑低表面能改性SiOx/WPU 涂膜的DSC 圖（a）、TGA 圖（b）和DTG 圖（c）Fig.5 DSC（a），TGA（b）and DTG（c）spectra of low surface energy modified SiOx/WPU coatings with different particle sizes

圖5b 和5c 為改性SiOx/WPU 涂膜的TGA 和DTG 曲線。由圖可見，改性SiOx/WPU 涂膜的初始質(zhì)量損失均發(fā)生在44～100 ℃左右，這是由涂膜中的水分損失造成的。第2 階段的質(zhì)量損失發(fā)生在150～200 ℃之間，主要與涂膜中WPU 硬段鏈中脲基甲酸酯的分解有關(guān)。在200～320 ℃改性氣相SiOx/WPU 涂膜、改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜和改性C-SiOx/WPU 涂膜的質(zhì)量損失主要與涂膜中WPU 硬段鏈的脲基甲酸酯和氨基甲酸酯分解有關(guān)，其質(zhì)量損失依次約為11.49%，12.38%，17.35%。由此可見，改性氣相SiOx 顆粒和改性微米級(jí)SiOx顆粒對(duì)WPU 中硬段的相互作用更強(qiáng)，這與DSC分析結(jié)果一致。在320～430 ℃之間，3 種改性SiOx/WPU 涂膜的質(zhì)量損失分別約為12.33%，13.81%，14.40%，此階段的質(zhì)量損失主要與涂膜中WPU 軟段鏈中聚醚多元醇的分解有關(guān)。在430～640 ℃之間，3 種改性SiOx/WPU 涂膜的質(zhì)量損失主要與改性劑和WPU 中殘留物的碳化有關(guān)，分別約為13.04%，14.74%，11.93%。

2.1.6 改性SiOx/WPU 涂膜表面的接觸角和表面能 由圖6 可見，改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜的水接觸角為155.9°±5.9°，正十六烷的接觸角為0°，表面能為（23.4±2.4）J/m2，為超疏水超親油表面。這是因?yàn)楦男詺庀嗉{米SiOx/WPU 涂膜表面完全由幾十納米的SiOx 顆粒構(gòu)成，其表面的的微米級(jí)凸起形成的氣層無法抵御正十六烷的完全浸潤。改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜的水接觸角為154.5°±2.1°，正十六烷的接觸角為132.8°±0.7°，表面能最低，僅有（0.3±0.1）J/m2，為超雙疏表面。結(jié)合SEM 結(jié)果分析認(rèn)為，這是因?yàn)楦男晕⒚准?jí)SiOx/WPU 涂膜表面SiOx 微納米粒子交互存在，形成了微納米復(fù)合結(jié)構(gòu)，這種不規(guī)則的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)使涂膜與液滴間可以形成固-氣-液三相交互的復(fù)合界面，液滴無法浸潤涂膜表面，使其具有超雙疏性能。改性C-SiOx/WPU 涂膜的水和正十六烷接觸角分別為139.9°±3.5°和0°，表面能最高，達(dá)到（229.6±4.2）J/m2，為疏水超親油表面。這是因?yàn)楦男訡-SiOx/WPU 涂膜表面與改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面相似，僅由粒徑均一的SiOx 顆粒構(gòu)成，無法形成微納米復(fù)合結(jié)構(gòu)，因此同樣會(huì)被正十六烷完全浸潤。結(jié)合涂膜的XPS 譜圖分析可得，表面F 相對(duì)含量最低的改性微米級(jí)SiOx/WPU涂膜的表面疏水疏油效果最好，表明高氟含量并不是形成涂膜超雙疏性能唯一特性，表面微觀形貌同樣顯著影響涂膜的疏水疏油性能和表面能。

圖6 改性SiOx/WPU 涂膜的表面濕潤性和表面能Fig.6 Surface wettability and surfaceenergy of the modified SiOx/WPU coatings

2.2 改性SiOx/WPU 涂膜表面生物被膜菌微觀形貌分析

圖7 為培養(yǎng)不同時(shí)間后各涂膜表面腐敗希瓦氏菌生物被膜微觀形貌的SEM 圖。由圖7（a1～c1）可見，培養(yǎng)4 h 后，各涂膜表面黏附的被膜菌數(shù)量均較少。由圖7（a2～c2）可見，培養(yǎng)12 h 后，多個(gè)細(xì)菌的不可逆黏附出現(xiàn)在超疏水超親油性的改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜和疏水超親油性的改性CSiOx/WPU 涂膜表面，且改性C-SiOx/WPU 涂膜表面黏附的細(xì)菌開始形成微菌落，而改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜表面仍為單個(gè)細(xì)菌的不可逆黏附。如圖7（a3-c3）所示，培養(yǎng)24 h 后，改性氣相SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌主要以微菌落的形式存在；改性C-SiOx/WPU 涂膜表面的細(xì)菌數(shù)量大量增加，微菌落相互聚集，形成成熟的生物被膜；而改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜表面的被膜菌則剛開始形成微菌落。

可見，改性C-SiOx/WPU 涂膜表面黏附的被膜菌數(shù)量最多，在24 h 時(shí)涂膜表面的生物被膜已到成熟期，這是由于改性C-SiOx/WPU 涂膜僅具有疏水性能，不能有效抑制被膜菌的黏附及其生物被膜的形成。改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面黏附的細(xì)菌數(shù)量次之，在24 h 時(shí)未形成成熟的生物被膜，這可能是由于改性氣相納米SiOx/WPU涂膜表面的疏水性能更強(qiáng)，使其與菌懸液之間形成了一個(gè)較小空氣層，可以在一定程度上阻礙被膜菌與涂膜表面的接觸，從而延緩了涂膜表面生物被膜的形成。由微納米級(jí)SiOx 顆粒形成不規(guī)則的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，構(gòu)成改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜具有超雙疏性能，該薄膜在菌懸液中可較長時(shí)間地維持Cassie 狀態(tài)，且空氣層占比最多，因此表面黏附的細(xì)菌數(shù)量最少，抑制生物被膜形成的能力最優(yōu)，在24 h 時(shí)才開始出現(xiàn)微菌落。

2.3 改性SiOx/WPU 涂膜表面生物被膜菌相關(guān)指標(biāo)分析

圖8 為改性SiOx/WPU 涂膜表面腐敗希瓦氏菌生物被膜相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果。由圖8a 和8b可見，0～2 h，涂膜表面細(xì)菌數(shù)量開始增加，培養(yǎng)基中游離的腐敗希瓦氏菌開始黏附在涂膜表面進(jìn)行可逆黏附。相較而言，雖然3 種涂膜表面黏附的細(xì)菌數(shù)量無顯著差異，但是改性微米級(jí)SiOx/WPU涂膜表面黏附的細(xì)菌數(shù)量少于改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜和改性C-SiOx/WPU 涂膜，表明超雙疏性的改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜可抑制細(xì)菌的初期黏附。在此階段，各樣品表面被膜菌代謝活性均緩慢增加無顯著差異。2～12 h，涂膜表面的被膜菌數(shù)量增加趨勢(shì)減緩，細(xì)菌開始進(jìn)行不可逆黏附。在此階段，改性C-SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌數(shù)量和代謝活性最高，說明疏水超親油性的改性C-SiOx/WPU 涂膜有利于細(xì)菌的不可逆黏附；改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面黏附的細(xì)菌數(shù)量及其代謝活性次之，表明超疏水超親油性的改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜對(duì)細(xì)菌的不可逆黏附有一定程度的抑制作用；而超雙疏性的改性SiOx/WPU涂膜對(duì)細(xì)菌不可逆黏附的抑制效果最好，因此其表面的被膜菌數(shù)量和代謝活性處于最低水平，表明。12～24 h，被膜菌形成微菌落，從而促進(jìn)生物被膜的形成。在此階段，改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌數(shù)量仍以較快的速度增加，并在24 h 時(shí)與改性C-SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌數(shù)量相近，而改性C-SiOx/WPU 涂膜表面細(xì)菌增長逐漸變緩，表明改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜在一定程度上可以抑制細(xì)菌的黏附及生物被膜的形成，然而其表面利于被膜菌的定植，因此其表面被膜菌代謝活性繼續(xù)增加。而改性C-SiOx/WPU 涂膜表面生物被膜已接近成熟期，且由于此階段涂膜表面被膜菌數(shù)量過多，胞外多聚物逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楸荒ぞ臓I養(yǎng)提供體，使菌體自身的代謝活性降低。此時(shí)，改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜表面的黏附被膜菌數(shù)量仍保持最低水平，表明該涂膜可有效抑制被膜菌形成微菌落，進(jìn)而形成生物被膜。可見，超雙疏的改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜表面可顯著抑制被膜菌的黏附及其表面生物被膜的形成。

圖8 改性SiOx/WPU 涂膜表面腐敗希瓦氏菌生物被膜相關(guān)指標(biāo)的變化Fig.8 Changes of related indexes of Shwanella putrefaciens biofilm on the modified SiOx/WPU coatings

抑制細(xì)菌EPS 的分泌可以控制細(xì)菌與材料表面的初始黏附以及形成生物被膜的膜性結(jié)構(gòu)[35]。由圖8c 可見，各涂膜表面EPS 均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸增加。在0～12 h 細(xì)菌的可逆與不可逆黏附階段，改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜表面EPS增加最慢，表明超雙疏的改性微米級(jí)SiOx/WPU涂膜可抑制細(xì)菌EPS 的分泌及微菌落的形成。此時(shí)，改性C-SiOx/WPU 涂膜表面EPS 的增加速度最快，改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜次之。在12～24 h，改性C-SiOx/WPU 涂膜的表面EPS 的增加變得緩慢，而改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面EPS 繼續(xù)增加，在24 h 時(shí)涂膜表面被膜菌EPS 含量超過了改性C-SiOx/WPU 涂膜，而改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌的EPS 含量雖然繼續(xù)增加，但仍保持較低水平。該結(jié)果表明，具有單一粗糙結(jié)構(gòu)的改性C-SiOx/WPU 涂膜表面的生物被膜已成熟，EPS 分泌逐漸減少；改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜在此階段更有利于細(xì)菌分泌EPS形成微菌落；而由于改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜表面的特殊微納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其仍可抑制細(xì)菌形成微菌落，故EPS 分泌最少。

如圖8d 所示，在生物被膜形成過程中各涂膜的表面生物被膜總蛋白逐漸增加。其中，改性CSiOx/WPU 涂膜表面的生物被膜總蛋白含量增加速度最快，高于同期其它樣品，可能是因?yàn)樵撏磕け砻嬗闪綖?00 nm 的SiOx 顆粒組成，無微米級(jí)凸起，盡管表面含有最多的氟碳化合物，但僅具有疏水性能，無疏油性能，無法阻止被膜菌的黏附，并抑制其生物被膜的形成。培養(yǎng)至12 h 之前，改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面生物被膜的總蛋白含量較低，培養(yǎng)至24 h 時(shí)，涂膜表面總蛋白量與改性C-SiOx/WPU 涂膜表面的總蛋白含量相當(dāng)，這是由于其雖具有超疏水性能，但其疏油能力仍較差，培養(yǎng)至12 h 后，細(xì)菌在涂膜表面大量黏附，該結(jié)果與被膜菌的生長曲線試驗(yàn)結(jié)果一致。在生物被膜培養(yǎng)過程中，改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜表面生物被膜總蛋白的含量最低，這是由于其與菌懸液間維持較長時(shí)間的Cassie 狀態(tài)，“捕獲”足夠的空氣，從而抑制細(xì)菌的不可逆黏附和已黏附細(xì)菌分泌EPS，并阻止其形成微菌落。

ATP 酶存在于細(xì)胞內(nèi)外膜上，主要參與ATP的分解，胞外ATP 酶的活性揭示了被膜菌細(xì)胞膜的完整性[36-38]。AKP 酶主要存在于細(xì)胞膜與細(xì)胞壁之間，胞外AKP 酶的水平同樣也可以反應(yīng)被膜菌細(xì)胞壁受損傷的程度[39]。如圖8e～8f 所示，在培養(yǎng)24 h 后，超雙疏性的改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌ATP 酶和AKP 酶活性最低，表明生物被膜內(nèi)ATP 酶和AKP 酶活性最低，這是由于其表面特殊的微納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)使涂膜可有效抑制細(xì)菌的黏附，阻止細(xì)菌胞外多糖的分泌，進(jìn)而抑制被膜菌形成微菌落。

3 結(jié)論

采用不同SiOx 顆粒改性獲得的改性SiOx/WPU 涂膜的理化性能差異顯著，對(duì)水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制性能不同。其中由兩種不同粒徑的SiOx 顆粒形成微納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的改性微米級(jí)SiOx/WPU 涂膜表面表現(xiàn)為超雙疏性，表面能最低，涂膜熱穩(wěn)定性較高?？娠@著抑制細(xì)菌的黏附和已黏附細(xì)菌的代謝活性、EPS 分泌、ATP 酶和AKP 酶活性，進(jìn)而抑制微菌落的形成。改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表現(xiàn)為超疏水超親油性，表面能較低，涂膜的熱穩(wěn)定性最高，可以抑制細(xì)菌的初期黏附，然而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，表面黏附細(xì)菌量快速增加。改性C-SiOx/WPU 涂膜表現(xiàn)為疏水超親油性，表面能最高，熱穩(wěn)定性最差，抗細(xì)菌黏附的性能最差。采用微米級(jí)SiOx 顆粒改性制備的改性SiOx/WPU 涂膜對(duì)水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制性能最優(yōu)，本研究可為制備具有抗生物被膜性能的食品包裝材料提供技術(shù)支撐。