徐帥帥，張 斌，馬 爽，趙萌迪，李 敏，巨明月，牛付閣，張影全，王效靈，張 波*，潘偉春*

（1 浙江工商大學信息與電子工程學院 杭州310018 2 浙江工商大學食品與生物工程學院 杭州310018 3 浙江方圓檢測集團股份有限公司 杭州310018 4 中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 北京 100193）

小麥是中國的三大主糧之一，是重要的植物蛋白資源[1]。小麥中面筋蛋白可以形成網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，從而使其制品具有特有的黏彈性和口感[2-4]。前人研究表明，面團流變性能主要由面筋蛋白所構(gòu)建的三維網(wǎng)絡決定[5-6]。擠壓組織化植物蛋白的質(zhì)構(gòu)特性是決定產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵指標之一，主要來自于原料中所含蛋白質(zhì)的展開、取向和交聯(lián)所形成的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，以求所得制品具有類似動物肌肉的纖維狀結(jié)構(gòu)。因此，定量表征植物蛋白所形成的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)就顯得非常重要。

然而，該網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的表征，是一個亟待解決的問題。利用擴散波譜技術(shù)（DWS）能在微米尺度上實時測量面團形成過程中三維結(jié)構(gòu)的變化[6]，而試驗結(jié)果主要通過散射光的相關(guān)函數(shù)，來獲取示蹤粒子在所研究體系中的均方差位移，再根據(jù)廣義Einstein-Stokes 公式，求取體系的流變參數(shù)[7]。由于在此過程中，用到不少近似和假設，同時，需要大量計算，且結(jié)果呈現(xiàn)不夠直觀，同時所得結(jié)果須用其它技術(shù)手段來驗證其可靠性。此外，固態(tài)植物蛋白制品具有高度透光性，因此，普通的光學方法無法觀察到三維介觀尺度下的圖像。電鏡技術(shù)需要很薄的切片，制樣難度大；同時樣品的前處理可能會影響樣品本身的形貌；作為典型軟物質(zhì)代表的食品體系，對電流強度非常敏感，長時間或強電流都會破壞樣品。原子力顯微鏡探針精度要求很高，振動速度限制了掃描速度，且表征范圍很小，只能觀察表面附近的圖像。光共聚焦技術(shù)可以觀察到2-維平面上蛋白纖維的分布[8]。受醫(yī)學核磁共振成像技術(shù)發(fā)展的啟發(fā)[9]，本研究探究利用2-維圖片，在計算機三維重構(gòu)技術(shù)的協(xié)助下再現(xiàn)植物蛋白制品中的三維網(wǎng)絡。

本研究以面筋蛋白形成的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)為標的，以面團為載體，通過三維重建技術(shù)，在一系列高度已知的二維照片的基礎上，利用計算機三維重建技術(shù)，研究面團中蛋白纖維在三維空間的分布。

1 材料與方法

1.1 樣品制備

使用商業(yè)小麥粉（Rosenmühle，550，德國）制備面團。每100 g 面粉含有（14.17±0.03）g 水分（AACCI 44-01），每100 g 干面粉含有（12.70±0.04）g 蛋白質(zhì)（AACCI 46-16，N×5.7）、每100 g 干面粉含有（0.63±0.01）g 灰分（ICC 104/1）、每100 g 面粉含有（28.75±0.81）g 濕面筋（AACCI 56-81）。根據(jù)AACCI 54-70.01，在粉質(zhì)儀（Perten Instruments，doughLAB，德國）中測量面團阻力和吸水率，來確定所需的揉制時間和添加比例。為了達到500 FU 的稠度，準確稱取50.1 g 面粉，加入29.6 g 蒸餾水，置于和面機（克萊美斯機電科技（深圳）有限公司，HA-3480AS，中國）中以63 r/min 的轉(zhuǎn)速攪拌揉和180 s，以備使用。

1.2 熒光顯微鏡下的顯微結(jié)構(gòu)分析

用羅丹明B 溶液（0.01 g/100 mL 水）代替5 mL 水對樣品進行染色。在和面機中揉制后，置于-20 ℃冰箱中過夜，用10%甲醛磷酸緩沖液固定好面團，固定6 h 以上，固定的標本經(jīng)4 個濃度梯度的（75%，85%，95%，100%）酒精和二甲苯脫水透明，用切片機（Leica，RM2235，德國）切成14 μm 薄片，用ZMN-7803 全自動組織包埋機（常州市華利電子有限責任公司，ZMN-7803，中國）做成石蠟切片，放在載玻片上，用目鏡（20）×物鏡（20）倍成像，綠光激發(fā)的熒光顯微鏡（Nexcope，NE910，美國）拍攝相片。為每個面團樣品拍攝10 張不同的圖像，每個面團樣品重復3 次。

1.3 數(shù)據(jù)集與試驗裝置

本試驗采用80 張小麥面團蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)切片圖像，圖像為TIFF 格式，試驗采用的CPU 為Intel（R）Core（TM）i7-10700 CPU 4.8Ghz，GPU 為NVIDIA GeForce GTX TitanX。通過3DMed 以實現(xiàn)對二維切片的三維重建。序列斷層圖像三維重建就是從一系列平行斷層圖像數(shù)據(jù)中恢復被重建對象原有的三維面貌。主要涉及斷層圖像的獲得、圖像層間插值、繪制、數(shù)據(jù)的壓縮[2]。

1.4 算法簡介

MarchingCubes（MC）[10]是三維重建基于面繪制的算法，核心是在三維離散數(shù)據(jù)場中通過線性差值逼近等值面。該算法中，將多個平行等間距二維切片數(shù)據(jù)看作一個三維的數(shù)據(jù)場。

體素一般定義為8 個領(lǐng)域點所包含的區(qū)域[11]。假設采樣點在3 個坐標軸（i，j，k）方向上是均勻分布的，以等間隔的間距采樣為△i、△j、△k，體數(shù)據(jù)就可以用三維數(shù)據(jù)的形式表現(xiàn)。將8 個采樣點當做立方體的8 個頂點，立方體區(qū)域就是1 個體素。體素模型如圖1 所示。體素的角點坐標分別為（i，j，k），...，（i+1，j+1，k+1）。

圖1 體素模型Fig.1 Voxel model

等值面提取是將二維切片數(shù)據(jù)中具有某種閾值的物質(zhì)提取出來，以某種連接方式構(gòu)成三角形面片[12]。通過對立方體8 個頂點的值進行三線性插值計算得到體素頂點的標量值f（x，y，z），將等值面值C 和標量值進行比較，以此判斷該頂點的位置。R 如果體素值大于等于等值面值，定義該頂點位于等值面外，標記為0，反之，則頂點在等值面之內(nèi)，標記為1，見公式（1）：

MC 算法通過對三維數(shù)據(jù)場中的每一個立方體的體素進行上述處理，將所有的三角形面片進行曲面擬合，最終形成三維立體圖。

1.5 重建過程

通過對原始數(shù)據(jù)進行預處理，得到分割之后的圖像，分割圖像的目的是為了減少背景因素的干擾和提高重建速度，使得重建后的模型準確性更高。對原始數(shù)據(jù)集進行一系列的預處理過程：灰度化、降噪、分割等操作，將目標區(qū)域從背景中提取出來[13]。

灰度化的主要目的是為了避免圖像條帶失真，灰度化之后的圖像只需要一個字節(jié)存放灰度值?；叶葓D像素通常采用像素8 位的非線性尺度保存，因此更易于編程[14]。圖像噪聲會對圖像分割等操作產(chǎn)生不良影響，為了最終模型的準確性，采用高斯濾波器對圖像進行平滑去噪[15]。通過圖像灰度級的不同，將目標以外的背景干擾因素除去，只保留目標區(qū)域，為三維重建過程做好基礎準備。

原始圖像集和圖像預處理過程如圖2 所示。閾值分割對重建后的模型影響非常大，閾值選取不當會對目標區(qū)域造成過分割現(xiàn)象，使得目標區(qū)域上的一些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被切割掉，后續(xù)提取有用信息將會造成誤差[16]。將處理好的圖像輸入到3DMed 軟件中，建立體數(shù)據(jù)，并生成網(wǎng)格數(shù)據(jù)，最后生成三維模型。

圖2 原始圖像集和圖像預處理過程：（a）原始圖像集，（b）灰度圖像集，（c）分割后的圖像Fig.2 Original image set and image preprocessing process：（a）original image set，（b）grayscale image set，（c）image segmentation

2 結(jié)果與分析

2.1 原始照片及處理

圖3 顯示的一組垂直方向保持不變而水平方向相差14 倍數(shù)微米差的圖像。圖像采用等間隔、小間距采樣方式，這對于三維重建至關(guān)重要，可以保證重建后的模型特征不丟失。圖中的尺度標志為200 μm，非常明顯看到蛋白面筋纖維在平面上的分布。

圖3 一組在垂直方向一樣的面團相片F(xiàn)ig.3 Pictures of dough with the same vertical orientation

圖4 是用Opencv 處理后得到的灰度圖像。在數(shù)字圖像處理中，灰度圖像中不同的目標以不同的灰階顯示，灰階范圍在0～255 之間?；叶葓D像的描述與彩色圖像一樣，反映了整幅圖像的整體和局部的色度和亮度等級的分布和特征，相較于彩色圖像，灰度圖像占用更少的維度，運算速度大幅度提高，并且最重要的梯度信息得以保留。將彩色圖像灰度化后，再根據(jù)灰度的不同，對圖像做閾值分割，可以得到蛋白面筋纖維的二值圖像。

圖4 Opencv 處理后所得的灰度圖像Fig.4 Grayscale image after Opencv processing

圖5 為在圖4 基礎上進行二值化處理得到的圖像。二值圖像分析在對象識別和特征匹配中具有重要作用，基于灰度的不同設定一個閾值，將圖像數(shù)據(jù)分為兩部分，大于此閾值的像素群置為白色，小于此閾值的像素群置為黑色，經(jīng)過二值化處理后，整幅圖像只剩下黑、白兩種顏色。二值化處理將重建目標以外的背景因素干擾去除，減少了三維重建過程所用時間。同時，二值圖像又保留了目標區(qū)域的結(jié)構(gòu)特征，確保了重建模型的準確性。

圖5 二值圖像Fig.5 Binary image

2.2 蛋白面筋纖維的粗細分布

通過上述操作，對80 張1024 px×800 px 間距為14 μm 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行三維重建，重建后的結(jié)果如圖6 所示。生成的模型基于MC 算法，模型內(nèi)部經(jīng)過投影，生成三角形面片，三角形面片擬合成曲面，將模型放大后，可以更加細致的觀察到內(nèi)部結(jié)構(gòu)如圖7 所示。

圖6 三維重建模型Fig.6 Three-dimensional reconstruction model

圖7 模型內(nèi)部圖Fig.7 Internal diagram of the model

該方法能提供以下關(guān)鍵性參數(shù)，纖維的密度和在空間的分布；纖維的長度；每根纖維的粗細。

本試驗所重建的小麥面粉團蛋白質(zhì)模型是基于微米級的三維重建，三維立體模型可以更直觀的從不同角度觀察到樣品特征（圖8），快速的提取出所需要的物理信息。

圖8 3 個相互垂直的方向上面筋蛋白纖維染色模型Fig.8 Gluten fiber staining model in three mutually perpendicular directions

根據(jù)圖7 和圖8，經(jīng)過測量換算，整個模型內(nèi)部面筋蛋白纖維的數(shù)量約3 000 個，纖維的粗細為2～14 μm（圖9a），長度為140～420 μm（圖9b）。

圖9 面筋蛋白纖維長度分布圖Fig.9 Distribution map of gluten protein fiber length

其中面筋蛋白纖維的粗細主要集中在較小的部分（〈7 μm），約50%面筋蛋白纖維的粗細在2 μm 左右，這和Don 等[5]利用激光共聚焦技術(shù)在2維平面上看得的結(jié)果有部分吻合。面團質(zhì)構(gòu)和這一參數(shù)的分布緊密相連。如果用虎克定律（彈簧拉伸）模型來簡化面筋蛋白纖維的機械拉伸賦予面團的機械性能[17]，因為彈簧的彈性系數(shù)式中，G——彈簧的切變模量（Pa）；d——彈簧鋼絲的直徑（mm）；DZ——彈簧中彈簧環(huán)的直徑（mm）；n——彈簧的環(huán)數(shù)[18]。因此，面團稠度和彈性可以近似用來估算，式中ni是直徑為di蛋白面筋纖維的空間濃度。同時面團機械性能還與G 有關(guān)。而G 可能和面團中的營養(yǎng)成分分布、各種化學鍵（如二硫鍵等用于構(gòu)建面團中的三位網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）在面團中的時空分布[19]、麥谷蛋白顆粒的變化[20]、水含量[21]、添加劑的種類和用量[22]等有關(guān)。

利用三維重構(gòu)技術(shù)，使得量化上述參變量以研究對面團機械性能的影響成為可能；同時能更精細化的描述面粉儲存等條件的影響。這些影響因素雖然在工業(yè)實踐中是非常明顯的，但其作用機制還存在巨大爭議[23]；同時這也為配粉等操作提供理論指導[24]。

2.3 面團中面筋蛋白纖維長度分布

面團中面筋蛋白纖維長度的分布如圖9b 所示，約45%的面筋蛋白纖維的長度在140～210 μm 之間；約30%的在210～280 μm，剩下約24%長度大于280 μm。這個長度的分布非常重要，因為它決定了面團中纖維所分割的空間大小。Li 等[6]利用擴散波譜技術(shù)（DWS）分析了面團在揉制的不同時間段下，這些空間的變化，發(fā)現(xiàn)這一變化規(guī)律能揭示面團中面筋蛋白三維網(wǎng)絡的發(fā)展，同時DWS 所得的蛋白面筋三維網(wǎng)絡中的空間大小和本試驗所得有一定的吻合。

2.4 存在的問題及解決策略

受算法的限制，目前還沒有考慮面筋蛋白纖維的彎曲和纏繞，這是導致目前試驗結(jié)果和DWS等技術(shù)手段所獲取的結(jié)果存在一定差異的原因。目前，本課題組正在改進算法，優(yōu)化重構(gòu)程序，以期能與其它試驗結(jié)果有更好的吻合度。如特征信息進行分類標記等技術(shù)的應用。

目前采用的熒光顯微鏡技術(shù)拍照片，位置控制和照片清晰度等存在很大的提升空間。后期將利用激光共聚焦技術(shù)，以期得到質(zhì)量更好的照片（位置控制、分辨率、相片的清晰度等）。

3 結(jié)論

利用三維重構(gòu)技術(shù)，可以了解面筋蛋白中纖維的數(shù)量、大小，及其在空間中的分布。然而目前所得的僅僅是初步結(jié)果，驗證計算機三維重構(gòu)在面團中再現(xiàn)面筋蛋白纖維的可能性，且存在不少局限性：如二維平面上蛋白纖維截點之間的連接存在較大的任意性，需要進一步優(yōu)化算法；同時，該結(jié)果還需用擴散波譜等技術(shù)證明該方法的可靠性。