張悅，蔣 檸，鄭硯學(xué)，顧 悅，王 艷，賀銀鳳*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010018 2 內(nèi)蒙古自治區(qū)質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化研究院 呼和浩特 010070）

發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）是一種主要定植于動(dòng)物腸道中的異型發(fā)酵乳酸菌[1]，能調(diào)節(jié)天然免疫與適應(yīng)性免疫[2]，具有抗炎癥和降膽固醇等作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌不僅可以在發(fā)酵駝乳時(shí)產(chǎn)生天然新型抗氧化肽[4]，在發(fā)酵過(guò)程中，還可以代替發(fā)酵香腸中亞硝酸鹽，降低亞硝酸鹽在香腸中的殘留風(fēng)險(xiǎn)。此外，該菌株通過(guò)防止脂肪氧化、蛋白質(zhì)分解、肌紅蛋白氧化和提高游離氨基酸含量，有效提高香腸的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5]。然而，發(fā)酵乳桿菌在人類(lèi)的腸道[6]或者在用于食物發(fā)酵時(shí)經(jīng)常受到不同的脅迫[7]，因此，增強(qiáng)其抗逆性變得非常關(guān)鍵。

基因組學(xué)時(shí)代徹底改變了人們對(duì)所有生物基因的理解。這個(gè)時(shí)代起源于1995 年，Craig Venter和他的同事發(fā)表第1 個(gè)活的有機(jī)體的完整基因組序列——革蘭氏陰性細(xì)菌流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）。當(dāng)時(shí)的基因組序列計(jì)劃，包括人類(lèi)基因組計(jì)劃，都是利用定向測(cè)序的方法，即以有序的方式對(duì)基因組的已繪制區(qū)域進(jìn)行單獨(dú)測(cè)序。Venter 等研究表明，一種鳥(niǎo)槍式測(cè)序方法，即構(gòu)建整個(gè)隨機(jī)剪切的基因組鳥(niǎo)槍庫(kù)，并使用序列支架組裝它們的序列，可以更快地完成這一任務(wù)，并改變基因組序列計(jì)劃的方向[8]。目前在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/?term=Lactobacillaceae）數(shù)據(jù)庫(kù)中上傳的乳酸桿菌（Lactobacillaceae）全基因組共有5 726 組，其中植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）有792 組，德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）有419 組，羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）有328 組，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）有230 組，而發(fā)酵乳桿菌只有107 組。對(duì)發(fā)酵乳桿菌全基因組的測(cè)定遠(yuǎn)少于其它乳酸桿菌，這不利于其優(yōu)異特性及相關(guān)作用機(jī)制的研究。本文研究1 株高產(chǎn)生物膜發(fā)酵乳桿菌的益生和抗逆特性，采用全基因組測(cè)序技術(shù)分析該菌株的抗性機(jī)理，為后續(xù)提高其應(yīng)對(duì)不良環(huán)境能力的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 試驗(yàn)菌株為前期分離篩選的1 株高產(chǎn)生物膜發(fā)酵乳桿菌733（Lactobacillus fermentum 733），由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)提供。

1.1.2 試劑 MRS 肉湯培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶，美國(guó)Sigma公司；L-鳥(niǎo)氨酸、L-精氨酸、L-賴(lài)氨酸，北京酷來(lái)搏科技有限公司；蛋白胨水培養(yǎng)基、吲哚、硝酸鹽培養(yǎng)基、碘化鉀溶液、淀粉溶液，北京博邁德生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試菌液的制備 將菌株活化二代，取5 mL 菌懸液離心（4 000 r/min，4 min），棄上清，吸取5 mL 生理鹽水吹打混勻，洗滌并離心，重復(fù)3 次。用紫外分光光度計(jì)調(diào)整菌懸液OD595nm值在1.0，即供試菌液[9]。

1.2.2 發(fā)酵乳桿菌733 生長(zhǎng)量與生物膜生成量的測(cè)定 取1.2.1 節(jié)制得的供試菌液接入新鮮MRS中，接種比例為2%（體積分?jǐn)?shù)），培養(yǎng)25 h，分別在4，7，10，13，16，19，22 h 和25 h 測(cè)定菌株生長(zhǎng)量和生物膜生成量[10]。

1.2.3 發(fā)酵乳桿菌733 對(duì)人工胃腸液耐受性的測(cè)定 參考鐘華晨等[11]的方法配制人工胃腸液，測(cè)定發(fā)酵乳桿菌733 對(duì)人工胃腸液的耐受性[12]。

1.2.4 發(fā)酵乳桿菌733 有害代謝產(chǎn)物的測(cè)定 參考魏朝治等[13]的方法對(duì)菌株進(jìn)行吲哚、硝酸鹽還原和氨基酸脫羧酶試驗(yàn)。

1.2.5 發(fā)酵乳桿菌733 抗逆性的測(cè)定

1.2.5.1 發(fā)酵乳桿菌733 對(duì)酸脅迫耐受能力的測(cè)定 將1.2.1 節(jié)制備的供試菌液分別接入pH 2.5，3.5，4.5，5.5，6.5（對(duì)照）的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，對(duì)處理的菌株進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.5.2 發(fā)酵乳桿菌733 對(duì)膽鹽脅迫耐受能力的測(cè)定 將1.2.1 節(jié)制備的供試菌液分別接入膽鹽質(zhì)量濃度為0（對(duì)照），1，2 g/L 和3 g/L 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，對(duì)處理后的菌株進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.5.3 發(fā)酵乳桿菌733 對(duì)溫度脅迫耐受能力的測(cè)定 將1.2.1 節(jié)制備的供試菌液分別接入新鮮的MRS 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度分別設(shè)為4，10，37（對(duì)照），45，55 ℃和70 ℃，培養(yǎng)24 h，對(duì)處理后的菌株進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.5.4 發(fā)酵乳桿菌733 對(duì)鹽脅迫耐受能力的測(cè)定 將1.2.1 節(jié)制備的供試菌液分別接入NaCl 質(zhì)量濃度為0（對(duì)照），15，30，45 g/L 和60 g/L 的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，對(duì)處理后的菌株進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.6 微生物全基因組測(cè)序 提取發(fā)酵乳桿菌733 的DNA，對(duì)其濃度、純度、樣品總量以及樣品完整性進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)DNA 質(zhì)檢合格，即質(zhì)量濃度≥50 ng/μL，OD260nm/280nm1.8～2.0，OD260nm/230nm2.0～2.2，單次建庫(kù)總量≥5 μg，主帶清晰且≥23 kB，無(wú)降解且無(wú)RNA 污染，方可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

樣品檢測(cè)合格后，進(jìn)構(gòu)建文庫(kù)，質(zhì)檢合格后上機(jī)測(cè)序。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 每組試驗(yàn)重復(fù)至少3 次，每次設(shè)置3 組平行對(duì)照，用SPSS 19.0 和Origin 2021進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。所有數(shù)值用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示，P〈0.05 表示差異顯著。

使用Qubit 3.0 對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行定量；使用Agilent 2100 對(duì)文庫(kù)大小進(jìn)行檢測(cè)；SMRT LINK 8.0 軟件對(duì)下機(jī)文庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并采用pb_assembly_microbial（from smrtlink10）、hifiasm 軟件和Canu（v2.2）軟件對(duì)純?nèi)鷶?shù)據(jù)進(jìn)行組裝；Glimmer（v3.02）尋找發(fā)酵乳桿菌733 的編碼基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳桿菌733 生長(zhǎng)量與生物膜形成量

對(duì)發(fā)酵乳桿菌733 生長(zhǎng)量以及生物膜生成量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 發(fā)酵乳桿菌733 生長(zhǎng)量與生物膜形成量Fig.1 The growth and biofilm formation of L.fermentum 733

由圖1 可知，發(fā)酵乳桿菌733 生長(zhǎng)量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加呈先上升后持續(xù)平穩(wěn)狀態(tài)，而生物膜生長(zhǎng)量隨時(shí)間的增加呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，符合生物膜形成的規(guī)律。生物膜的形成是積累的過(guò)程，25 h 時(shí)生物膜形成量最多，為0.527±0.111。往期研究中將生物膜生成量高于0.500 判定為高產(chǎn)生物膜，因此發(fā)酵乳桿菌733 為高產(chǎn)生物膜乳酸菌。

2.2 發(fā)酵乳桿菌733 對(duì)模擬人工胃腸液耐受性及有害代謝產(chǎn)物試驗(yàn)結(jié)果

發(fā)酵乳桿菌733 對(duì)模擬人工胃腸液耐受以及有害代謝產(chǎn)物分泌情況見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵乳桿菌733 在模擬人工胃腸液中存活率及有害代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)結(jié)果Table 1 The survival of L.fermentum 733 in simulated artificial gastric/intestinal fluid and evaluation results of harmful metabolites

測(cè)定發(fā)酵乳桿菌733 耐受模擬人工胃腸液的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在模擬人工胃腸液中培養(yǎng)3 h，發(fā)酵乳桿菌733 存活率分別為（98.1±0.5）%和（98.1±1.2）%，具有較高活菌數(shù)。說(shuō)明高產(chǎn)生物膜發(fā)酵乳桿菌733 可以耐受人工胃腸液，并保持較好活力。

鑒于一些益生菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)分泌一些有毒的代謝物質(zhì)，可能導(dǎo)致類(lèi)似嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)的癥狀[14]，本試驗(yàn)評(píng)估了發(fā)酵乳桿菌733 是否存在產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物。該菌株有害代謝產(chǎn)物結(jié)果均為陰性，說(shuō)明其不產(chǎn)生可分解體內(nèi)色氨酸的色氨酸酶，且代謝產(chǎn)物中不含使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的硝酸鹽還原酶，或者能夠分解氨基酸形成胺類(lèi)物質(zhì)的氨基酸脫羧酶。

綜上所述，發(fā)酵乳桿菌733 可以耐受胃腸道環(huán)境且不會(huì)分泌有害代謝產(chǎn)物，是具有潛在益生特性的乳酸菌。

2.3 發(fā)酵乳桿菌733 抗逆性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)發(fā)酵乳桿菌733 耐酸、膽鹽、溫度、鹽以及冷凍脅迫能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 不同環(huán)境脅迫下發(fā)酵乳桿菌733 存活情況Fig.2 The survival of L.fermentum 733 under different environmental stresses

觀察圖2a 可以發(fā)現(xiàn)，在酸脅迫時(shí)，隨著pH 值的上升，發(fā)酵乳桿菌733 活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)；pH 2.5 時(shí)菌株活菌數(shù)最低，說(shuō)明強(qiáng)酸環(huán)境抑制菌株的生長(zhǎng)。

膽鹽脅迫時(shí)（圖2b），隨著膽鹽濃度的增加，發(fā)酵乳桿菌733 活菌數(shù)呈先下降后輕微上升再下降的趨勢(shì)；當(dāng)膽鹽質(zhì)量濃度為2 g/L 時(shí)，菌株活菌數(shù)顯著高于1 g/L 和3 g/L，這可能是由于膽鹽的存在，刺激發(fā)酵乳桿菌733 生物膜的形成，使其大量分泌胞外多糖和蛋白質(zhì)，在菌株細(xì)胞表面形成保護(hù)層，屏蔽膽鹽，同時(shí)生物膜的存在可能介導(dǎo)物質(zhì)交換及營(yíng)養(yǎng)供給，從而提高菌株存活率[15]。當(dāng)膽鹽質(zhì)量濃度為3 g/L 時(shí)，菌株活菌數(shù)顯著降低，說(shuō)明膽鹽對(duì)生物膜的刺激作用有限，超出閾值后會(huì)嚴(yán)重抑制菌株的生長(zhǎng)。

溫度脅迫（圖2c）時(shí)，菌株活菌數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)。低溫脅迫會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)，在4 ℃和10 ℃培養(yǎng)24 h 后，兩組活菌數(shù)無(wú)顯著差異；與對(duì)照組37 ℃相比，45，55 ℃和70 ℃培養(yǎng)均抑制菌株的生長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)溫度70 ℃時(shí)，菌株全部死亡；當(dāng)培養(yǎng)溫度為45 ℃時(shí)，除對(duì)照組外，菌株活菌數(shù)顯著高于其它菌株。該試驗(yàn)結(jié)果與Haddaji 等[16]的結(jié)果一致，推測(cè)其作用機(jī)理可能是由于在熱應(yīng)激下生長(zhǎng)的發(fā)酵乳桿菌733 具有飽和脂肪酸和直鏈脂肪酸，它們可以適當(dāng)提供膜功能所需的流動(dòng)性，從而提高菌株對(duì)高溫脅迫的耐受能力。

鹽脅迫（圖2d）時(shí)，隨著NaCl 質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵乳桿菌733 活菌數(shù)變化規(guī)律與膽鹽脅迫時(shí)相似，當(dāng)NaCl 質(zhì)量濃度為30 g/L 時(shí)，菌株活菌數(shù)降到最低值，而當(dāng)NaCl 質(zhì)量濃度為45 g/L 時(shí)，菌株活菌數(shù)顯著上升，且除對(duì)照組外，此濃度下發(fā)酵乳桿菌733 活菌數(shù)最高，這可能是由于高滲透性介質(zhì)中生長(zhǎng)時(shí)，菌株可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的滲透性以維持細(xì)胞伸長(zhǎng)所必需的膨壓。由于高滲環(huán)境導(dǎo)致菌株的休克，會(huì)激活某些特定的機(jī)制（例如，K+或兼容的溶質(zhì)攝取/合成），防止細(xì)胞在含有高濃度鹽的介質(zhì)中死亡，如嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌，產(chǎn)生保護(hù)分子（主要是蛋白質(zhì)），如DnaK 和HtrS操縱子蛋白，保護(hù)細(xì)胞免受鹽誘導(dǎo)的損傷[17]。

綜上所述，環(huán)境脅迫對(duì)發(fā)酵乳桿菌的生長(zhǎng)有一定抑制作用，然而在一些條件下，環(huán)境脅迫會(huì)刺激菌株作出應(yīng)激響應(yīng)來(lái)保證菌株活力，超過(guò)一定閾值后，這些應(yīng)激響應(yīng)無(wú)法繼續(xù)發(fā)揮作用，菌株生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響。

為探究高產(chǎn)生物膜發(fā)酵乳桿菌733 抗逆性的作用機(jī)制，對(duì)其全基因組進(jìn)行測(cè)序。

2.4 發(fā)酵乳桿菌733 全基因組測(cè)序分析

2.4.1 基因組組裝與預(yù)測(cè) 由HiseqX-Ten 下PE150 模式對(duì)發(fā)酵乳桿菌733 進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)量為521 250，處理后的總序列長(zhǎng)度為3 092 416 389 bp，平均序列長(zhǎng)度為5 932.69 bp，N50 長(zhǎng)度為7 810 bp。對(duì)三代數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，并對(duì)組裝序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 最終組裝結(jié)果序列和編碼基因預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)表Table 2 Table of the sequence statistics of the final assembly results and statistical statistics of coding genes

由表2 可知，發(fā)酵乳桿菌733 基因組為環(huán)狀分子，序列總長(zhǎng)度為2 146 209 bp，平均GC 含量為51.55%，腺嘌呤含量為24.50%，胸腺嘧啶含量為23.95%，鳥(niǎo)嘌呤含量為25.91%，胞嘧啶含量為25.64%，不確定堿基為0。同時(shí)獲得編碼基因2 151個(gè)，總長(zhǎng)度1 852 353 bp，平均長(zhǎng)度861.16 bp，占基因組大小的86.31%，GC 含量為52.76%。

2.4.2 基因組圈圖分析 基因組圈圖能夠完整地顯示基因在正、反鏈上的分布、COG 功能分類(lèi)、GC含量、基因組島和同源基因等。通過(guò)一幅完整的基因組圖譜，將多種不同的資訊進(jìn)行整合（此處表示GC 含量、GC 偏差、tRNA/rRNA、COG 注釋、堿基修飾及限制修飾體系有關(guān)的酶類(lèi)），可以更全面、直觀地了解該菌的基因特性。發(fā)酵乳桿菌733 的基因組圈圖例見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵乳桿菌733 基因組圈圖Fig.3 The circle map of L.fermentum 733 genome

最外層的一圈表示基因組大小，表明發(fā)酵乳桿菌733 基因組是一個(gè)環(huán)形的分子，全長(zhǎng)2 146 209 bp；第二和第三圈是正鏈和負(fù)鏈上的基因，其不同的色彩表示作用不同。COG 數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)基因功能分為25 類(lèi)。由圖3 可知，A、B 和Y類(lèi)，即RNA 加工與修飾、染色體結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)在發(fā)酵乳桿菌733 中未檢出，胞外結(jié)構(gòu)與細(xì)胞骨架基因檢出數(shù)量也很少，可能是由于發(fā)酵乳桿菌733 為原核生物，缺乏真正的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，且原核生物染色體結(jié)構(gòu)和胞外結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，因此相關(guān)基因較少[18]。其余21 類(lèi)中，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生、氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、動(dòng)員組：噬菌體原，轉(zhuǎn)座子和僅一般功能預(yù)測(cè)基因數(shù)目位居前4，分別為188，185，179 和167；剩余類(lèi)中，基因數(shù)目超過(guò)100 以上的有6 類(lèi)，其余類(lèi)型數(shù)量在10～100 之間，說(shuō)明發(fā)酵乳桿菌733 基因組中，不同類(lèi)型的基因具有不同的拷貝數(shù)，這與其執(zhí)行任務(wù)的復(fù)雜性有關(guān)，也反映隨時(shí)間的推移而進(jìn)化的生物靈活性；第4 圈為tRNA 和rRNA，發(fā)酵乳桿菌733基因組中有58 個(gè)tRNA，15 個(gè)rRNA，分別由5 個(gè)5S rRNA、5 個(gè)16S rRNA 和5 個(gè)23S rRNA 組成；第5 圈是GC-skew 值，即G-C/G+C，從生物學(xué)角度來(lái)說(shuō)，這個(gè)數(shù)值為正時(shí)，正鏈更容易轉(zhuǎn)錄CDS，為負(fù)值時(shí)則相反；第6 圈為GC 含量，向外的部分表示該區(qū)域GC 含量高于全基因組平均GC含量，峰值越高表示與平均GC 含量差值越大，反之則亦然，發(fā)酵乳桿菌733 基因組平均GC 含量為52.76%。

2.4.3 基因組的功能注釋 對(duì)預(yù)測(cè)得到的編碼基因進(jìn)行蛋白序列注釋?zhuān)〝?shù)據(jù)庫(kù)為NR、SwissProt、COG、GO 和KEGG），所得注釋結(jié)果如圖4 所示。

圖4 基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)共有和特有注釋分析統(tǒng)計(jì)圖Fig.4 Statistical map of the common and specific annotation analysis of the basic database

由圖4 可知，在NR 數(shù)據(jù)庫(kù)比到2 129 個(gè)基因，在SwissProt 數(shù)據(jù)庫(kù)比到1 571 個(gè)基因，在COG 數(shù)據(jù)庫(kù)比到1 817 個(gè)基因，在GO 數(shù)據(jù)庫(kù)比到1 529 個(gè)基因，在KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)比到1 237 個(gè)基因。下面對(duì)GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋情況進(jìn)行介紹。

在GO 數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋情況如圖5 所示。GO 數(shù)據(jù)庫(kù)將蛋白序列分為三大類(lèi)：生物過(guò)程BP、細(xì)胞組分CC 和分子功能MF，其中與BP 相關(guān)的基因種類(lèi)和數(shù)量最多，其次是MF，與CC 相關(guān)的基因種類(lèi)和數(shù)量最少。與BP 相關(guān)的基因共25 種，其中基因數(shù)目最多的是細(xì)胞過(guò)程類(lèi)的基因，數(shù)量多達(dá)992 條，其次是代謝過(guò)程類(lèi)的基因，數(shù)量也多達(dá)931 條。其余數(shù)量較多的還有應(yīng)激反應(yīng)和生物調(diào)節(jié)類(lèi)的基因，數(shù)量均為151 條；生物過(guò)程調(diào)節(jié)類(lèi)，有137 條。與MF 相關(guān)的基因共13 種，其中催化活性類(lèi)基因，數(shù)量多達(dá)965 條，其次是附著類(lèi)的基因916 條。CC 相關(guān)的基因共有3 種，其中數(shù)量最多的是細(xì)胞結(jié)構(gòu)體類(lèi)的基因，有884 條基因。從圖5 還可看出，這些基因的作用涵蓋了細(xì)胞新陳代謝的每個(gè)部分，而各基因具有不同的強(qiáng)度，表明細(xì)胞中不同生命進(jìn)程的強(qiáng)度存在差異。

圖5 GO Level2 分類(lèi)水平注釋分布圖Fig.5 Distribution diagram of the GO Level2 classification-level annotation

在KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋情況如圖6 所示。發(fā)酵乳桿菌733 編碼基因在KEGG 功能注釋中共分為6 大類(lèi)，分別為代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程、生物體系統(tǒng)和人類(lèi)疾病，共有1 064 個(gè)基因38 個(gè)通路得到功能注釋?zhuān)唧w結(jié)果如圖6 所示。

圖6 KEGG 層級(jí)二注釋結(jié)果分類(lèi)統(tǒng)計(jì)圖Fig.6 Classification statistical map of KEGG hierarchical secondary annotation results

發(fā)酵乳桿菌733 在代謝途徑層面特別是氨基酸代謝和碳水化合物代謝得到較多的基因功能注釋。其中669 個(gè)基因在代謝通路上得到注釋?zhuān)糑EGG 中全部注釋基因的62.88%。11 個(gè)代謝通路中，與多聚糖的生物合成和代謝通路有關(guān)的基因有37 個(gè)，脂質(zhì)代謝有關(guān)基因45 個(gè)，核苷酸代謝有關(guān)的基因有75 個(gè)。107 個(gè)基因在環(huán)境信息處理層面得到注釋?zhuān)渲信c膜運(yùn)輸有關(guān)的基因?yàn)?4 個(gè)，與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的基因53 個(gè)。

2.4.4 基于全基因組技術(shù)探究發(fā)酵乳桿菌733 抗逆性作用機(jī)制 前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌733 對(duì)不良環(huán)境有一定耐受能力，因此通過(guò)全基因組技術(shù)對(duì)其抗性機(jī)制進(jìn)行探究。通過(guò)檢索KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌733 在環(huán)境脅迫時(shí)主要涉及以下基因的變化：trxA（orf00555，K03671）、perR（orf01604，K09825）、ctsR（orf1791，K03708）和argG（orf01908，K01940）。

研究發(fā)現(xiàn)，Trx 系統(tǒng)在許多生物中高度保守，由硫氧還蛋白還原酶（TrxR）、NADPH（還原型煙酰腺嘌呤二核苷磷酸）和Trx（硫氧還蛋白）組成[19]，是一類(lèi)廣泛存在于原核和真核生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)，具有維持細(xì)胞內(nèi)硫醇基團(tuán)的還原狀態(tài)，參與廣泛的細(xì)胞過(guò)程，包括核苷酸還原、硫同化、氧化應(yīng)激反應(yīng)和砷鹽解毒。對(duì)乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中trxA 和trxD 基因進(jìn)行敲除后發(fā)現(xiàn)這兩種硫氧還蛋白在乳酸乳球菌中具有不同的抗逆功能。TrxA 參與菌株對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)，而TrxD 表現(xiàn)出對(duì)砷酸鹽和碲酸鹽的抗性起重要作用，具體機(jī)制尚不明確[20]。

PerR，屬于Fur 家族（是一種控制鐵載體和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的鐵敏感性阻遏蛋白），其功能主要是細(xì)胞的氧化應(yīng)激應(yīng)答，同時(shí)也能維持細(xì)胞內(nèi)金屬離子的穩(wěn)態(tài)。PerR 包含兩個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)，研究表明其中一個(gè)位點(diǎn)上的Zn2+可以被激活并與DNA 結(jié)合，通過(guò)Fe2+或Mn2+作為輔阻遏物可以產(chǎn)生兩種形式的perR，分別為PerR：Zn，F(xiàn)e 或PerR：Zn，Mn。因此大部分PerR 的調(diào)節(jié)基因會(huì)在細(xì)胞處于低水平H2O2或同時(shí)缺乏鐵和錳的情況下發(fā)生阻遏效應(yīng)[21]。

乳酸菌中，受CtsR 抑制因子調(diào)控的III 類(lèi)基因保守性不高。這表明CtsR 是一種廣泛的轉(zhuǎn)錄抑制因子，參與革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的熱休克調(diào)節(jié)，因此它被認(rèn)為是細(xì)胞蛋白質(zhì)質(zhì)量的主要調(diào)節(jié)者，并控制與蛋白穩(wěn)態(tài)有關(guān)的基因表達(dá)[22]。對(duì)植物乳桿菌WCFS1 中hrcA 和ctsR 基因分別敲除后發(fā)現(xiàn)，hrcA 和ctsR 基因的單一突變導(dǎo)致與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、初級(jí)代謝、運(yùn)輸、結(jié)合和不同化合物的生物合成相關(guān)的不同基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化[23]。HrcA 和ctsR的缺失表明受壓力相關(guān)調(diào)控基因影響的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的串?dāng)_的復(fù)雜性[24]。

精氨酸代謝[25]及精氨酸脫亞胺酶途徑[26]的調(diào)節(jié)作為酸脅迫響應(yīng)在乳酸菌中被廣泛報(bào)道。精氨酰琥珀酸合成酶（ASS）由argG 基因編碼，可以催化瓜氨酸、天冬氨酸和ATP 產(chǎn)生精氨酰琥珀酸，是精氨酸合成和尿素循環(huán)的限速酶[27]。精氨酰琥珀酸裂解酶由argH 基因編碼，可以催化精氨酰琥珀酸產(chǎn)生精氨酸[28]，是尿素循環(huán)相關(guān)的重要酶，兩個(gè)蛋白的合成均受到ArgR 蛋白的調(diào)控[29]。研究發(fā)現(xiàn)，argG[30]和argH[31]基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)上調(diào)與干酪乳桿菌的酸脅迫響應(yīng)有關(guān)。據(jù)報(bào)道，DNA 結(jié)合蛋白ArgR 在大腸桿菌（Escherichia coli）[32]、芽孢桿菌（Bacillus）[33]以及乳酸菌的精氨酸代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用[34]。

綜上所述，發(fā)酵乳桿菌733 在經(jīng)歷不同環(huán)境脅迫時(shí)，主要會(huì)對(duì)trxA、perR、ctsR 和argR 基因產(chǎn)生影響，然而這些基因通過(guò)哪些作用方式調(diào)控菌株抗逆性還有待研究。

3 結(jié)論

高產(chǎn)生物膜發(fā)酵乳桿菌733 在模擬人工胃腸液中有較高的存活率且不分泌有害代謝產(chǎn)物，是1 株具有潛在益生特性的乳酸菌。菌株在酸、膽鹽、溫度和鹽脅迫環(huán)境中生長(zhǎng)受到抑制。通過(guò)對(duì)其全基因組測(cè)序得出發(fā)酵乳桿菌733 基因組經(jīng)組裝后長(zhǎng)度為2 146 209 bp，GC 含量為52.76%，共2 151 個(gè)編碼基因，基因組中包含5 個(gè)5S 的rRNA，58 個(gè)tRNA。在KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中共注釋到4 個(gè)與脅迫密切相關(guān)的基因，分別為trxA、perR、ctsR 和argG。