王倩倩，杜 鵑，馮鳳琴*

（1 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州310058 2 杭州康源食品科技有限公司 杭州 310003）

一般情況下，體內(nèi)的自由基（細胞代謝的中間產(chǎn)物）是不斷產(chǎn)生的，以維持活性氧正常的代謝平衡[1-2]。然而，過多的自由基會攻擊細胞的不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)，引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 等大分子的氧化，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。大量研究表明：癌癥、阿爾茨海默癥、2 型糖尿病和心血管疾病等慢性疾病都與體內(nèi)活性氧含量的增加有關(guān)[3-4]。因此，有必要尋求能夠維持體內(nèi)自由基代謝平衡的外源性抗氧化劑來改善人體生理機能，從而達到預(yù)防慢性疾病的目的。目前，通過蛋白水解從食物蛋白制備的生物活性肽包括谷物類[5]、蔬菜類[6]、蛋類[7]、堅果類[8]、奶類[9]、魚類[10]等被證明具有顯著的抗氧化活性。與化學(xué)合成的抗氧化化合物相比，食物來源的抗氧化肽無不良副作用。另外，抗氧化肽不僅在體外和細胞模型中具有清除自由基和脂質(zhì)氧化抑制的活性，而且還可改善活性氧介導(dǎo)的包括小鼠和果蠅在內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷[11-12]。

海參（Holothurians），棘皮動物門海參綱動物，可能早在寒武紀時期就出現(xiàn)了。在世界范圍內(nèi)已知約有50 種海參可被食用，其中以海參、刺參和梅花參為主要屬。自古以來，海參因具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗凝血、抗疲勞和抗衰老等促進健康的功效而用于醫(yī)藥行業(yè)[13-14]。海參體壁中含有豐富的蛋白質(zhì)（約80%～90%），是制作海參肽的良好來源，且已被證明具有良好的體外和體內(nèi)抗氧化活性[15-16]。目前關(guān)于海參肽的研究主要集中在制備工藝、分離純化及生物活性等方面，而有關(guān)加工、儲藏條件對其活性的影響研究較少[17-18]。本文通過研究不同水解度海參肽（SCP-L 和SCP-H）在不同環(huán)境因素（溫度、pH、食品配料、金屬離子、模擬胃腸液消化）條件下對海參肽抗氧化穩(wěn)定性的影響，評估其對H2O2誘導(dǎo)L929 細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用，以期為海參肽的實際應(yīng)用提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同水解度的海參肽（低水解度DH=27.73%，SCP-L；高水解度DH=33.57%，SCP-H）由杭州康源食品科技有限公司提供。

小鼠成纖維細胞L929 購于中科院上海細胞庫，培養(yǎng)基為含有胎牛血清（10%）和雙抗（1%）的RPMI1640，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2。

胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基、雙抗、0.25%胰酶，上海源培生物科技股份有限公司；LDH、SOD、GSH-Px和MDA試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S 電子分析天平、PB-10 pH 計，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；Infinite M200 Pro 酶標儀，瑞士帝肯集團公司；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；HC-3018R 高速冷凍離心機，安徽中佳科學(xué)儀器有限公司；MCO-170AICUVDL-PC CO2細胞培養(yǎng)箱，日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社。

1.3 試驗方法

1.3.1 體外抗氧化活性

1）DPPH 自由基清除率[19]在離心管中依次加入200 μL 海參肽溶液（5，10，15，20，25，30 mg/mL）和400 μL DPPH 溶液（0.05 mmol/L），混勻后置于室溫下避光反應(yīng)0.5 h，于517 nm 波長處測定其吸光值。同時做樣品對照和空白對照，并通過公式（1）計算：

2）羥自由基清除率[20]在離心管中依次加入200 μL 硫酸亞鐵溶液（9 mmol/L）、200 μL 水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L）、200 μL 海參肽溶液（5，10，15，20，25，30 mg/mL）和200 μL H2O2（0.03%），混勻后置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)0.5 h，于510 nm波長處測定其吸光值。同時做樣品對照和空白對照，并通過公式（2）計算：

3）ABTS 自由基清除率[21]0.5 mL ABTS 溶液（7 mmol/L）與0.5 mL K2S2O8（2.45 mmol/L）混合均勻，室溫避光保存16 h 后使用。然后用蒸餾水稀釋至734 nm 波長處吸光度為0.7±0.02。取100 μL 的海參肽溶液（5，10，15，20，25，30 mg/mL）與100 μL 的ABTS 工作液混勻，避光反應(yīng)10 min，于734 nm 波長處測定吸光度。同時做空白對照，并通過公式（3）計算：

1.3.2 環(huán)境穩(wěn)定性

1）溫度 將海參肽溶液（15 mg/mL）分別置于20，40，60，80，100 ℃的水浴鍋中水浴1 h，冷卻至室溫后，測定其·OH 清除率。

2）pH 分別用鹽酸和氫氧化鈉將海參肽溶液（15 mg/mL）的pH 值調(diào)節(jié)至3，5，7，9，11，在室溫下放置1 h，測定其·OH 清除率。

3）食品配料 在海參肽溶液（15 mg/mL）中分別添加5%的氯化鈉、葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖，在室溫下放置1 h，測定其·OH 清除率。

4）金屬離子 在海參肽溶液（15 mg/mL）中分別添 加500 μg/mL 的KCl，CaCl2，MgCl2，ZnCl2和CuCl2，在室溫下放置1 h，測定其·OH 清除率。

5）胃腸道蛋白酶[22]胃消化階段：將海參肽按照1∶10（g/mL）的比例加入到胃蛋白酶液中，置于37 ℃水浴鍋中模擬胃消化1 h。滅酶后冷凍干燥以獲得模擬胃消化階段的海參肽。胃腸消化階段：將胃消化階段的海參肽滅酶后，用NaHCO3（0.9 mol/L）溶液將pH 值提高到5.3，并進一步用氫氧化鈉（1 mol/L）將pH 值調(diào)節(jié)至6.8，然后同樣按照1∶10（g/mL）的比例加入到胰蛋白酶液中，并將混合物置于37 ℃中模擬腸消化2 h。消化完成后將混合液置于沸水浴中加熱10 min 以滅酶活，然后將其冷凍干燥以獲得模擬胃腸消化的海參肽。最后將獲得胃和胃腸消化階段的海參肽配制成質(zhì)量濃度為15 mg/mL 的溶液，分別測定其·OH清除率。

1.3.3 海參肽對L929 細胞損傷的保護作用

1.3.3.1 海參肽對L929 細胞生長的影響 參照王倩倩等[23]的方法培養(yǎng)L929 細胞，并計算細胞的存活率。其中海參肽的質(zhì)量濃度分別為0，0.2，0.4，0.8，1.6 mg/mL。

1.3.3.2 海參肽對L929 細胞損傷的保護作用 參照王倩倩等[23]的方法培養(yǎng)L929 細胞，構(gòu)建H2O2誘導(dǎo)細胞氧化損傷模型，并計算細胞的存活率。其中海參肽的質(zhì)量濃度 分別為0，0.2，0.4，0.6，0.8 mg/mL。

1.3.3.3 抗氧化指標測定 將細胞按照1×105個/孔的密度接種到6 孔板中，然后按照1.3.3.2 節(jié)描述的步驟處理后，收集細胞和培養(yǎng)液。分別測定上清液中LDH 活力和細胞內(nèi)SOD 活力、GSH-Px 活力和MDA 含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 進行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果表示為“平均值±標準差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化穩(wěn)定性

2.1.1 體外抗氧化方法和海參肽濃度篩選 為了篩選出海參肽的體外抗氧化效果最優(yōu)的評價方法和最佳質(zhì)量濃度，比較了3 種體外化學(xué)評價方法，分析了不同質(zhì)量濃度的影響。由圖1 可知，當質(zhì)量濃度在5～30 mg/mL 范圍內(nèi)時，SCP-L 和SCP-H的上述3 種體外抗氧化能力均隨著質(zhì)量濃度的增加而增加。在3 種體外抗氧化評價方法中，SCPL 的半抑制質(zhì)量濃度分別為56.48，19.58，11.58 mg/mL，SCP-H 的半抑制質(zhì)量濃度分別為46.97，18.40，9.89 mg/mL，得出海參肽對羥自由基清除能力效果最好，故選擇該試驗方法作為后續(xù)評價不同環(huán)境因素對海參肽氧化穩(wěn)定性影響的評價指標。就該方法而言，海參肽質(zhì)量濃度在5～15 mg/mL 范圍內(nèi)時，羥自由基清除率有較大變化，在15 mg/mL 時，分別達到了67.83%和74.05%，此后隨著質(zhì)量濃度的增加，清除率逐漸增加，而增加不顯著。因此，選擇海參肽質(zhì)量濃度15 mg/mL 進行后續(xù)試驗。

圖1 不同水解度海參肽的體外抗氧化活性Fig.1 The antioxidant activity in vitro of SCP-L and SCP-H

值得注意的是，在上述3 種體外抗氧化評價方法中，當兩種海參肽的質(zhì)量濃度相同時，SCP-H的體外抗氧化活性均高于SCP-L。分子質(zhì)量較小的生物活性肽可以更有效地與自由基相互作用，更容易通過腸道屏障，從而在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化活性[24]。根據(jù)前期研究結(jié)果，SCP-H 分子質(zhì)量在2 000 u 以下的肽段含量為98.39%（〈1 000 u 的部分占90.12%），而SCP-L 的為87.89%（〈1 000 u的部分占68.13%）。另外，生物活性肽中的一些氨基酸如極性氨基酸（半胱氨酸、組氨酸和酪氨酸）和疏水性氨基酸（蛋氨酸和色氨酸）可以作為氫供體或受體以形成不同強度的氫鍵，發(fā)揮一定的抗氧化活性[25]。酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和組氨酸等氨基酸可作為氫供體；天冬氨酸和谷氨酸等酸性氨基酸能螯合金屬離子；丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸等疏水氨基酸可能有助于改善肽在脂質(zhì)相的溶解度，促進肽與脂質(zhì)自由基的相互作用，從而提高抗氧化活性[26]。研究發(fā)現(xiàn)在與抗氧化相關(guān)的氨基酸組成上，兩者是沒有任何區(qū)別的（SCP-L 的極性氨基酸和疏水性氨基酸為60.42%，SCP-H 的極性氨基酸和疏水性氨基酸為60.46%）。因此，SCP-H 的體外抗氧化效果優(yōu)于SCP-L，可能是由于其分子質(zhì)量不同導(dǎo)致的。

2.1.2 不同環(huán)境條件對海參肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 由圖2a 可知，在20～100 ℃范圍內(nèi)，加熱1 h后SCP-L 和SCP-H 的羥自由基清除率幾乎沒有變化，這與姚秩俊等[27]的研究結(jié)果相反。姚秩俊等[27]研究發(fā)現(xiàn)，當溫度超過60 ℃時，菜籽肽的DPPH 自由基清除率急劇下降，溫度為100 ℃時，其亞鐵離子螯合能力僅有30%左右（室溫時為85%左右）。然而，吳興美等[28]的研究結(jié)果與本研究類似，他們發(fā)現(xiàn)蠶絲素蛋白肽在90 ℃下放置2 h后，仍然具有較高的抗氧化活性（保留原來的90%～93%）。綜合以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)海參肽具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖2 溫度、pH、食品配料、金屬離子和胃腸消化對海參肽抗氧化穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature，pH，food ingredients，and metal ions on the antioxidant stability of SCP-L and SCP-H

由圖2b 可知，與正常條件下的海參肽溶液的清除率相比，在pH 值為5 時，SCP-L 和SCP-H 的羥自由基清除率也無明顯變化，pH 值為3 和7時，自由基清除率SCP-L 分別下降了34.67%，18.69%，SCP-H 分別下降了17.65%，6.86%。在堿性條件下（pH 值為9 和12），SCP-L 和SCP-H 的羥自由基清除能力均完全喪失。出現(xiàn)這種情況可能有兩方面的原因，一方面可能是由于強堿環(huán)境使得肽分子結(jié)構(gòu)發(fā)生消旋作用，肽鏈構(gòu)象發(fā)生了改變，從而影響了其生物活性的表達[29]，另外一方面可能是因為在堿性環(huán)境下作為肽清除自由基的氫供體上的氫被消耗，從而導(dǎo)致其抗氧化活性降低[30]。綜合以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)海參肽適用于制造偏酸性的產(chǎn)品，應(yīng)盡量避免在堿性強的環(huán)境下加工使用。

由圖2c 可知，分別在SCP-L 和SCP-H 中添加5%的不同食品配料，發(fā)現(xiàn)葡萄糖、淀粉、乳糖和蔗糖對其羥自由基清除能力均無明顯變化，而添加氯化鈉后，其羥自由基清除率顯著降低了13.02%和12.12%，這與劉丹[31]的研究結(jié)果相一致。綜合以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)海參肽應(yīng)盡量避免在含有氯化鈉的環(huán)境下。

由圖2d 可知，分別在SCP-L 和SCP-H 中添加500 μg/mL 的 金屬離子發(fā) 現(xiàn)，K+、Ca2+、Mg2+對SCP-L 和SCP-H 的羥自由基清除率無明顯影響。當添加Cu2+后，羥自由基清除率分別下降了7.32%和11.64%。同樣地，Zn2+的加入也使得羥自由基清除率下降了28.12%和29.86%，表明海參肽對Cu2+和Zn2+較敏感，這兩種金屬離子可能與海參肽之間存在特殊的化學(xué)力作用，進而使得其抗氧化活性降低，這與裴云成等[32]的研究結(jié)果一致。綜合以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)海參肽應(yīng)盡量避免在含有Cu2+和Zn2+的環(huán)境。

由圖2e 可知，經(jīng)模擬胃液消化后的SCP-L和SCP-H 對羥自由基清除活性分別降低了4.58%和5.340%，而經(jīng)過模擬胃腸液消化后的清除率分別顯著增加了41.88%和31.80%。這可能是由于海參肽在經(jīng)過胃蛋白的作用后，使得原來具有抗氧化活性的部分肽段水解成了單個的氨基酸殘基，進而導(dǎo)致其抗氧化能力喪失。但經(jīng)過胰蛋白的作用后又使得具有抗氧化活性的基團被釋放出來。因此，海參肽在模擬胃腸液消化條件下的抗氧化穩(wěn)定性大于模擬胃液，可適用于制成口服的功能性食品中。

2.2 海參肽對H2O2 誘導(dǎo)L929 細胞氧化損傷的保護作用

2.2.1 海參肽對L929 細胞的毒性作用及其對H2O2誘導(dǎo)的細胞損傷的保護作用 基于體外的化學(xué)評價方法得知SCP-L 和SCP-H 均具有較強的清除自由基能力。而氧化應(yīng)激是由于過量的自由基積累而導(dǎo)致的一種應(yīng)激反應(yīng)，它會使得健康的細胞發(fā)生損傷和凋亡。因此，接下來測定了細胞水平上的抗氧化活性。為了確定海參肽作用于L929細胞的安全濃度范圍，將不同濃度的SCP-L 和SCP-H 分別加入到細胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h 來檢測其對L929 細胞存活率的影響。由圖3a 可知，與正常組相比，無論是SCP-L 還是SCP-H，在0.2～0.8 mg/mL 時能夠促進細胞增殖，SCP-L 細胞存活率分別達到了102.31%，116.57%，103.25%，SCP-H 細胞存活率達到了113.47%，128.60%，111.12%。當質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL 時，抑制了細胞的增殖，存活率分別為90.88%和96.84%，表明海參肽質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL 時，顯示出對L929細胞的毒性作用。結(jié)果表明，0.2～0.8 mg/mL 的SCP-L 和SCP-H 對L929 細胞均無毒性，且SCPH 的效果優(yōu)于SCP-L。因此，選取0.2～0.8 mg/mL的兩種海參肽進行后續(xù)試驗。

圖3 海參肽對L929 細胞存活率的影響Fig.3 Effect of SCP-L and SCP-H on the viability of L929 cells

由圖3b 可知，與模型組相比，在0.2～0.8 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的SCP-L 均能顯著提高細胞存活率；與模型組相比，0.6 mg/mL 時的兩種海參肽組的細胞存活率提高了52.10%（P 〈 0.001）；SCP-H 與SCP-L 對細胞的氧化損傷的保護作用的結(jié)果相似，然而當質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 時，對細胞的保護作用最顯著（顯著提高了75.32%）。綜合以上結(jié)果表明SCP-L 和SCP-H 質(zhì)量濃度為0.2～0.6 mg/mL 時，對L929 細胞的氧化損傷的保護作用均較好，且SCP-H 的效果優(yōu)于SCP-L，因此選取0.2，0.4，0.6 mg/mL 的兩種海參肽進行后續(xù)試驗。

2.2.2 海參肽對L929 細胞損傷的抗氧化能力的影響 LDH 廣泛存在于各個組織的胞漿內(nèi)，當細胞受損時便會由細胞內(nèi)滲透至細胞外[33]。由圖4a可知，與模型組相比，SCP-L 的質(zhì)量濃度為0.2～0.6 mg/mL 時，LDH 活力分別減少了6.19%，17.87%，20.67%（P 〈 0.05）；同樣地，SCP-H 的LDH 活力相應(yīng)減少了13.22%，22.61%，25.91%（P〈0.01）。當機體處于臭氧、氮氧化物、高氧等環(huán)境時，可能會促使生物膜的多不飽和脂肪酸脂質(zhì)發(fā)生過氧化，進而促進MDA 等脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生[34]。由圖4b 可知，0.2，0.4，0.6 mg/mL 的SCP-L使得細胞內(nèi)的MDA 含量降低0.24%，16.37%（P〈0.05）和26.39%（P 〈 0.01），同時，SCP-H 使得MDA 含量分別降低了21.65%（P 〈 0.01），41.14%和44.36%（P〈0.001）。

圖4 海參肽對H2O2 誘導(dǎo)L929 細胞抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of SCP-L and SCP-H on the antioxidant activity in L929 cells induced by H2O2

SOD 作為各種器官組織中自由基的“頭號殺手”，能夠?qū)⒊踝杂苫D(zhuǎn)化為H2O2。GSH-Px 能夠使有毒的過氧化物還原為無毒的羥基化合物，同時促進H2O2分解成H2O 和O2，保護細胞形態(tài)[35]。由圖4c 可知，與模型組相比，SCP-L 質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.6 mg/mL 時，SOD 活力分別提高了30.62%，73.86%，89.63%（P〈0.01）；同時SCP-H使得SOD 活力分別顯著提高了65.02%，122.58%（P〈0.01）和130.17%（P〈0.001）。類似地，SCP-L的GSH-Px 活力相應(yīng)提高了10.37%，35.37%（P〈0.05）和26.22%，SCP-H 的GSH-Px 活力也相應(yīng)提高了23.76%，41.94%，40.14%（P〈0.05）。

綜合以上試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCP-L 和SCP-H 均可以通過降低細胞膜的通透性和細胞的脂質(zhì)過氧化程度，以及提高細胞的抗氧化酶活力，在一定程度上減弱H2O2誘導(dǎo)的L929 細胞氧化損傷，且SCP-H 的效果優(yōu)于SCP-L。

3 結(jié)論

抗氧化穩(wěn)定性研究表明SCP-L 和SCP-H 均具有良好的熱穩(wěn)定性，當在海參肽中添加葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、K+、Ca2+、Mg2+對其抗氧化活性均無顯著影響；當添加氯化鈉、Cu2+、Zn2+以及在堿性環(huán)境下顯著降低了其抗氧化穩(wěn)定性；模擬胃液會降低其抗氧化活性，而模擬胃腸液則明顯提高了其抗氧化活性。因此，海參肽在儲存過程中應(yīng)盡量避免與強酸、強堿、含氯化鈉、Cu2+和Zn2+等環(huán)境因素接觸。海參肽對H2O2誘導(dǎo)L929 細胞氧化損傷的保護作用結(jié)果表明，SCP-L 和SCP-H 通過降低上清液中LDH 活力、細胞內(nèi)MDA 含量以及提高SOD 和GSH-Px 活力，實現(xiàn)對氧化應(yīng)激損傷L929細胞起到良好的保護作用，且SCP-H 的效果優(yōu)于SCP-L。本研究可為海參肽在后期的實際應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。