閆文杰，馮 朵，2，張紹時，周士琦

（1 北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100023 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所 北京 100081）

炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）是一種特殊的、病因尚不明確的慢性腸道炎癥性疾病，包括兩種亞型：克羅恩?。–rohn's Disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）[1]。截止2017 年，全球有680 萬人被診斷患有IBD，全球發(fā)病率和患病率逐年增加，北美、西歐IBD 患病率較高[2-3]。1990—2019 年中國IBD 發(fā)病率從1.45/10 萬上升到3.62/10 萬，總體上升幅度為149.66%；死亡率從0.47/10 萬下降至0.33/10萬，總體下降幅度為29.79%[4]。隨著中國人口老齡化，老年患者高發(fā)病率的小幅增加會對醫(yī)療衛(wèi)生保健系統(tǒng)造成巨大的負(fù)擔(dān)。

有研究證明，飲食調(diào)節(jié)有助于減輕IBD 患者的腹痛或腹瀉等癥狀，減輕其并發(fā)癥；還可調(diào)節(jié)腸道微生物組成和功能，影響腸道穩(wěn)態(tài)，維持腸道平常功能[5]。肉蓯蓉作為一種具有悠久歷史的食藥同源植物，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中被廣泛應(yīng)用于腸道疾病的治療，也被認(rèn)為具有多種保健功效，因此在保健食品領(lǐng)域備受關(guān)注[6-7]。2020 年，肉蓯蓉（荒漠）被列為食藥同源物質(zhì)，開展生產(chǎn)經(jīng)營試點(diǎn)工作[6-7]。肉蓯蓉作為食品，在日常生活中可起到預(yù)防IBD 的作用；作為藥材食用，可在IBD 治療過程中起到緩解病癥的作用，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)荒漠肉蓯蓉水提物能刺激免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)免疫活性，預(yù)防炎癥性腸病[8]。Jia 等[9]發(fā)現(xiàn)從肉蓯蓉中提取到的松果菊苷（Echinacoside，ECH）可改善DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎；ECH 可通過刺激腸上皮細(xì)胞增殖、上調(diào)TGF-β 來預(yù)防細(xì)胞死亡并改善黏膜組織修復(fù)作用[10]。ECH 還可通過抑制mTOR/STAT3 通路表達(dá)水平，緩解LPS 誘導(dǎo)的大鼠腸上皮細(xì)胞凋亡和炎癥[11]。此外，毛蕊花糖苷可作為機(jī)體自由基清除劑，減緩2，4-二硝基苯酸（2，4-Dinitrobenzene sulfonic acid，DNBS）誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎進(jìn)展，減少組織損傷[12]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門綜合了生物信息學(xué)、生物化學(xué)、藥理學(xué)和計(jì)算科學(xué)等多個領(lǐng)域的交叉學(xué)科，其利用大數(shù)據(jù)、生物信息學(xué)和計(jì)算工具，分析和模擬生物體內(nèi)的復(fù)雜藥物代謝、作用機(jī)制和藥效預(yù)測，為新藥研發(fā)和現(xiàn)有藥物的優(yōu)化提供了重要支持[13-14]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的核心是建立藥物與生物體內(nèi)分子之間的網(wǎng)絡(luò)模型，以揭示藥物與靶標(biāo)蛋白、代謝途徑、細(xì)胞信號通路等之間的相互關(guān)系[15]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將繼續(xù)在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，為改善患者的生活質(zhì)量和健康做出貢獻(xiàn)。

有研究發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉總苷能夠有效抑制LPS 誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[16]，具有抑制肝癌進(jìn)展[17]、保肝護(hù)肝[18]、改善記憶認(rèn)知[19-20]、抗衰老[21]等作用。目前，肉蓯蓉總苷對炎癥性腸病的作用還鮮有研究報(bào)道。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與動物實(shí)驗(yàn)探究肉蓯蓉總苷對炎癥性腸病的作用機(jī)制，為其治療IBD 的臨床應(yīng)用提供新的方法和思路。

1 材料與儀器

1.1 試劑

葡聚糖硫酸鈉（DSS，相對分子量36 000～50 000），美國MP 公司；尿糞隱血測試盒，南京建成生物工程研究所；無水乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二甲苯，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；PBS 緩沖液、RNA 提取液、第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×實(shí)時定量PCR 擴(kuò)增的預(yù)混合溶液、RTQPCR 引物，武漢賽維爾生物科技有限公司；無菌無酶水，美國HyClone 公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

KZ-Ⅲ-FP 型低溫研磨儀，武漢賽維爾生物科技有限公司；CT15RE 型高速離心機(jī)，日本HITACHI 公司；CFX 熒光定量PCR 儀，美國Bio-rad公司；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)，德國Thermo 公司；FBZ2001-up-p 標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀，青島富勒姆科技有限公司；INFINITE M NANO 型多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN 公司，UV-1600 型紫外分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 肉蓯蓉活性成分 在已有研究[7，22]的基礎(chǔ)上，選擇“Echinacoside”“Verbascoside”“Cistanoside A”“Tubuloside A”“Isoacteoside”“2-Acetylacteoside”“Tubuloside B”作為分析生物活性成分。通過Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）找 出上述7 種成分的三維化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，存為sdf 格式。

2.1.2 潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測與篩選 將活性成分的三維結(jié)構(gòu)文件分別導(dǎo)入PharmMapper 數(shù)據(jù)庫（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html），靶點(diǎn)物種選擇“human protein targets only”，其余選項(xiàng)保持默認(rèn)，得到不同成分對應(yīng)的相應(yīng)目標(biāo)靶點(diǎn)。采用UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）獲取每個靶點(diǎn)對應(yīng)的蛋白名稱和基因名稱信息。將7 種成分對應(yīng)的目標(biāo)靶點(diǎn)合并。

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中（https：//www.genecards.org/），以“inflammatory bowel disease”為關(guān)鍵詞檢索與炎癥性腸病相關(guān)的基因，整理檢索結(jié)果。

2.1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein，Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用jvenn（https：//jvenn.toulouse.inrae.fr/app/example.html）在線繪制韋恩圖，獲取肉蓯蓉活性成分靶點(diǎn)和IBD 的靶點(diǎn)交集。將得到的交集靶點(diǎn)上傳到String 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 篩選分析。下載PPI 網(wǎng)絡(luò)的TSV 文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0，計(jì)算蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中度（degree）值，再依據(jù)degree 值大小對PPI 網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行美化。

2.1.4 基因本體（Gene Ontology，GO）功能富集和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析 使用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對 肉蓯蓉活性成分對IBD 發(fā)揮保護(hù)作用的靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析，再用DAVID 數(shù)據(jù)庫對肉蓯蓉活性成分對IBD 發(fā)揮保護(hù)作用的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析。

2.1.5 肉蓯蓉“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將肉蓯蓉的活性成分，肉蓯蓉活性成分與IBD 的交集靶點(diǎn)和KEGG 富集的通路構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

2.2 動物模型驗(yàn)證

2.2.1 動物模型建立 使用SPF 級雄性BALB/c小鼠（5～8 周，18～21 g），由北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品檢測中心提供【實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（京）2017-0038】，飼養(yǎng)于SPF 級動物房中，溫度（23±2）℃，相對濕度50%～70%，日光燈照射12 h 交替晝夜。動物實(shí)驗(yàn)方案均獲得北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品檢測中心動物實(shí)驗(yàn)室批準(zhǔn)。將20 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4 組，每組5 只。①對照組（CZ）：自由飲用無菌水，灌胃無菌水，連續(xù)7 d；②DSS 對照組（DZ）：自由飲用每日現(xiàn)配3%DSS 液，連續(xù)7 d；③肉蓯蓉總苷低劑量組（LZ）（藥液濃度：0.1 g/mL）：自由飲用每日現(xiàn)配3%DSS 液，灌胃藥液，連續(xù)7 d；④肉蓯蓉總苷高劑量組（HZ）（藥液濃度0.4 g/mL）：自由飲用每日現(xiàn)配3%DSS 液，灌胃藥液，連續(xù)7 d。連續(xù)造模7 d 后斷食12 h，頸椎脫臼處死。處死前4 h 腹腔注射雞紅細(xì)胞，處死后立即摘眼球收集血液，抽取腹腔積液后打開腹腔。測量結(jié)腸長度，取小鼠脾臟、派氏結(jié)等器官。

2.2.2 疾病活 動指數(shù)（Disease activity index，DAI）每日固定時間灌胃前稱小鼠體質(zhì)量，觀察小鼠精神狀態(tài)、糞便性狀，測定糞便隱血情況，并進(jìn)行相應(yīng)評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 DAI 評分表Table 1 Scoring criteria of DAI

DAI 評分=（體質(zhì)量評分+糞便性狀評分+糞便隱血評分）/3（1）

2.2.3 實(shí)時熒光定量PCR 檢測免疫信號通路（qRT-PCR）檢測 收集小鼠脾臟，剪切成0.5 cm大小的組織塊，浸泡在組織RNA 穩(wěn)定保存液中存放。取出組織切塊，加入RNA 提取液并研磨粉碎，提取其總RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、PCR 擴(kuò)增，檢測小鼠脾臟中mTOR、TGF-β 兩個關(guān)鍵免疫信號通路激活情況。qRT-PCR 所用引物序列見表2。

表2 引物序列表Table 2 Primer sequence table

2.2.4 PICRUSt2 功能注釋 采用CTAB 或SDS方法提取樣品的小鼠糞便基因組DNA，之后用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA 純度和濃度。隨后取適量DNA 于離心管中，用無菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA 為模板，根據(jù)擴(kuò)增區(qū)域選擇使用帶barcode 的特異性引物、New England Biolabs 公司的含GC 緩沖液的高保真PCR 混合物和高效高保真酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

PCR 產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳再次檢測。對目的條帶使用Qiagen 公司提供的膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

根據(jù)16S rDNA 擴(kuò)增子測序結(jié)果，基于Greengene 數(shù)據(jù)庫中的ASV tree 和ASV 的基因信息，推斷它們共同祖先的基因功能譜。同時對Greengene 數(shù)據(jù)庫中其它未知物種的基因功能譜進(jìn)行推斷，構(gòu)建古菌和細(xì)菌域全譜系的基因功能預(yù)測譜。最后將測序得到的菌群組成映射到數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行菌群代謝功能預(yù)測。

3 結(jié)果與分析

3.1 肉蓯蓉總苷靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)分析

將活性成分的三維結(jié)構(gòu)文件分別導(dǎo)入PharmMapper 數(shù)據(jù)庫，得到不同成分對應(yīng)的相應(yīng)目標(biāo)靶點(diǎn)。采用UniProt 數(shù)據(jù)庫獲取每個靶點(diǎn)對應(yīng)的蛋白名稱和基因名稱信息。將7 種成分對應(yīng)的目標(biāo)靶點(diǎn)合并，共得到354 個靶點(diǎn)。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中，以“inflammatory bowel disease”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)的基因，整理檢索結(jié)果，最終獲得7 851 個靶點(diǎn)。使用jvenn 在線繪制韋恩圖獲取肉蓯蓉活性成分靶點(diǎn)和IBD 的靶點(diǎn)交集，如圖1 所示，得到肉蓯蓉活性成分對IBD 有防護(hù)作用的靶點(diǎn)254 個。

圖1 活性成分靶點(diǎn)與炎癥性腸病（IBD）疾病靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of active ingredients targets and IBD targets

3.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的交集靶點(diǎn)上傳到String 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 篩選。如圖2 所示，不同顏色節(jié)點(diǎn)分別代表肉蓯蓉中的活性成分和IBD 相關(guān)靶點(diǎn)，邊代表活性成分和作用靶點(diǎn)相互作用關(guān)系，顏色越深代表其節(jié)點(diǎn)越重要。該網(wǎng)絡(luò)共包括227 個節(jié)點(diǎn)，這些節(jié)點(diǎn)相互作用產(chǎn)生917 個蛋白互作邊，平均度值為7.25。根據(jù)Cytoscape 3.8.0 插件CytoHubba 分析網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。如圖3 所示，排名前30 的核心靶點(diǎn)包含有PTK2、PIK3R1、JAK2、表皮生長因子受體（EGFR）、KDR、非受體酪氨酸激酶（SRC）、HSP90AA1、絲氨酸/酸酸激酶1（AKT1）、STAT1、PTPN11 等。

圖2 交集靶點(diǎn)蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI-network diagram of common targets

3.3 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫對肉蓯蓉活性成分對IBD 發(fā)揮保護(hù)作用的254 個靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析（P〈0.05），共獲得283 條生物過程（Biological process，BP）、79 條細(xì)胞組分（Cellular component，CC）、166 條分子功能（Molecular function，MF）數(shù)據(jù)，再利用微生信在線平臺（http：//bioinformatics.com.cn/login/）對Count 值排名靠前的10 位進(jìn)行富集分析。如圖4 所示，肉蓯蓉活性成分干預(yù)IBD 參與的BP 有信號傳導(dǎo)（Signal transduction）、蛋白質(zhì)磷酸化（Protein phosphorylation）、凋亡過程負(fù)調(diào)控（Negative regulation of apoptotic process）、RNA聚合酶II 啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、蛋白質(zhì)水解（Proteolysis）、先天免疫反應(yīng)（Innate immune response）、細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)（Positive regulation of cell proliferation）、細(xì)胞分化（Cell differentiation）、DNA 模板的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控（Positive regulation of transcription DNA-templated）、細(xì)胞對外源性刺激的反應(yīng)（Response to xenobiotic stimulus）。CC 主要有胞液（Cytosol）、細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm）、核（Nucleus）、質(zhì)膜（Plasma membrane）、Extracellular exosome、Extracellular region、核漿（Nucleoplasm）、Extracellular space、薄膜（Membrane）、線粒體（Mitochondrion）。MF 主要有蛋白結(jié)合（Protein binding）、相同蛋白結(jié)合（Identical protein binding）、ATP 結(jié)合（ATP binding）、金屬離子結(jié)合（Metal ion binding）、鋅離子結(jié)合（Zinc ion binding）、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（Protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、酶結(jié)合（Enzyme binding）、蛋白質(zhì)同源二聚活性（Protein homodimerization activity）、蛋白激酶活性（Protein kinase activity）、蛋白酪氨酸激酶活性（Protein tyrosine kinase activity）。

圖4 GO 功能富集圖Fig.4 Enrichment analysis diagram of GO

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫對肉蓯蓉活性成分對IBD 發(fā)揮保護(hù)作用的254 個靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，共獲得161 條通路。將肉蓯蓉的活性成分，肉蓯蓉活性成分與IBD 的交集靶點(diǎn)和KEGG富集的通路構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。如圖5 所示，最左側(cè)是肉蓯蓉，左側(cè)第1 個圓圈為肉蓯蓉活性成分，右側(cè)圓圈為交集靶點(diǎn)對應(yīng)篩選出的富集通路，中間矩形部分是交集靶點(diǎn)。由該圖可以推測，肉蓯蓉活性成分可能通過作用于IL2、mTOR、ADH、CAS、SMAD、MAPK、NF-κB 等靶點(diǎn)來調(diào)控癌癥通路、mTOR 通路、TGF-β 通路、JAKSTAT 通路、AMPK 通路等，進(jìn)而影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)、增殖、分化、凋亡等。

3.4 肉蓯蓉總苷提高DSS 誘導(dǎo)的DAI 評分

試驗(yàn)結(jié)果表明，除CZ 組外，其余3 組均有不同程度的體質(zhì)量減輕和糞便隱血情況（圖6）。其中，DSS 對照組體質(zhì)量減輕率最高，糞便血情況最嚴(yán)重，DAI 最高，第6 天糞便出血明顯。經(jīng)肉蓯蓉總苷干預(yù)后，DAI 評分逐漸降低，隱血情況逐漸降低。HZ 組體質(zhì)量減輕率最低，糞便隱藏血量最低。結(jié)果表明肉蓯蓉總苷改善了炎癥性腸病引起的生理反應(yīng)。

圖6 肉蓯蓉總苷對小鼠DAI 評分的影響Fig.6 Effect of Total glycosides of Cistanche deserticola on the IBD score in mice

3.5 肉蓯蓉總苷下調(diào)IBD 小鼠脾臟中mTOR 和TGF-β 信號通路表達(dá)

mTOR 和TGF-β信號通路是激活炎癥反應(yīng)的兩個重要信號通路。通過qRT-PCR 檢測小鼠脾臟組織中mTOR 和TGF-β的表達(dá)，結(jié)果顯示：DSS 對照組小鼠中mTOR 和TGF-β的mRNA 表達(dá)量較正常小鼠顯著增加，與DSS 對照小鼠相比，肉蓯蓉干預(yù)后小鼠中mTOR 和TGF-β表達(dá)顯著降低。其中，高劑量組的下降幅度最為顯著，且表達(dá)水平與正常組基本一致（圖7）。結(jié)果表明，肉蓯蓉總苷下調(diào)了mTOR 和TGF-β信號通路的表達(dá)。

圖7 肉蓯蓉總苷對小鼠脾臟中和mTOR 和TGF-β mRNA 表達(dá)水平的影響Fig.7 Total glycosides of Cistanche deserticola downregulates the mRNA of TGF-β and mTOR signaling pathways in IBD mice

3.6 PICRUSt2 功能注釋分析

PICRUSt2 是一種基于生物16S rRNA 以及Greengene 數(shù)據(jù)庫中的ASV tree 和ASV 的基因信息進(jìn)行元基因組功能預(yù)測的生物信息工具。選用COG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能預(yù)測，結(jié)果顯示，腸道菌群功能主要涉及RNA 加工；染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)；細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分割；防御機(jī)制；信號細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/包膜生物發(fā)生；細(xì)胞外結(jié)構(gòu)；細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸；能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換；碳水化合物的運(yùn)輸和代謝等20 多種功能。選取豐度排名前15 的功能及它們在每個樣品中的豐度信息繪制熱圖（圖8），并從不同功能層面進(jìn)行聚類。與CZ 組相比，DZ 對照組小鼠的COG1132（ABCtype multidrug transport system）、COG0745（DNAbinding response regulator）、COG1131（ABC-type multidrug transport system）、COG1961（Site-specific DNA recombinase related to the DNA invertase Pin）、COG0438（Lycosyltransferase involved in cell wall bisynthesis）、COG0534（Na+-driven multidrug efflux pump）、COG0642（Signal transduction histidine kinase）、COG1595（DNA-directed RNA polymerase specialized sigma subunit）、COG0463（Endonuclease）、COG4974（Site-specific recombinase XerD）、COG2207（AraC-type DNAbinding domain and AraC-containing proteins）、COG1136（ABC-type lipoprotein export system）、COG1309（DNA-binding transcriptional regulator）功能基因表達(dá)異常。這些基因主要涉及：V：防御機(jī)制；T：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；M：細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/包膜生物生成；I：脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝；K：轉(zhuǎn)錄；L：復(fù)制、重組和修復(fù)。這六大功能給予肉蓯蓉總苷后，這些有差異的生理功能表達(dá)均向正常組接近。與CZ 和DZ 組小鼠對比，HZ 組小鼠的COG1028（Short-chain alcohol dehydrogenase family）、COG0451（Nucleoside-diphosphate-sugar epimerase）基因發(fā)生高表達(dá)，這兩個基因與I：脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝以及M：細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/包膜生物生成功能有著密切聯(lián)系，因此推測肉蓯蓉總苷可能通過調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)脂代謝、糖代謝過程及相關(guān)防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制過程來調(diào)控IBD 小鼠損傷。

圖8 PICRUSt2-功能豐度聚類熱圖Fig.8 Heatmap of the PICRUSt2-functional abundance clustering

4 討論

IBD 會導(dǎo)致腸道黏膜的慢性炎癥和潰瘍，現(xiàn)代西方醫(yī)學(xué)無法完全治愈，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[23-25]。中醫(yī)認(rèn)為，調(diào)整飲食可以平衡體內(nèi)陰陽，有助于緩解腸道炎癥[26]。中醫(yī)飲食療法在炎癥性腸病的輔助治療中可以發(fā)揮積極作用。肉蓯蓉可作為輔助炎癥性腸病治療的傳統(tǒng)保健食品原料。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明，肉蓯蓉總苷成分對IBD 有防護(hù)作用的靶點(diǎn)254 個。GO 富集結(jié)果表明肉蓯蓉總苷干預(yù)IBD 可能與信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化、凋亡過程負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)水解、先天免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、DNA 模板的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、蛋白結(jié)合、ATP 結(jié)合、金屬離子結(jié)合、鋅離子結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、酶結(jié)合等生物過程及分子功能相關(guān)?；钚猿煞?靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析表明，肉蓯蓉的活性成分可能通 過作用 于IL2、mTOR、ADH、CAS、SMAD、AMPK、NF-κB 等靶點(diǎn)來調(diào)控癌癥通路、mTOR 通路、TGF-β 通路、JAK-STAT 通路、AMPK 通路等，進(jìn)而影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)、增殖、分化、凋亡等。

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，選用DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠模型模擬IBD 患者相似的臨床癥狀，對分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。現(xiàn)有研究表明TGF-β 在整個IBD 疾病的形成和發(fā)生過程中居于中心，TGF-β1的大量表達(dá)，會導(dǎo)致結(jié)腸的上皮損傷與異常的修復(fù)，肌成纖維細(xì)胞增生及基膜下纖維化，最終造成IBD 的發(fā)生[27]。mTOR 作為一類重要蛋白質(zhì)物質(zhì)，是細(xì)胞生長和增殖的中心調(diào)節(jié)因子[28-29]。mTOR 參與調(diào)節(jié)許多重要的細(xì)胞過程，包括翻譯、轉(zhuǎn)錄和自噬。其中，AMPK/mTOR 信號通路可以共同介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)合成代謝和分解代謝過程[30-31]。此外，AMPK/mTOR 通路也被證實(shí)是調(diào)控IBD 疾病的重要通路[32]。mTOR 是AMPK 重要的下游信號分子，在自噬調(diào)控中起負(fù)調(diào)控作用，TGF-β1 也可以通過調(diào)節(jié)mTOR 相關(guān)信號通路表達(dá)水平抑制自噬，并可通過介導(dǎo)SMADS 的信號通路間接地對細(xì)胞起到調(diào)控作用[31，33]。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)驗(yàn)證了mTOR 和TGF-β兩個信號通路基因的表達(dá)。結(jié)果表明，肉蓯蓉總苷能有效緩解患病小鼠體質(zhì)量減輕及糞便出血，降低DAI 評分，抑制脾臟中mTOR 和TGF-β 信號通路表達(dá)。通過對小鼠糞便的16S rDNA 擴(kuò)增子測序進(jìn)行PICRUSt2 基因功能注釋分析。結(jié)果表明，患病小鼠中 COG1132、COG0745、COG1131、COG1961、COG0438、COG0534、COG0642、COG1595、COG0463、COG4974、COG2207、COG1136、COG1309功能基因表達(dá)異常升高。給予肉蓯蓉總苷干預(yù)后13 種基因表達(dá)恢復(fù)正常，同時COG1028、COG0451 基因高表達(dá)。推測肉蓯蓉總苷可能通過調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)脂代謝、糖代謝過程及相關(guān)防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等機(jī)制過程來緩解IBD 小鼠損傷。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果基本相同。

綜上所述，肉蓯蓉總苷通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用治療炎癥性腸病。其作用靶點(diǎn)應(yīng)該與IL2、mTOR、TGF-β、JAK-STAT、NF-κB 等相關(guān)，同時實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肉蓯蓉總苷可能主要是通過抑制TGF-β、mTOR 兩個信號通路表達(dá)來治療炎癥性腸病。本實(shí)驗(yàn)為闡明肉蓯蓉治療IBD 的臨床應(yīng)用提供了新的方法，然而，其具體機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)還需更深入的研究。