王自強， 王穎， 趙坤霄， 王保興， 李英△

（1河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 051000；2海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，海南 海口 570102）

高糖誘導細胞產(chǎn)生過多的活性氧（reactive oxygen species， ROS），從而加速糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy， DN）的進展［1-2］。過量的ROS產(chǎn)生細胞毒性，破壞蛋白質(zhì)和DNA，激活DNA損傷反應，誘導應激性衰老［3］。既往研究表明，在DN早期，腎小管上皮細胞即處于持續(xù)氧化應激狀態(tài)，繼而呈現(xiàn)增生、肥大等應激性衰老過程［4］。

沉默信息調(diào)節(jié)因子（silent information regulator，sirtuin/Sirt）家族屬于第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）驅(qū)動其去乙?；富钚裕?］。在哺乳動物中，已鑒定出7個Sirt2同源物（Sirt1~7），在生物調(diào)控機制和亞細胞定位上各存在差異。Sirt3定位于線粒體，參與衰老相關的病理過程，如心血管和神經(jīng)退行性疾病、代謝綜合征等［6］。新近研究表明，Sirt3通過抗氧化機制發(fā)揮抗衰老作用［7］。我們前期研究表明，高糖環(huán)境下HK-2細胞中Sirt3的表達顯著降低［8］。通過上調(diào)Sirt3的表達可抑制高糖誘導的氧化應激和細胞凋亡過程［9］。Kelch樣ECH關聯(lián)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1， Keap1）/核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2， Nrf2）通路是調(diào)控氧化還原平衡的重要信號通路，而Nrf2介導的抗氧化途徑被破壞是導致細胞衰老的驅(qū)動力［10］。那么，Sirt3在高糖誘導的應激性衰老的過程中是否也起到保護作用，Keap1/Nrf2通路是否參與該過程，值得進一步探索。本研究擬觀察Sirt3在高糖刺激誘導的氧化應激和應激性衰老中的作用，并進一步探討其作用是否是通過影響Keap1/Nrf2通路的活性來實現(xiàn)的。

材料和方法

1 試劑耗材

D-葡萄糖（Sigma）；DMEM培養(yǎng)基、Lipofectmine 3000和P3000（Invitrogen）；β-actin抗體（Proteintech）；Sirt3、P16、P21、Nrf2、血紅素加氧酶（heme oxygenase 1， HO-1）、醌氧化還原酶1（NADPH quinone oxidoreductase 1， NQO1）、Keap1和histone H3抗體（Abcam）；pCMV3載體質(zhì)粒和pCMV3-Sirt3質(zhì)粒（Sino Biological）；衰老相關β-半乳糖苷酶（senescenceassociated β-galactosidase， SA-β-Gal）染色試劑盒和ROS測定試劑盒（Solarbio）；Nrf2抑制劑ML385（Med-ChemExpress）；反向轉錄系統(tǒng)和qPCR Master Mix（Promega）；細胞核/質(zhì)分離試劑盒（Invent Biotechnologies）。

2 細胞培養(yǎng)與分組

人近端小管上皮細胞HK-2細胞（American Type Culture Collection），培養(yǎng)環(huán)境：37 ℃，5% CO2， 95%空氣。當細胞生長至60%左右時，于指定時間點按照細胞分組給予不同的刺激。細胞分組1：擬觀察HK-2細胞在高糖環(huán)境下培養(yǎng)6、12、24、48、72 h時相關指標表達的變化。細胞分為正常糖（normal glucose，NG； 葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）對照組、甘露醇高滲對照（甘露醇濃度24.5 mmol/L，葡萄糖濃度5.5 mmol/L）組和高糖（high glucose，HG；葡萄糖濃度為30 mmol/L）組，分別培養(yǎng)6、12、24、48、72 h。細胞分組2：為了觀察過表達Sirt3對高糖環(huán)境下HK-2細胞氧化應激、應激性衰老及相關通路的影響，將細胞分為NG（葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）組、HG（葡萄糖濃度為30 mmol/L）組、高糖+空載質(zhì)粒轉染（HG+vector）對照組、高糖+轉染Sirt3質(zhì)粒（HG+Sirt3）組，各組均刺激48 h。細胞分組3：為了研究阻斷Keap1/Nrf2通路后，過表達Sirt3對高糖環(huán)境下HK-2細胞應激性衰老等蛋白表達的影響，將細胞分為NG（葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）組、HG（葡萄糖濃度為30 mmol/L）組、HG+Sirt3組、高糖+轉染Sirt3質(zhì)粒+ML385（HG+Sirt3+ML385）組，各組均在刺激48 h后，進行相關檢測。

3 實驗方法

3.1 SA-β-Gal染色 使用SA-β-Gal染色試劑盒檢測細胞衰老。HK-2細胞經(jīng)相應刺激后，PBS洗滌兩次，室溫下4%甲醛固定15 min， PBS洗滌，用1 mL新鮮制備的SA-β-Gal染色液［包含溶液A（10 μL）、溶液B（10 μL）、染色溶液C（930 μL）和X-Gal溶液（50 μL），終濃度為1 mg/mL］于37 ℃無CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。普通光學顯微鏡下觀察。

3.2 細胞內(nèi)ROS檢測 HK-2細胞以約1×106的密度傳代至6孔板，進行細胞爬片，予不同刺激結束后。采用活性氧檢測試劑盒，用10 μmol/L 2′、7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCHF-DA）檢測細胞內(nèi)ROS水平。具體步驟：PBS洗滌細胞，用預先配制的DCFHDA染色30 min，PBS避光清洗，于熒光顯微鏡下觀察。綠光熒光強度與ROS水平呈正比。

3.3 Western blot檢測相關蛋白的表達 HK-2細胞刺激結束后，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，核蛋白提取使用細胞核/質(zhì)分離試劑盒，BCA法測定蛋白濃度，蛋白質(zhì)樣品中加入SDS緩沖液，100 ℃變性7 min，-20 ℃保存。采用8%~12%的SDS-PAGE進行蛋白分離，轉膜，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h。4 ℃過夜孵育Ⅰ抗 （兔抗Sirt3、HO-1、P16、P21、Keap1及Nrf2多克隆抗體均1∶1 000稀釋，兔抗NQO1多克隆抗體1∶10 000稀釋，兔抗β-actin多克隆抗體1∶2 000稀釋）。次日，TBST洗滌（3×15 min），37 ℃條件下孵育Ⅱ抗（1∶5 000） 1 h，TBST洗滌（3×15 min）。新鮮配置ECL發(fā)光液，Odyssey FC成像系統(tǒng)顯色，ImageJ軟件分析。

3.4 RNA提取及RT-qPCR分析 TRIzol試劑提取細胞總RNA，cDNA試劑盒合成cDNA，采用qPCR Master Mix進行qPCR。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達量。詳細引物序列見表1。

表1 RT-qPCR中所用的引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

3.5 質(zhì)粒轉染 應用Lipofectamine 3000和P3000試劑，pCMV3或空pCMV3載體轉染HK-2細胞。將HK-2細胞以每孔1×106個細胞的密度接種于6孔板中，質(zhì)粒及轉染試劑加至無血清、無抗生素培養(yǎng)基中，孵育6 h后，將培養(yǎng)基改為含抗生素和10%胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育6 h。

4 統(tǒng)計學處理

計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)來自至少3次獨立實驗，各組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 過表達Sirt3可減輕高糖刺激誘導的HK-2細胞衰老

1.1 高糖對HK-2細胞Sirt3表達的影響及高糖刺激誘導細胞衰老過程 Western blot及RT-qPCR結果顯示，與NG組比較，在高糖刺激48 h后，HK-2細胞中Sirt3蛋白及mRNA表達顯著降低（P<0.05）。高糖環(huán)境下HO-1的表達隨刺激時間的延長而變化，呈先上升后下降的趨勢（P<0.05）。P16和P21蛋白的表達均呈時間依賴性，NG組中P16蛋白表達很少，P21幾乎不表達。與NG組相比，在高糖培養(yǎng)48 h后，HK-2細胞中P16和P21蛋白的表達顯著增加（P<0.05），且可觀察到更多的SA-β-Gal陽性細胞，見圖1。

Figure 1. High glucose decreased the expression of the Sirt3 protein， induced oxidative stress， and accelerated cellular senescence in HK-2 cells. A： HK-2 cells were treated with HG （30 mmol/L） for different time periods. The protein levels of Sirt3， P16，P21 and HO-1 were analyzed by Western blot； B： Sirt3 mRNA expression under the different conditions was examined by RT-qPCR； C： image of SA-β-Gal staining in the NG and HG groups treated for 48 h， as captured by microscope， blue staining reflects positive cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs NG group.圖1 高糖可降低HK-2細胞中Sirt3蛋白的表達，誘導氧化應激，加速細胞衰老

1.2 探索過表達Sirt3能否使HK-2細胞對抗高糖刺激誘導的細胞衰老 如圖2A，Western blot結果顯示，與NG組相比，高糖刺激48 h后HO-1蛋白的表達明顯減低，P16和P21蛋白的水平顯著升高（P<0.05）。與HG+vector組比較，過表達Sirt3后P16和P21蛋白的表達水平均明顯降低（P<0.05），且過表達Sirt3可顯著逆轉高糖環(huán)境下細胞內(nèi)ROS的積聚（圖2B）。與HG組相比，HG+Sirt3組SA-β-Gal陽性細胞較少（圖2C）。

Figure 2. Overexpression of Sirt3 protects against HG-induced oxidative stress and cellular senescence. A： the protein levels of HO-1， P16 and P21 were analyzed by Western blot； B： intracellular ROS accumulation was detected by a fluorescence microscope； C： stress-induced senescence of HK-2 cells was detected by SA-β-Gal staining， blue staining reflects positive cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NG group； ##P<0.01 vs HG+vector group.圖2 過表達Sirt3可使HK-2細胞對抗高糖誘導的氧化應激和應激性衰老

2 過表達Sirt3對HK-2細胞中Keap1/Nrf2通路及其下游蛋白NQO1的影響

Western blot結果顯示，在高糖刺激后6 h，Nrf2和NQO1蛋白水平均升高，并持續(xù)升高至24 h，在48 h后逐漸下降（P<0.05）。如圖3B所示，與NG組相比，高糖（48 h）環(huán)境下HK-2細胞中Nrf2、NQO1蛋白降低，Keap1蛋白表達升高（P<0.05），質(zhì)粒轉染過表達Sirt3后，Nrf2及其下游蛋白NQO1的表達增加，keap1表達降低（P<0.05）。為了評估Nrf2轉錄的變化，我們檢測了核Nrf2蛋白的表達水平。結果顯示，與HG+vector組相比，在Sirt3轉染的HK-2細胞中，細胞核Nrf2的表達顯著增加（P<0.05），見圖3C。

Figure 3. Effects of Sirt3 overexpression on Keap1/Nrf2 pathway-related proteins in HK-2 cells under high glucose environment. A：the levels of Keap1/Nrf2 signaling pathway related proteins in HK-2 cells detected by Western blot； B： the effect of Sirt3 overexpression on the Keap1/Nrf2 signaling pathway related proteins in HK-2 cells detected by Western blot； C： the effect of Sirt3 overexpression on the nuclear Nrf2 in HK-2 cells detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NG group； #P<0.05， ##P<0.01 vs HG+vector group.圖3 Sirt3過表達對高糖環(huán)境下HK-2細胞中Keap1/Nrf2信號通路相關蛋白的影響

3 抑制Keap1/Nrf2通路的活性可削弱Sirt3對HK-2細胞的作用

為進一步驗證Sirt3是否通過Keap1/Nrf2通路保護HK-2細胞，對抗高糖刺激誘導的細胞衰老，我們采用ML385（Nrf2抑制劑）抑制Keap1/Nrf2通路活性。Western blot結果顯示，與HG+Sirt3組相比，加入ML385后，Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），衰老相關蛋白P16和P21的表達水平顯著升高（P<0.05），見圖4。

Figure 4. Effects of Sirt3 overexpression on Keap1/Nrf2 pathway-related proteins such as Nrf2， NQO1， HO-1 （A）， p16 and p21 （B）in HK-2 cells under a high glucose environment after adding ML385. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NG group； #P<0.05 vs HG group； △△P<0.01 vs HG+Sirt3 group.圖4 ML385可逆轉過表達Sirt3對高糖環(huán)境下HK-2細胞應激性衰老的影響

討論

本研究結果表明高糖可誘導HK-2細胞應激性衰老，過表達Sirt3可減輕高糖誘導的氧化應激，增加抗氧化酶的表達，降低細胞內(nèi)ROS的集聚，抑制細胞衰老。過表達Sirt3激活Keap1/Nrf2信號通路及其下游蛋白，而特異性抑制Keap1/Nrf2信號通路活性可導致上述作用明顯減弱。提示Sirt3可通過激活Keap1/Nrf2通路及其下游蛋白的表達，在抗氧化應激和高糖應激誘導的衰老中發(fā)揮作用。

既往研究表明，在DN早期，腎小管上皮細胞即表現(xiàn)出應激性衰老和腎小管功能障礙，這可能是各種病理損傷的重要原因［11］。動物實驗中，在早期糖尿病大鼠模型發(fā)現(xiàn)衰老的腎小管上皮細胞。建模10天后，衰老相關蛋白P16、P21和SA-β-Gal的表達顯著增加［12］。在體外，高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞亦出現(xiàn)應激誘導的衰老［13］。本研究結果表明，在高糖刺激的腎小管上皮細胞中，P16和P21蛋白的表達呈時間依賴性，于高糖刺激12 h時開始增加，48 h達到峰值，SA-β-Gal陽性細胞數(shù)量在48 h顯著增加。

Sirtuins是依賴NAD+的蛋白去乙?；?，介導對應激刺激的適應性反應［14］。其中，Sirt3在維持線粒體穩(wěn)態(tài)及功能等方面發(fā)揮重要作用，如調(diào)節(jié)ROS的生成。研究表明，Sirt3介導的線粒體抗氧化應激效應參與apigenin對糖尿病大鼠腎臟的保護作用，且顯著提高細胞內(nèi)NAD+/NADH比值，繼而減輕高糖環(huán)境下近端腎小管上皮細胞損傷［15］。Sirt3具有抗細胞衰老的作用。體外實驗表明，通過激活Sirt3信號可抑制高糖誘導內(nèi)皮細胞衰老過程［16］。Sirt3對晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞衰老和老年性骨質(zhì)疏松癥有保護作用［17］。本研究結果表明，Sirt3參與高糖刺激誘導的HK-2細胞應激性衰老過程。過表達Sirt3可顯著上調(diào)HO-1蛋白的表達，降低細胞內(nèi)ROS水平。而過表達Sirt3顯著降低了P16和P21蛋白的表達，SA-β-Gal陽性細胞數(shù)量顯著減少。這些結果表明，過表達Sirt3可以減輕高糖刺激誘導的氧化應激和應激性衰老。

Keap1/Nrf2通路是體內(nèi)氧化還原平衡的重要調(diào)控途徑。有研究表明，Keap1/Nrf2通路參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。Nrf2的激活可減輕高糖刺激誘導的氧化應激損傷，抑制腎系膜基質(zhì)的形成，恢復腎病理損傷［18］。本研究還觀察到高糖條件下HK-2細胞中Nrf2及其下游蛋白NQO1的表達隨刺激時間的變化而變化，呈先增加后下降的趨勢。過表達Sirt3部分逆轉了高糖引起的Nrf2和NQO1蛋白的下調(diào)，增加了細胞核Nrf2的表達。結果表明，過表達Sirt3可上調(diào)Keap1/Nrf2信號通路的活性，促進Nrf2向細胞核的易位。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)Nrf2介導的抗氧化通路的破壞是細胞衰老的驅(qū)動力［10，19］。另有研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素通過Nrf2/HO-1通路降低了骨髓源性抑制細胞（MDSCs）中衰老相關蛋白P16、P21、P53和衰老相關分泌表型的表達［20］。抗氧化劑肉桂醛可以通過激活Nrf2，下調(diào)CDKN2A/P16INK4A的表達來抑制角質(zhì)細胞衰老［21］。本研究采用Nrf2特異性抑制劑ML385進行干預。結果表明，加入ML385后，HK-2細胞中Nrf2及其下游蛋白NQO1的表達顯著下調(diào)，而Sirt3對氧化應激和應激性衰老的保護作用消失。以上結果進一步表明，Sirt3通過激活Keap1/Nrf2信號通路，降低高糖刺激誘導的氧化應激反應并對抗應激性衰老的發(fā)生。

綜上所述，Sirt3通過上調(diào)Keap1/Nrf2通路及其下游蛋白，降低氧化應激反應，減輕高糖環(huán)境下應激誘導的細胞衰老（圖5）。Sirt3作為DN治療的潛在靶點，其作用機制仍有待進一步探索。

Figure 5. The possible mechanism by which Sirt3 reduces stress-induced cellular senescence.圖5 Sirt3保護HK-2細胞對抗高糖應激誘導的細胞衰老的可能機制