吳坤琳， 嚴乾壹， 王德星， 繆秀英， 張惠灝△

（1福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，福建 福州 350005；2福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院濱海院區(qū)國家區(qū)域醫(yī)療中心綜合外科二區(qū)，福建 福州 350212；3福建醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，福建 福州 350005）

乳腺癌是女性常見的腫瘤，也是導致全球腫瘤相關死亡的主要惡性腫瘤［1］。轉移是乳腺癌患者死亡的主要原因［2］，而人們對其轉移的分子機制仍知之甚少。特異AT富含序列結合蛋白2（special AT-rich sequence-binding protein 2，SATB2）基因位于人類2號染色體的q32-q33區(qū)域，其能參與基因轉錄和染色質重塑［3］。SATB2蛋白的異常表達與食管癌、結直結腸癌和胃癌等幾種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關［4］。SATB2蛋白可通過調節(jié)肌動蛋白細胞骨架動力學相關基因的表達促進骨肉瘤的侵襲和遷移［5］。SATB2蛋白可通過抑制細胞外信號調節(jié)激酶5活性在結直結腸癌和胃癌中發(fā)揮腫瘤抑制劑的作用［6-7］。此外，在乳腺癌組織中SATB2基因表達高于正常組織［8］，而SATB2在乳腺癌中的功能以及作用機制尚不明了。本研究首先通過生物信息學調查SATB2表達與乳腺癌預后之間的關系，再通過基因轉染法探究SATB2對乳腺癌細胞的腫瘤生物學行為的影響并分析潛在的機制。

材料和方法

1 生物信息學分析

通過GEPIA數(shù)據(jù)庫獲取乳腺癌組織（n=182例）和正常乳腺組織（n=286 例）中SATB2的表達情況。通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫獲取基于SATB2表達［中位數(shù)法，分為高SATB2表達組（n=531例）和低SATB2表達組（n=533例）］對乳腺癌患者的總生存期（overall survival， OS）影響的曲線圖。通過STRING數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/）獲取影響SATB2表達的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡（protein-protein interaction networks， PPI），并分析核心基因。

2 臨床樣本獲取

納入接受乳腺癌根治術的20例臨床Ⅱ~Ⅲ級患者（首次確診，手術前未進行過任何相關治療），留存乳腺癌組織與癌旁非癌組織。本研究經過福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會醫(yī)學研究與臨床技術應用分會審查批準，倫理批號：閩醫(yī)大附一倫理醫(yī)研［2022］337。本研究招募的患者及其家屬對本研究目的、權利、獲益情況及其保密性等條款均知情且簽署了書面知情同意書。

3 主要試劑

DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自愛必信（上海）生物科技有限公司；靶向SATB2的siRNA（si-SATB2）、陰性對照siRNA（si-Con）、SATB2過表達質粒（SATB2）及空質粒（vector）、EndoFectin Max轉染試劑和iClickTMEdu Andy FluorTM488細胞成像分析試劑盒購自廣州復能基因有限公司；SATB2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A， VEGFA）、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2， MMP-2）、MMP-9、激活STAT蛋白抑制因子1（protein inhibitor of activated STAT 1， PIAS1）和組蛋白脫乙酰基酶1（histone deacetylase 1， HDAC1）兔源抗體購自成都正能生物技術有限責任公司；HRP-小鼠抗兔IgG購自西安百螢生物科技有限公司；SV超敏二步法免疫組化試劑盒購自西安中團生物科技有限公司。

4 實驗方法

4.1 免疫組織化學染色 將人臨床樣本留存的乳腺癌組織與癌旁非癌組織按照常規(guī)流程用石蠟包埋并切片（5 μm），按照免疫組化試劑盒說明書，依次脫蠟至水、滅活和封閉后，將組織切片與SATB2抗體（1∶200）在4 ℃孵育過夜。PBS洗滌組織切片，聚合HRP-標記抗兔IgG Ⅱ抗一起室溫溫育45 min后，PBS洗滌組織切片，與DAB顯色并用蘇木精復染。用ImageJ軟件自動評估SATB2表達情況。

4.2 細胞培養(yǎng)與轉染 人乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231及人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell， HUVEC）購自上海滬震實業(yè)有限公司，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度和無菌條件下分別用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。將生長狀態(tài)良好的MCF-7和MDA-MB-231細胞分別接種于6孔板（每孔4.0×105個）中，根據(jù)說明書步驟，使用EndoFectin Max轉染試劑分別轉染si-Con和si-SATB2，轉染后48 h后，收獲細胞用于后續(xù)實驗。取已轉染si-SATB2的MDA-MB-231細胞，用EndoFectin Max轉染試劑轉染SATB2過表達質粒以構建SATB2敲減細胞再回補SATB2的細胞模型。

4.3 EdU檢測 將乳腺癌細胞接種在6孔板中，加入EdU試劑孵育2 h，再按照說明書加入EDU檢測反應液并與室溫孵育30 min，加入DAPI染核，熒光顯微鏡下計數(shù)。

4.4 集落形成測定 將乳腺癌細胞按每孔500個接種在12孔板中，生長兩周后，4%多聚甲醛固定，用結晶紫染色，對集落計數(shù)。

4.5 細胞遷移和侵襲測定 用無血清培養(yǎng)液將乳腺癌細胞配制成懸液。取200 μL細胞懸液（含10 000個細胞）加入Transwell板或有Matrigel包膜的Transwell板的上室，分別進行遷移和侵襲測定。將700 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入底室。孵育24 h后，將遷移和侵入的細胞用4%多聚甲醛固定并用結晶紫染色。顯微鏡下，對染色的細胞拍照并計數(shù)。

4.6 招募內皮細胞的能力測定 收集已培養(yǎng)乳腺癌細胞48 h的培養(yǎng)液，取700 μL加入Transwell板的底室；取200 μL HUVEC懸液（含10 000個細胞，無血清培養(yǎng)液配制）加入Transwell板的上室，孵育24 h。按照上述方法進行結晶紫染色和計數(shù)。

4.7 內皮細胞成管能力的測定 用Matrigel對24孔板進行鋪板后，將HUVEC（每孔1×105個）接種至24孔板中，加入300 μL收集的已培養(yǎng)乳腺癌細胞48 h的培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h。顯微鏡下拍照，用ImageJ軟件量化HUVEC細胞的成管能力。

4.8 Western blot 用NETN緩沖液［20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA和0.5% Nonidet P-40］裂解轉染后的乳腺癌細胞，并以10 000×g離心10 min，收集蛋白質。每樣本各取40 μg蛋白經常規(guī)Western blot步驟分離和轉印蛋白。室溫孵育Ⅰ抗（SATB2、MMP-9和HDAC1抗體，1∶1 000；VEGFA抗體，1∶2 000；MMP-2抗體，1∶3 000；PIAS1抗體，1∶500；GAPDH抗體，1∶5 000）2 h。用TBST緩沖液洗滌后，室溫孵育HRP標記的小鼠抗兔IgG（1∶2 000）1 h。再次洗滌后，通過ECL增強的化學發(fā)光法顯像。用ImageJ軟件對蛋白的相對表達量進行分析。

5 統(tǒng)計學處理

用SPSS 18.0軟件將實驗中所得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析?；贕EPIA數(shù)據(jù)庫Ⅰ獲取乳腺癌中SATB2的表達水平表示為中位數(shù)和四分位數(shù)間距［median（Q1，Q3）］，兩組間比較用Wilcoxon秩和檢驗?；贙aplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫獲取的兩組乳腺癌OS曲線的比較用雙尾log-rank比較。細胞實驗的結果用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，兩組間比較用t檢驗；多組間用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較用Bonferrnoi法。臨床樣本數(shù)據(jù)表示為構成比，組間比較用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 SATB2在乳腺癌組織和腫瘤細胞系中表達情況

GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示乳腺癌中SATB2的表達高于正常乳腺組織（P<0.05，圖1A）。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫顯示SATB2高表達組的乳腺癌患者OS較低表達組普遍縮短（P<0.05，圖1B）。免疫組化結果（圖1C）顯示，SATB2蛋白定位于細胞核，與癌旁正常組織（陽性表達/陰性表達=2/18）比較，乳腺癌組織中SATB2蛋白表達（陽性表達/陰性表達=15/5）顯著升高（χ2=17.289，P<0.05），且呈彌漫陽性分布。

Figure 1. Expression of SATB2 in breast cancer tissues. A： GEPIA database showed that the expression of SATB2 in breast cancer tissue （n=182） was higher than that in normal breast tissue （n=286）. Median （Q1， Q3）. *P<0.05 vs normal breast tissue.B： Kaplan-Meier Plotter database showed that the overall survival（OS） of breast cancer patients with high SATB2 expression（n=531） was generally shorter than that of the patients with low SATB2 expression （n=533）. Mean±SD. #P<0.05 vs low SATB2 expression group. C： representative immunohistochemical staining images （scale bar=50 μm） of SATB2 in breast cancer and adjacent normal tissues， showing that SATB2 was diffusely positive in breast cancer tissues and negative in adjacent normal tissues.圖1 SATB2在乳腺癌組織中表達情況

2 敲減SATB2抑制乳腺癌細胞的增殖能力

用siRNA敲減兩種乳腺癌細胞（MCF7和MDAMB-231）中SATB2表達（圖2A）。與si-Con組相比，si-SATB2組EdU陽性細胞率（圖2B）和集落數(shù)（圖2C）均顯著降低（P<0.05）。

Figure 2. Knockdown of SATB2 inhibited the proliferation of breast cancer cells. A： the expression of SATB2 protein in MCF7 and MDA-MB-231 cells transfected with si-SATB2 was detected by Western blot； B： the proliferation of MCF7 and MDA-MB-231 cells transfected with si-SATB2 was detected by EdU staining （green： EdU； blue： DAPI； scale bar=100 μm）； C： the colony formation of MCF7 and MDA-MB-231 cells transfected with si-SATB2 was detected by colony formation assay.Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs si-Con group.圖2 敲減SATB2抑制乳腺癌細胞增殖

3 敲減SATB2抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲能力

Transwell實驗檢測敲減SATB2對兩種乳腺癌細胞（MCF7和MDA-MB-231）遷移和侵襲能力的影響，結果顯示，與si-Con組比較，si-SATB2組遷移和侵襲的乳腺癌細胞數(shù)均顯著減少（P<0.05），見圖3。

Figure 3. Knockdown of SATB2 inhibited the migration and invasion of breast cancer MCF-7（A） and MDA-MB-231（B） cells. Transwell assay was used to detect the the migration and invasion of the cells. Scale bar=50 μm. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs si-Con group.圖3 敲減SATB2抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲

4 敲減SATB2抑制乳腺癌細胞誘導的血管生成

Transwell實驗檢測敲減SATB2的乳腺癌細胞（MCF7和MDA-MB-231）對招募內皮細胞的影響，結果（圖4A）顯示，與si-Con組比較，si-SATB2組招募的HUVEC數(shù)顯著降低（P<0.05）。小管形成實驗檢測敲減SATB2的乳腺癌細胞誘導內皮細胞成管的能力，結果（圖4B）顯示，與si-Con組比較，si-SATB2組HUVEC細胞成管生成率顯著降低（P<0.05）。

Figure 4. Knockdown of SATB2 inhibited breast cancer cell-induced angiogenesis. A： Transwell assay was used to detect the effect of SATB2 knockdown on the recruitment of HUVEC to breast cancer cells； B： tube formation assay was used to detect the effect of SATB2 knockdown on breast cancer cell-induced tube formation of HUVEC. The scale bar=200 μm. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs si-Con group.圖4 敲減SATB2抑制乳腺癌細胞誘導的血管生成

5 敲減SATB2對VEGFA、MMP-2、MMP-9、PIAS1和HDAC1表達的影響

從STRING數(shù)據(jù)庫獲取基于SATB2的PPI網(wǎng)絡（圖5），通過進一步Matthews相關系數(shù)分析影響乳腺癌細胞增殖與遷移的核心基因為PIAS1和HDAC1。Western blot結果（圖6）顯示，與si-Con組比較，si-SATB2組乳腺癌細胞中VEGFA、MMP-2、MMP-9、PIAS1和HDAC1表達水平均顯著降低（P<0.05）。

Figure 5. SATB2-based PPI networks were obtained from the STRING database.圖5 從STRING 數(shù)據(jù)庫獲取基于SATB2的PPI網(wǎng)絡

Figure 6. Knockdown of SATB2 inhibited the expression of VEGFA， MMP-2， MMP-9， PIAS1 and HDAC1 in breast cancer cells. A：MCF-7 cells； B： MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs si-Con group.圖6 敲減SATB2抑制乳腺癌細胞中VEGFA、MMP-2、MMP-9、PIAS1和HDAC1表達

6 過表達SATB2對乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲、血管生成及相關蛋白表達的影響

用SATB2過表達質粒轉染SATB2敲減的MDAMB-231細胞以回補細胞中SATB2蛋白表達（圖7A）。與si-SATB2+vector組比較，si-SATB2+SATB2組MDA-MB-231細胞中VEGFA、MMP-2、MMP-9、PIAS1和HDAC1的表達（圖7A）、EdU陽性細胞率（圖7B）、集落（圖7C）、細胞遷移（圖7D）、細胞侵襲（圖7E）、招募HUVEC的能力（圖8A）和誘導HUVEC成管的能力（圖8B）均顯著增高（均P<0.05）。

Figure 7. Effects of SATB2 overexpression on the proliferation， migration， invasion and expressions of related-proteins in MDA-MB-231 cells. A： Western blot analysis was performed to detect the expressions of SATB2， PIAS1， HDAC1， VEGFA， MMP-2 and MMP-9 in each group； B： EdU staining was used to detect the proportion of EdU positive cells in each group； C： colony formation in each group was detected by colony formation assay； D： cell migration in each group was detected by Transwell assay； E： cell invasion in each group was detected by Transwell assay. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs si-Con+vector group； #P<0.05 vs si-SATB2+vector group.圖7 過表達SATB2對MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲及相關蛋白表達的影響

Figure 8. Effects of SATB2 overexpression on the angiogenesis of MDA-MB-231 cells. A： the recruitment of HUVEC to breast cancer cells was detected by Transwell assay； B： the breast cancer cell-induced tube formation of HUVEC was detected by tube formation assay. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs si-Con+vector group； #P<0.05 vs si-SATB2+vector group.圖8 過表達SATB2對MDA-MB-231細胞血管生成的影響

討論

探索影響乳腺癌轉移的關鍵分子有望為其治療提供新靶點。SATB2是具有CUT、同源框和PDZ結構域組成的多功能轉錄調節(jié)因子，其能參與調節(jié)顱面和骨骼發(fā)育、神經發(fā)生和腫瘤發(fā)生［9］。研究表明，SATB2蛋白的異常表達與多種腫瘤的進展有關，如SATB2蛋白在胃癌、肝癌、口腔癌和結直腸癌中表達上調［4-7，10-11］，發(fā)揮促癌作用；而在肺癌中表達下調，發(fā)揮揮抑癌作用［12］。而SATB2蛋白在乳腺癌中的功能仍然未知。本研究顯示，在乳腺癌中SATB2表達上調，且SATB2高表達與乳腺癌患者的總生存期縮短有關，此外，敲減SATB2能抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移與侵襲以及細胞中MMP-2和MMP-9表達；而過表達SATB2則反之。以上結果提示，SATB2在乳腺癌中發(fā)揮促癌作用，靶向敲減其表達可能是抑制乳腺癌轉移的潛在的可行策略。

腫瘤微血管形成是腫瘤細胞發(fā)生轉移的關鍵步驟之一，抑制腫瘤微血管形成能降低腫瘤生長以及遠端轉移的能力［13］。本研究顯示，敲減SATB2能導致乳腺癌對內皮細胞的招募能力及誘導成管能力降低。VEGFA是誘導血管生成與血管發(fā)生的關鍵刺激因子，也是促進細胞增殖與遷移的關鍵蛋白［14］。本研究表明敲減SATB2能抑制乳腺癌細胞中VEGFA表達，這一結果提示敲減SATB2導致的VEGFA表達降低可能是其抑制腫瘤微血管生成的原因之一，但SATB2與VEGFA二者之間是直接關系還是間接關系仍有待進一步確定。

本研究進一步探討敲減SATB2抑制乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲與腫瘤血管形成的機制。STRING數(shù)據(jù)庫顯示，影響SATB2表達的核心基因為PIAS1和HDAC1。PIAS1是STAT轉錄活性的抑制蛋白，能通過抑制JAK-STAT轉導進而抑制腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲與血管生成［15-16］。PIAS1也可通過SUMO化修飾、泛素化修飾、磷酸化修飾等多種途徑介導多種信號通路來抑制腫瘤細胞的惡性生物學行為［17］。此外，PIAS1可通過發(fā)揮架構蛋白的作用來招募HDAC1，抑制下游SMAD3轉錄活性［18］。已有研究顯示，HDAC1在乳腺癌中高表達，抑制其表達能抑制增殖、遷移、侵襲與血管生成［19］。本研究顯示，敲減SATB2能抑制乳腺癌細胞PIAS1與HDAC1表達，這可能是其抑制增殖、遷移、侵襲與血管生成的機制之一。

綜上所述，本研究證實了SATB2在乳腺癌中表達上調，敲減SATB2可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成。此外，本研究還提示SATB2可能是潛在的乳腺癌治療的新靶點。