駱遠(yuǎn)， 宋詩語， 趙格，3， 彭爽， 李良鳴△， 劉淑靖△

（1廣州體育學(xué)院，廣東 廣州 510500；2廣州理工學(xué)院，廣東 廣州 510540；3廣東科技學(xué)院，廣東 東莞 523083）

隨著生活水平的提高，人口老齡化已成為重要的社會問題。同時，隨著年齡的增長與年齡相關(guān)的疾病患病率也會提高，如糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和腫瘤等［1-2］。衰老是宏觀的范疇，究其根本即細(xì)胞衰老。氧化應(yīng)激、DNA損傷、端?？s短和線粒體功能障礙等都參與細(xì)胞衰老過程［3-4］。DNA損傷反應(yīng)（DNA-damage response， DDR）和修復(fù)機(jī)制是DNA損傷積累、細(xì)胞衰老和生物體衰老的關(guān)鍵機(jī)制。近年研究顯示，細(xì)胞分裂周期蛋白42（cell division cycle protein 42， Cdc42）參與DDR和修復(fù)機(jī)制，其在維持基因組穩(wěn)定及衰老過程中發(fā)揮重要作用［5-6］。Cdc42過度激活可引起基因組不穩(wěn)定和過早衰老的表型［7］；抑制Cdc42表達(dá)可使衰老的造血干細(xì)胞恢復(fù)到年輕時的狀態(tài)［8］。以上證據(jù)表明，Cdc42活性與衰老之間存在功能聯(lián)系。

海馬體是學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能的關(guān)鍵中樞，衰老可導(dǎo)致海馬體神經(jīng)元再生功能衰退，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能減退及多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生［9-11］。研究表明，運(yùn)動有抗衰老的作用，其可刺激大腦可塑性，改善認(rèn)知功能，避免多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和進(jìn)展［12-13］。而青少年時期的定期身體鍛煉，在預(yù)防老年期認(rèn)知障礙、提高大腦自我修復(fù)能力等方面也發(fā)揮重要的有益作用［14-15］，但這種有益作用的機(jī)制尚未明確。因此，本研究構(gòu)建運(yùn)動小鼠模型，分析長期有氧運(yùn)動對小鼠海馬體Cdc42及DDR相關(guān)因子的短期和長期影響，探索運(yùn)動引起Cdc42表達(dá)改變參與細(xì)胞衰老的機(jī)制，為青年期進(jìn)行長期的體育鍛煉可維持老年期大腦健康提供參考資料。

材料和方法

1 小鼠模型建立及分組

40只8周齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠，體重20~25 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2018-0002。實(shí)驗(yàn)小鼠在清潔級動物房內(nèi)分籠飼養(yǎng)。動物房溫度控制在20~24℃，相對濕度控制在40%~70%，自由飲水和攝食。動物房內(nèi)正常晝夜自然光照，定期觀察小鼠的生活和毛發(fā)狀況。本研究中動物飼養(yǎng)的要求和操作規(guī)范都符合中華人民共和國《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定，并獲得廣州體育學(xué)院動物保護(hù)與使用專業(yè)委員會（2021DWLL-05）批準(zhǔn)。

將40只小鼠隨機(jī)分為安靜組和運(yùn)動組，每組20只，均使用普通飼料喂養(yǎng)。運(yùn)動組小鼠參考既往文獻(xiàn)造模方法［16］，進(jìn)行12周的中等強(qiáng)度（75% VO2max）跑臺運(yùn)動，每周運(yùn)動5 d，每天運(yùn)動1 h；安靜組小鼠在不跑步的情況下暴露于跑步機(jī)噪聲和振動中。12周訓(xùn)練結(jié)束后，從安靜組和和運(yùn)動組中隨機(jī)選取小鼠各10只（5月齡），分別為安靜青年期小鼠（Sedyoung）組和運(yùn)動青年期小鼠（Exe-young）組，于運(yùn)動干預(yù)結(jié)束后3 d收集數(shù)據(jù)及海馬體組織；剩余的10只安靜組小鼠和10只運(yùn)動組小鼠繼續(xù)喂養(yǎng)至老年期（18月齡）［17］，分別為安靜老年期小鼠（Sed-old）組和運(yùn)動老年期小鼠（Exe-old）組，收集數(shù)據(jù)及海馬體組織。

2 方法

2.1 小鼠體成分及Y迷宮測試 使用Echo MRI動物體成分儀（EchoMRI-500H）獲取和分析小鼠體成分，包括體重、瘦體重和體脂率等，其應(yīng)用原理為核磁共振（NMR）技術(shù)。

Y迷宮可評估小鼠的學(xué)習(xí)和空間記憶能力，而自主交替行為是衡量小鼠空間記憶能力的標(biāo)準(zhǔn)。參考既往文獻(xiàn)中的Y迷宮自主交替實(shí)驗(yàn)方法［18］，分析有氧運(yùn)動對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響：以起始臂為起點(diǎn)，逆時針方向分別標(biāo)記為A、B、C臂。調(diào)試Y迷宮周圍的光照，通過攝像頭可觀察到明顯的光暗對比度。測試原理：利用小鼠對新環(huán)境探索的天性，小鼠會進(jìn)入Y迷宮各臂探索，憑記憶做出正確的選擇可有效地評價其空間工作記憶能力。將小鼠從起始臂的末端（A臂）放入，記錄小鼠在10 min內(nèi)進(jìn)入各臂的總次數(shù)和順序。當(dāng)相鄰的三次進(jìn)臂順序不重復(fù)時（ABC， ACB， BAC， BCA， CAB， CBA）為完成一次正確的交替反應(yīng)。統(tǒng)計(jì)正確交替反應(yīng)次數(shù)，計(jì)算自主交替率（%）=［正確交替反應(yīng)次數(shù)/（N-2）］×100%，N=進(jìn)臂次數(shù)的總和。每只小鼠測試結(jié)束后，應(yīng)將小鼠殘留在Y迷宮內(nèi)的糞便和尿液處理干凈，使用毛巾擦拭Y迷宮清除小鼠殘留的氣味，避免對下一只小鼠的測試造成干擾。

2.2 Western blot 將小鼠的海馬體放入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑（Beyotime Biotechnology）的RIPA裂解液（100 mmol/L NaCl， 20 mmol/L Tris， pH 8.0， 1 mmol/L EDTA， pH 8.0， 0.5% Triton X-100，and 0.5% Nonidet P-40）中，在冰上勻漿裂解。使用BCA蛋白檢測試劑盒（Pierce）對海馬組織進(jìn)行定量。經(jīng)蛋白變性后，將等量的蛋白在12%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后用5%的脫脂牛奶進(jìn)行封閉。封閉結(jié)束后用Cdc42抗體（Cat#： 21010， NewEast Biosciences， CN）和β-actin抗體（Cat#： 60008-1-Ig， ProteinTech Group）在4 ℃條件下孵育。與Ⅱ抗（Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti Mouse IgG or Anti Rabbit IgG， ProteinTech Group）在室溫下孵育2 h。孵育結(jié)束后，化學(xué)發(fā)光法顯色，用ImageJ圖像分析軟件獲取定量數(shù)據(jù)。

2.3 RT-qPCR 使用HiPure Universal RNA Kit試劑盒（Magen）提取小鼠海馬體的總RNA。使用Nanodrop Lite（Thermo Fisher Scientific）儀器對提取的RNA進(jìn)行濃度檢測，采用SYBR法（TaKaRa）和Appllied Biosystems 7500 Real Time PCR System（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR測定。用β-actin對相對周期閾值（Ct）進(jìn)行歸一化。所用引物序列見表1。

2.4 Cdc42活性Pull-Down 實(shí)驗(yàn) 使用Cdc42活性Pull-Down試劑盒（Wuhan NewEast Biotechonology Co.Ltd）檢測小鼠海馬體Cdc42-GTP水平，分析Cdc42活性情況［19］。配制1×分析/裂解緩沖液：將5×原液簡單混合，在去離子水中稀釋至1×，每1 mL 1×裂解液加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑各0.02 mL。往EP管中加入0.35 mL配好的1×裂解液。將取出的新鮮組織放入裂解液中充分研磨，結(jié)束后靜置10 min。靜置后以4 ℃、13 000×g條件下離心15 min。使用BCA試劑盒測出濃度，算出0.8 mg所需要的樣本量，然后用1 mL減去樣本量，得出需要加入的1×裂解液的量并定容至1 mL。在EP管中加入2 μL的Cdc42活性抗體，然后在4 ℃條件下裝在圓盤旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育90 min。孵育結(jié)束后，將A/G蛋白瓊脂糖珠漿混勻后加入0.02 mL至EP管中（每支試管在加入前都需要將A/G蛋白瓊脂糖珠漿混勻）。加入珠漿后繼續(xù)在4 ℃條件下的圓盤旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育90 min。孵育結(jié)束后在室溫5 000×g離心1 min，舍棄上清液，留下珠漿。加入0.5 mL的1×裂解液后在室溫5 000×g離心1 min，舍棄上清液，留下珠漿，重復(fù)3次。洗滌結(jié)束后舍棄上清液，將珠子轉(zhuǎn)移至0.025 mL的2×還原SDS-PAGE中以100 ℃條件變性8 min。在5 000×g條件下離心10 s，靜置2 min，吸取上清液至新的EP管中，上清液為Cdc42-GTP樣本。Western blot法測定Cdc42-GTP表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)一用SPSS 25.0對所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)，分析結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。制圖使用GraphPad Prism 9.0軟件。

結(jié)果

1 建模后小鼠體重及體成分的基本情況

對建模后的各組小鼠體重及體成分等基本情況進(jìn)行分析，結(jié)果可見，在普通飼料喂養(yǎng)的情況下青年期和老年期小鼠的體重和瘦體重?zé)o顯著差異（P>0.05），但有氧運(yùn)動可有效降低青年期小鼠體內(nèi)脂肪量和體脂率（P<0.05），并且在停止運(yùn)動干預(yù)后仍可維持至老年期（P<0.05或P<0.01），見圖1。

Figure 1. Changes in body weight and body composition in mice of each group. A： body composition was measured in Sed-young and Exe-young groups； B： body composition was measured in Sed-old and Exe-old groups. Mean± SEM. n=8. *P<0.05 vs Sedyoung group； #P<0.05， ##P<0.01 vs Sed-old group.圖1 各組小鼠體重、體成分變化

2 長期有氧運(yùn)動提高小鼠學(xué)習(xí)和空間記憶能力

Y迷宮自主交替實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2A），與安靜組相比，12周有氧運(yùn)動干預(yù)可顯著提高所有運(yùn)動組小鼠的Y迷宮自主交替正確率（P<0.05）；而把上述部分小鼠繼續(xù)喂養(yǎng)至老年期（18周齡）后，仍可觀察到運(yùn)動老年期小鼠的Y迷宮自主交替正確率高于安靜老年期小鼠（P<0.05），見圖2B。

Figure 2. Comparison of the Y-maze spontaneous alternation in mice of each group. A： Y-maze of Sed-young and Exe-young groups （n=18）； B： Y-maze of Sed-old and Exe-old groups （n=9）. Mean±SEM. *P<0.05 vs Sedyoung group； #P<0.05 vs Sed-old group.圖2 各組小鼠Y迷宮自主交替率比較

3 長期有氧運(yùn)動抑制小鼠海馬體Cdc42表達(dá)及活性

對運(yùn)動干預(yù)后不同時期（青、老年）小鼠海馬體Cdc42表達(dá)水平分析顯示，與安靜青年期小鼠比較，運(yùn)動青年期小鼠海馬體Cdc42表達(dá)顯著減少（P<0.01）；與安靜老年期小鼠比較，運(yùn)動老年期小鼠海馬體Cdc42表達(dá)也顯著減少（P<0.01）。對運(yùn)動干預(yù)后不同時期（青、老年）小鼠海馬體Cdc42活性分析顯示，運(yùn)動青年期小鼠海馬體Cdc42-GTP水平顯著低于安靜青年期（P<0.05）；運(yùn)動老年期小鼠海馬體Cdc42-GTP水平也顯著低于安靜老年期（P<0.05）。見圖3。

Figure 3. Comparison of Cdc42 protein levels and Cdc42 activity in mice of each group. A： Western blot of Cdc42 protein levels and pull-down assay of Cdc42-GTP in Sed-young and Exe-young groups； B： Western blot of Cdc42 protein levels and pull-down assay of Cdc42-GTP in Sed-old and Exe-old groups. The relative levels of Cdc42 and Cdc42-GTP were normalized to β-actin， and the relative protein levels in the Sed-young or Sed-old group were normalized as “1”. WB： Western blot. Mean±SEM. n=4~6. *P<0.05， **P<0.01 vs Sed-young group； #P<0.05， ##P<0.01 vs Sed-old group.圖3 各組小鼠Cdc42的表達(dá)量及活性比較

4 長期有氧運(yùn)動抑制小鼠海馬體DDR相關(guān)因子的表達(dá)

對運(yùn)動干預(yù)后不同時期（青、老年）小鼠海馬體Cdc42及DDR相關(guān)因子mRNA水平分析顯示，與安靜青年期小鼠相比，運(yùn)動青年期小鼠海馬體Cdc42、Pak4、Pak5、Cofilin、Atm、Chk2和P53等基因轉(zhuǎn)錄水平降低（P<0.01）；與安靜老年期小鼠相比，運(yùn)動老年期小鼠海馬體Cdc42、Pak4、Pak5和P53等基因轉(zhuǎn)錄水平降低（P<0.05或P<0.01），見圖4。

Figure 4. The mRNA expression of Cdc42 and DDR-related genes in mice of each group. A： RT-qPCR showed the mRNA expression of Cdc42 and DDR-related genes in Sed-young and Exe-young groups； B： RT-qPCR showed the mRNA expression of Cdc42 and DDR-related genes in Sed-old and Exe-old groups. The relative levels of these genes were normalized to β-actin， and the relative mRNA levels in the Sed-young or Sed-old group were normalized as “1”. Mean±SEM. n=6. **P<0.01 vs Sedyoung group； #P<0.05， ##P<0.01 vs Sed-old group.圖4 各組小鼠Cdc42及DDR相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平比較

討論

衰老是一個普遍且不可避免的、由遺傳和環(huán)境因素相互作用的生物學(xué)過程。盡管衰老及死亡不可避免，但目前已有大量文獻(xiàn)提出各種延緩衰老的干預(yù)措施。長期身體活動不足或久坐不動的生活方式是引起健康問題的重要原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，積極參加體育鍛煉可促進(jìn)健康老齡化［20］。因此，運(yùn)動是對抗衰老的有效手段之一。本研究通過構(gòu)建長期有氧運(yùn)動小鼠模型，分析有氧運(yùn)動對青年期小鼠海馬體的短期和長期影響。在普通飼料條件下，青年期小鼠通過長期有氧運(yùn)動干預(yù)，可顯著降低小鼠體脂率，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致［21］；但在停止運(yùn)動干預(yù)后繼續(xù)喂養(yǎng)小鼠至老年期，可觀察到小鼠體脂率的改變并沒有隨著年齡的增長而消失，表明運(yùn)動對身體影響可能是終生的，或至少可維持一段較長的時間。

近幾十年來，衰老機(jī)制的研究層面已從大體器官發(fā)展到細(xì)胞分子。Cdc42是真核細(xì)胞中的小分子Rho GTP酶，其功能包括肌動蛋白細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞極性和細(xì)胞生長［22-23］。Cdc42有激活和失活兩種狀態(tài)，當(dāng)與GTP結(jié)合時為激活狀態(tài)，Cdc42活性可影響其功能的發(fā)揮。研究表明，隨著年齡的增長，Cdc42在各個組織的表達(dá)和活性都會增加［7］，并參與年齡相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展［24-25］。此外，有證據(jù)表明，增加Cdc42表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)元突觸生長［26］。在老化的造血干細(xì)胞中，通過抑制Cdc42的表達(dá)可使衰老的造血干細(xì)胞恢復(fù)到年輕時的狀態(tài)［8］；而運(yùn)動也可促進(jìn)小鼠造血干細(xì)胞造血重建能力［27］。再如，通過短期的藥理學(xué)抑制Cdc42的活性可普遍延長小鼠的平均壽命［28］；而運(yùn)動干預(yù)后同樣能夠改變Cdc42的表達(dá)［29］。以上表明，Cdc42在各組織細(xì)胞中有不同作用，尤其在調(diào)控細(xì)胞衰老中發(fā)揮重要作用。與以往研究相似，在本研究中（圖3），青年時期的有氧運(yùn)動可短期和長期影響小鼠海馬體Cdc42的表達(dá)和活性，提示運(yùn)動可能通過抑制Cdc42的表達(dá)和活性，參與抗衰老的過程。這預(yù)示著有氧運(yùn)動的影響可能與Florian的藥理治療［28］有類似的效果，即早期對小鼠進(jìn)行運(yùn)動或藥物干預(yù)可對小鼠產(chǎn)生長期的有利影響，甚至可能延長小鼠的壽命。

DNA損傷是引起細(xì)胞衰老的重要因素。在正常情況下，DNA損傷會在24 h內(nèi)被修復(fù)，以確保功能失調(diào)的遺傳信息不會傳遞給后代細(xì)胞，因此基因組的完整性可以得到保護(hù)［30-31］；若DNA損傷病灶未被修復(fù)，細(xì)胞則會留下持久的DNA損傷焦點(diǎn)，這種沒有修復(fù)跡象的病灶是衰老表型的特征，也是衰老本身的原因［30］。而DDR和修復(fù)機(jī)制在DNA損傷引起細(xì)胞衰老的機(jī)制中發(fā)揮重要作用。Cdc42參與調(diào)控DDR和修復(fù)機(jī)制，其可激活DDR相關(guān)因子Pak4/5和Cofilin，調(diào)節(jié)Atm、Chk2和P53等蛋白的磷酸化狀態(tài)，從而影響DDR介導(dǎo)的DNA損傷信號傳導(dǎo)，在衰老過程中發(fā)揮重要作用［6］。但以上過程在Cdc42過度激活的狀態(tài)下可出現(xiàn)異常改變。

Pak4可作為Cdc42的效應(yīng)物在Cdc42介導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定性反應(yīng)中發(fā)揮作用［32］。Pak5雖有報(bào)導(dǎo)可以減弱Chk2磷酸化，但具體機(jī)制尚不明確［33］。DNA損傷可誘導(dǎo)肌動蛋白重組，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯。而Cofilin對DNA損傷修復(fù)的影響已經(jīng)被證實(shí)［34］。在DNA損傷后，通過Cofilin的磷酸化可調(diào)節(jié)肌動蛋白的動力學(xué)，從而執(zhí)行細(xì)胞G2/M期停滯的功能［35］。DNA雙鏈斷裂后可募集并激活A(yù)tm，磷酸化的Atm進(jìn)而調(diào)節(jié)Chk2和P53，激活DNA修復(fù)過程，誘導(dǎo)細(xì)胞S、G1和G2期停滯［36］。此外，P53是衰老相關(guān)的標(biāo)志性蛋白，當(dāng)Chk2表達(dá)異常時也會導(dǎo)致P53的積累［37］。因此，任何原因引起上述DDR相關(guān)因子的過度表達(dá)，都可能導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，影響細(xì)胞的復(fù)制壽命，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。在本研究中，經(jīng)過有氧運(yùn)動干預(yù)的小鼠海馬體Cdc42表達(dá)及活性低于對照組，提示當(dāng)細(xì)胞面臨DNA損傷時，有氧運(yùn)動可抑制Cdc42的過度激活，使Atm、Chk2、P53等因子響應(yīng)正常的DNA損傷修復(fù)過程，避免無效的修復(fù)及進(jìn)入衰老復(fù)制。再如，本研究經(jīng)過運(yùn)動干預(yù)后可以降低小鼠海馬體P53基因的表達(dá)，且這種效果可維持至老年期，說明有氧運(yùn)動可能通過減少DNA損傷或增強(qiáng)DNA修復(fù)的方式起抗衰老的作用。

運(yùn)動可以改善腦認(rèn)知功能［38-39］。但值得注意的是，在不同時期進(jìn)行運(yùn)動可對認(rèn)知能力、海馬體神經(jīng)元生長和樹突棘的形成產(chǎn)生不同的影響。研究顯示，相比較成年后進(jìn)行運(yùn)動的實(shí)驗(yàn)鼠，青春期進(jìn)行運(yùn)動的實(shí)驗(yàn)鼠雖然Y迷宮自發(fā)交替率減少，但其海馬體神經(jīng)元和樹突棘的數(shù)量顯著增多［40］。在本實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)觀察中，有氧運(yùn)動可顯著提高青年期小鼠的自主交替正確率，提高空間記憶能力。而在停止運(yùn)動干預(yù)后將小鼠繼續(xù)喂養(yǎng)至老年期，對照組與運(yùn)動組小鼠的自主交替正確率仍有差異，表明運(yùn)動改善認(rèn)知功能的作用可從小鼠的青年期維持至老年期，并且可能通過延緩海馬體神經(jīng)元細(xì)胞衰老改善認(rèn)知功能。因此，早期進(jìn)行運(yùn)動除了能產(chǎn)生長期有益的影響外，越早進(jìn)行運(yùn)動可能會帶來更好的效果，但需要更多的證據(jù)支持。

綜上所述，長期有氧運(yùn)動可有效增強(qiáng)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶，抑制海馬體Cdc42及DDR相關(guān)因子的表達(dá)，保護(hù)小鼠海馬體神經(jīng)元細(xì)胞免受DNA損傷而死亡或衰老直至老年期。因此，本研究主要從Cdc42參與調(diào)控DDR及修復(fù)機(jī)制方面探討青年期有氧運(yùn)動干預(yù)對小鼠的短期和長期影響，為運(yùn)動延緩衰老提供了新證據(jù)。然而，Cdc42活性增強(qiáng)是否為衰老的誘導(dǎo)因素，運(yùn)動延遲衰老的進(jìn)展是否通過抑制Cdc42的活性以及其具體機(jī)制如何，這在今后的研究中都是值得探討的。