劉孟涵， 吳藝帆， 劉云婷， 王翎灃， 鞏俐， 劉嘉， 楊小蕊， 劉雪梅

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100029）

卒中是臨床最常見的腦血管疾病，是我國成年人首要致死及致殘病因，2020年我國40歲以上人群卒中死亡患者約230萬，其中缺血性卒中占卒中的62.4%~77.8%，給患者、家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)［1-2］。缺血性卒中是由于腦血管栓塞，血液供應(yīng)中斷，造成局部腦組織缺血缺氧甚至壞死，然而臨床上觀察到即使恢復(fù)血液供應(yīng)仍然會導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)細胞死亡和神經(jīng)功能障礙，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury， CIRI），若不進行干預(yù)或干預(yù)不及時可加重腦組織損傷。目前研究認為炎癥級聯(lián)反應(yīng)在CIRI中起著關(guān)鍵作用，可導(dǎo)致“損傷-炎癥-再損傷”的惡性循環(huán)［3-4］。因此，通過調(diào)控炎癥反應(yīng)研究CIRI的發(fā)病機制及治療方法，對于改善患者預(yù)后和提升生活質(zhì)量具有重要的意義。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3）炎癥小體由NLRP3、含caspase募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain， ASC）和pro-caspase-1蛋白組成，通過調(diào)控白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）和IL-18的成熟和釋放，促進炎癥反應(yīng)，加重CIRI［5］。研究證實微小RNA-223-3p（microRNA-223-3p， miR-223-3p）可直接靶向結(jié)合NLRP3的3′-UTR調(diào)控NLRP3，參與炎癥反應(yīng)，miR-223-3p過表達可發(fā)揮神經(jīng)保護作用［6-7］。清腦滴丸（Qingnao dripping pills， QNDP）由梔子、三七和冰片三味中藥組成，具有清熱活血，醒神開竅之功效。本團隊前期研究已證實QNDP能夠降低CIRI大鼠的神經(jīng)元凋亡，減少腦缺血體積，改善神經(jīng)功能癥狀，降低炎癥反應(yīng)而發(fā)揮神經(jīng)保護作用［8］。然而QNDP如何調(diào)控神經(jīng)炎癥值得進一步研究。因此本項目通過建立腦缺血再灌注損傷大鼠模型，探討QNDP是否通過miR-223-3p介導(dǎo)NLRP3炎癥小體信號通路對CIRI大鼠發(fā)揮抗炎作用，為其臨床治療缺血性卒中提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 動物

6周齡雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量（200±20） g，97只，購自中國食品藥品檢定研究院，許可證號為SCXK（京）2022-0002，所有大鼠均在北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動物房飼養(yǎng)，室溫24~26 ℃，相對濕度50%~60%，自由飲水、飲食，光晝交替12 h。本實驗方案通過北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動物倫理委員會批準（No. DFYY202208）。

2 主要藥物與試劑

QNDP（北京同仁堂股份有限公司科學(xué)研究所）；栓線（北京西農(nóng)科技有限公司）；Trizol總RNA提取試劑（天根生化科技北京有限公司）；Reverse Transcriptase M-MLV、SYBR?Premix Ex Taq? Ⅱ （Tli RNaseH Plus）；預(yù)染蛋白Marker（Amersham）；NLRP3抗體和cleaved caspase-1抗體（Proteintech）；ASC抗體（ImmunoWay）；GAPDH抗體（Cell Signaling Technology）；Alexa Fluor標記的羊抗兔Ⅱ抗（Abcam）；IL-18和IL-1β試劑盒（南京建成生物工程研究所）；antagomiR-223-3p引物設(shè)計、合成委托蘇州吉瑪基因股份有限公司完成。

3 主要儀器設(shè)備

R530小動物麻醉機（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；大鼠數(shù)顯腦立體定位儀（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司）；7300 RT-PCR儀（AppliedBiosysterms）；Mini Blot Module小型轉(zhuǎn)印模塊（ThermoScientific）；BOX Chemi XX9型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Gene）；CM1900冷凍切片機（LEICA）；BX53F熒光顯微鏡（OLYMPUS）。

4 方法

4.1 側(cè)腦室注射antagomiR-223-3p 大鼠禁食不禁水12 h，采用1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，充分暴露前囟點，大鼠俯臥位固定于數(shù)顯腦立體定位儀，調(diào)整定位并使微量注射器針尖對準囟點向后1.1 mm，中線左旁開1.5 mm，用微型顱骨鉆小心鉆孔，將微量注射器插入顱內(nèi)4.5 mm注射antagomiR-223-3p 10 μL，1 μL/min，留針5 min，骨蠟封閉注射孔，縫合皮膚，24 h后制備CIRI模型。

4.2 動物模型制備 參考Longa法改良建立大鼠大腦中動脈栓塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion， MCAO/R）模型模擬CIRI［9］。造模前大鼠禁食不禁水12 h，采用4%~5%異氟烷氣體吸入誘導(dǎo)麻醉，再以1%異氟烷氣體吸入維持麻醉，將大鼠仰臥位固定，頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈，暫時夾閉頸總動脈遠心端，在頸總動脈靠近遠心端位置剪一斜口，插入頭端直徑為0.24 mm的栓線，有阻力感時停止插入，此時插入深度約為（1.8±0.2）cm，造成大腦中動脈供血相關(guān)區(qū)的缺血，栓塞1.5 h后，拔出栓線再灌注24 h。Sham組僅將栓線插入1 cm，余操作同模型組。術(shù)后注意肛溫，正常喂養(yǎng)。大鼠術(shù)后6 h進行Longa評分，評分1~3分視為造模成功，隨機納入實驗各組。實驗過程中，因麻醉、手術(shù)等原因死亡4只，Longa評分不符合要求的3只，均不入組。

4.3 實驗分組、給藥 MCAO/R大鼠隨機分為CIRI模型（MCAO/R）組、MCAO/R+QNDP組、MCAO/R+antagomiR-223組和MCAO/R+QNDP+antagomiR-223組，另設(shè)假手術(shù)（sham）組作為對照，共5組，每組18只。每組隨機取6只大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分；隨后6只取大腦用于TTC染色和腦含水量檢測；3只取大腦用于免疫熒光染色檢測；3只取缺血側(cè)皮層用于RT-qPCR和Western blot檢測；6只取缺血側(cè)皮層用于ELISA檢測。MCAO/R+QNDP組和MCAO/R+QNDP+antagomiR-223組均灌胃給予QNDP （150 mg/kg），從MCAO/R術(shù)后2 h給藥1次，間隔10 h給藥1次，末次給藥2 h后進行指標觀察，余各組給予等體積的蒸餾水。

4.4 Garcia評分法測定大鼠神經(jīng)功能缺損程度 由對本實驗設(shè)計不知情者對所有大鼠進行Garcia評分［10］。觀察大鼠自主運動狀態(tài)，得分越低表示神經(jīng)功能缺損越嚴重，最高得分18分表示功能正常，最低得分3分表示損傷最嚴重。

4.5 TTC染色法觀察大鼠腦缺血體積 大鼠大腦自額極開始行冠狀切片，共切5片，每片約2 mm。將腦片放入2% TTC染液中，37 ℃避光水浴孵育30 min，取出切片，進行拍照。缺血腦組織呈白色，采用ImageJ軟件對TTC染色照片進行統(tǒng)計分析，腦缺血體積比（%）=（各腦切片缺血面積×切片厚度之和）/（各腦切片的總面積×切片厚度之和）×100%。

4.6 干濕重法檢測大鼠腦含水量 完整大腦取出后先快速稱重，再將其置于110 ℃干燥箱中烘烤24 h，取出稱干重，按照Billiot公式計算腦含水量：腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

4.7 RT-qPCR法測定miR-22-3p表達 采用Trizol法提取皮層RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。取1 μg RNA采用Reverse Transcriptase MMLV進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，再進行實時熒光定量PCR擴增。擴增條件：95 ℃ 30 s；92 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40個循環(huán)。miR-223-3p的上游引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAATAC-3′，下游引物序列為5′-TCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGGGTAT-3′；內(nèi)參照U6的上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-ΔΔCt法進行定量分析。

4.8 Western blot法檢測NLRP3、ASC和cleaved caspase-1蛋白表達 采用RIPA裂解液提取皮層總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10% SDS-PAGE分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶進行封閉1 h，加入兔多克隆NLRP3抗體（1：500）、兔多克隆ASC抗體（1∶1 000）和兔多克隆cleaved caspase-1抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加入羊抗兔IgG-HRP Ⅱ抗（1∶1 000），室溫搖床1 h，ECL顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。應(yīng)用ImageJ軟件進行蛋白條帶灰度值分析。

4.9 免疫熒光法觀察NLRP3在缺血側(cè)皮層中的分布 大鼠采用多聚甲醛灌注固定后，取大腦行冰凍切片（厚度30 μm）。選用山羊血清和5% BSA進行封閉1.5 h，加入兔多克隆NLRP3 Ⅰ抗（1∶300），4 ℃過夜孵育，加入羊抗兔Alexa Fluor Ⅱ抗（1∶2 000），含DAPI的防熒光淬滅封片劑進行封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。應(yīng)用ImageJ軟件進行分析。

4.10 ELISA法檢測IL-1β和IL-18的水平 取皮層按重量體積比加生理鹽水制成10%的組織勻漿，嚴格按照IL-1β和IL-18的ELISA測定試劑盒說明書進行操作。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0進行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布或近似符合的計量資料用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。若方差齊，多組間采用單因素方差分析（oneway ANOVA）進行多組間比較，采用LSD檢驗進行組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett′s T3檢驗法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 QNDP對大鼠神經(jīng)功能損傷評分的影響

與sham組比較，MCAO/R組大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低（P<0.01）；與MCAO/R組相比，MCAO/R+QNDP組大鼠神經(jīng)功能評分顯著升高（P<0.01），antagomiR-223組大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低（P<0.01）；與MCAO/R+QNDP組比較，MCAO/R+QNDP+antagomiR-223組大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低（P<0.01），見圖1。

Figure 1. The neurological deficit scores of the rats in each group.Mean±SD. n=6. ##P<0.01 vs sham group； **P<0.01 vs MCAO/R group； △△P<0.01 vs MCAO/R+QNDP group.圖1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分

2 QNDP對大鼠腦缺血體積的影響

與sham組比較，MCAO/R 組大鼠缺血側(cè)白色區(qū)域顯著增大，腦缺血體積明顯增加（P<0.01）；與MCAO/R組相比，MCAO/R+QNDP組大鼠腦缺血體積顯著降低（P<0.01），而MCAO/R+antagomiR-223組顯著增加（P<0.01）；與MCAO/R+QNDP組比較，MCAO/R+QNDP+antagomiR-223組大鼠腦梗死體積顯著增加（P<0.01），見圖2。

Figure 2. The cerebral infarct volume of the rats in each group （TTC staining）. Mean±SD. n=6. ##P<0.01 vs sham group； **P<0.01 vs MCAO/R group； △△P<0.01 vs MCAO/R+QNDP group.圖2 各組大鼠腦缺血體積

3 QNDP對大鼠腦含水量的影響

與sham組比較，MCAO/R組大鼠腦含水量增加（P<0.05）；與MCAO/R組相比，MCAO/R+QNDP組大鼠腦含水量顯著降低（P<0.01）；MCAO/R+antagomiR-223組大鼠腦含水量升高（P<0.05）；與MCAO/R+QNDP組比較，MCAO/R+QNDP+antagomiR-223組大鼠腦含水量升高（P<0.05），見圖3。

Figure 3. The brain water content of the rats in each group.Mean±SD. n=6. #P<0.05 vs sham group； *P<0.05，**P<0.01 vs MCAO/R group； △P<0.05 vs MCAO/R+QNDP group.圖3 各組大鼠腦含水量

4 QNDP對缺血皮層miR-223-3p表達的影響

與sham組相比，MCAO/R組缺血側(cè)皮層區(qū)miR-223-3p表達顯著上調(diào)（P<0.01）；與MCAO/R組比較，MCAO/R+QNDP組大鼠miR-223-3p表達增加（P<0.05），MCAO/R+antagomiR-223組則顯著減少（P<0.01）；與MCAO/R+QNDP組比較，MCAO/R+QNDP+antagomiR-223組大鼠miR-223-3p表達顯著減少（P<0.01），見圖4。

5 QNDP對缺血皮層NLRP3炎癥小體的影響

Western blot結(jié)果顯示，與sham組相比，MCAO/R組大鼠NLRP3、ASC及cleaved caspase-1蛋白表達顯著增加（P<0.01）；與MCAO/R組比較，MCAO/R+QNDP組大鼠上述蛋白表達減少（P<0.05），MCAO/R+antagomiR-223組大鼠三者蛋白表達升高（P<0.05，P<0.01）；與MCAO/R+QNDP組比較，MCAO/R+QNDP+antagomiR-223組大鼠NLRP3和cleaved caspase-1蛋白表達均上調(diào)（P<0.05，P<0.01），ASC蛋白無統(tǒng)計學(xué)意義；進一步與MCAO/R+antagomiR-223組比較，MCAO/R+QNDP+antagomiR-223組大鼠ASC蛋白顯著降低（P<0.01），見圖5A。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與sham組相比，MCAO/R組NLRP3細胞數(shù)量顯著增加（P<0.01）；與MCAO/R組比較，MCAO/R+QNDP組大鼠顯著降低NLRP3細胞數(shù)量（P<0.01），MCAO/R+antagomi-R223組反而顯著增加（P<0.01）；與MCAO/R+QNDP組比較，MCAO/R+QNDP+antagomiR-223組中NLRP3表達的細胞數(shù)量顯著升高（P<0.01），見圖5B。

Figure 5. The expression NLRP3 inflammsome-related proteins in the cortex of the rats in each group. A： the protein expression of NLRP3， cleaved caspase-1 and ASC detected by Western blot； B： representative immunofluroscence images of NLRP3（green） and DAPI （blue）， and the quantification of NLRP3 positive cell number. Mean±SD. n=3. ##P<0.01 vs sham group； *P<0.05， **P<0.01 vs MCAO/R group； △P<0.05， △△P<0.01 vs MCAO/R+QNDP group； ▲▲P<0.01 vs MCAO/R+antagomiR-223 group.圖5 各組皮層NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達

6 QNDP對缺血皮層IL-1β和IL-18水平的影響

與sham組相比，MCAO/R組大鼠IL-1β和IL-18水平顯著升高（P<0.01）；與MCAO/R組比較，MCAO/R+QNDP組大鼠二者水平顯著降低（P<0.01），MCAO/R+antagomiR-223組反而顯著增加（P<0.01）；與MCAO/R+QNDP組比較，MCAO/R+QNDP+antagomiR-223組的IL-1β和IL-18水平顯著增加（P<0.01），見圖6。

Figure 6. The IL-1β （A） and IL-18（B） levels in the cortex of the rats in each group. Mean±SD. n=6. ##P<0.01 vs sham group； **P<0.01 vs MCAO/R group； △△P<0.01 vs MCAO/R+QNDP group.圖6 各組皮層IL-1β和IL-18水平

討論

缺血性卒中呈現(xiàn)出高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率，高經(jīng)濟負擔(dān)率，已成為我國亟需解決的重大難治性疾病。近年來溶栓、血管內(nèi)治療等治法取得了較好療效，然而臨床上溶栓有限的治療時間窗（<4.5 h）和禁忌癥等問題導(dǎo)致僅約10%的患者獲益［2］。因此為大多數(shù)非溶栓的缺血性卒中患者尋求有效的治療方案，仍然是目前臨床實踐中面臨的主要問題。急性缺血性卒中患者加以中醫(yī)辨證施治，綜合治療效果可有所提高，臨床上采用清熱活血化瘀法治療已得到肯定，有利于患者神經(jīng)功能恢復(fù)，且一定程度提升患者日常生活和質(zhì)量水平［11］。QNDP由梔子、三七和冰片組成。君藥梔子，清熱、瀉火、涼血；臣藥三七，長于活血化瘀，化瘀而不傷正；冰片作為佐使藥，醒神開竅。三藥共同導(dǎo)火熱下行，瘀血散結(jié)，發(fā)揮清熱活血之功效。本團隊前期實驗證實QNDP能夠降低大鼠CIRI誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)功能損傷，改善神經(jīng)功能［7，12］。然而QNDP通過調(diào)控何種分子機制發(fā)揮抗炎作用，正是本研究的目的。

NLRP3是目前研究較深入的炎癥小體，作為炎癥反應(yīng)的中樞，在缺血性卒中發(fā)病及發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵作用［13］。NLRP3直接或通過ASC蛋白間接招募pro-caspase-1，產(chǎn)生活化的caspase-1（cleaved caspase-1），后者將pro-IL-1β和pro-IL-18裂解為成熟形式IL-1β和IL-18并釋放，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Wang等［14］采用NLRP3基因敲除小鼠建立MCAO/R模型后，腦缺血體積和神經(jīng)功能損傷均明顯降低，表明NLRP3炎癥小體加重急性CIRI。Ward等［15］和Zhu等［16］分別應(yīng)用NLRP3抑制劑MCC950干預(yù)MCAO/R小鼠，可顯著降低缺血皮層NLRP3、ASC和cleaved caspase-1蛋白表達，減輕腦缺血體積。這也與本研究結(jié)果相一致，大鼠MCAO/R損傷后可導(dǎo)致NLRP3、cleaved caspase-1和ASC的蛋白表達均顯著增加，神經(jīng)功能缺損嚴重，經(jīng)QNDP治療后，缺血皮層NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達水平降低，IL-1β和IL-18水平顯著減少，表明QNDP對CIRI大鼠具有較好的抗炎作用，是一個潛在的有效治療缺血性卒中的中藥復(fù)方。

miRNA是一類小的非編碼內(nèi)源性RNA分子，通過與靶基因的mRNA特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達，具有調(diào)節(jié)細胞分化、增殖等功能，超過20%的miRNA在缺血性腦卒中發(fā)生改變，參與神經(jīng)細胞死亡，炎癥，神經(jīng)再生以及血管生成等生物學(xué)過程［17-18］。miR-223-3p主要在骨髓和中性粒細胞中高度表達，但也在大腦中海馬、皮層區(qū)表達相對富集，是一種具有神經(jīng)保護作用的miRNA［7，19］。Li等［20］證實腦缺血72 h患者的血清miR-223表達上調(diào)，但與神經(jīng)功能損傷程度和腦缺血體積呈負相關(guān)。Voelz等［21］證實大鼠MCAO/R 24~72 h，缺血側(cè)的皮層、杏仁核區(qū)的miR-223-3p顯著增加，這可能與血小板活化，以及應(yīng)激反應(yīng)等因素有關(guān)。本研究同樣觀察到大鼠MCAO/R 24 h時，缺血側(cè)皮層的miR-223-3p出現(xiàn)升高，給予miR-223-3p拮抗劑后可顯著上調(diào)IL-1β和IL-18水平，腦缺血體積增大，提示miR-223-3p過表達可保護CIRI，miR-223缺乏導(dǎo)致腦損傷加重，這也與Harraz等［7］研究結(jié)果相一致。多項研究表明miR-223-3p可特異性地靶向結(jié)合NLRP3 mRNA的3′端非翻譯區(qū)，對NLRP3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平實行負向調(diào)控，抑制NLRP3蛋白表達和NLRP3炎癥小體活化［22-23］。Sha等［24］采用電針治療可增加急性MCAO/R大鼠的miR-223水平，抑制NLRP3炎癥小體，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究結(jié)果顯示QNDP聯(lián)合miR-223-3p拮抗組干預(yù)后，QNDP顯著上調(diào)MCAO/R大鼠的miR-223-3p表達，減弱NLRP3炎癥小體激活，降低神經(jīng)炎癥，減輕CIRI。

綜上所述，本研究證實，大鼠MCAO/R損傷后可激活NLRP3炎癥小體，加重神經(jīng)炎癥；QNDP可能通過miR-223-3p調(diào)控NLRP3通路抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕大鼠CIRI，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。