常晨， 許玉莉， 任艷玲， 李金軼， 蘇強(qiáng)，2△

（1桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541000；2廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院，廣西 南寧 530021）

心肌梗死（myocardial infarction， MI）是全球心血管疾病發(fā)病和死亡的主要原因。盡管心肌再灌注治療已普遍開展，但冠狀動(dòng)脈血流恢復(fù)后不可避免的產(chǎn)生再灌注損傷，這不僅會(huì)加劇缺血部位損傷，還會(huì)牽連先前未受累的正常心肌組織［1］。氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是MI誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的主要因素［2］。Zeste同源物增強(qiáng)子2（enhancer of Zeste homolog 2， EZH2）是一種組蛋白甲基移換酶，介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成［3］。此外，抑制EZH2可促進(jìn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase， eNOS）的表達(dá)［4］。研究顯示過表達(dá)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA， lncRNA）-?；撬嵘险{(diào)基因1（taurine up-regulated gene 1， TUG1）可能是缺氧心肌細(xì)胞損傷的重要原因［5］。其中涉及的機(jī)制部分歸因于eNOS和BDNF的蛋白表達(dá)水平降低，并可能進(jìn)一步通過影響炎癥反應(yīng)和線粒體生物合成，參與心肌細(xì)胞損傷［6］。此外，我們前期研究［6］顯示沉默TUG1有益于緩解MI后心功能損傷。然而，lncRNATUG1是否通過EZH2途徑影響eNOS和BDNF的表達(dá)以及緩解缺氧心肌細(xì)胞中線粒體功能紊亂和炎癥反應(yīng)有待證實(shí)。因此，本研究構(gòu)建HL-1細(xì)胞缺氧模型進(jìn)行探究驗(yàn)證，進(jìn)一步探索缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-TUG1對(duì)EZH2以及eNOS和BDNF的影響。此外，我們還探討了沉默TUG1的表達(dá)對(duì)線粒體合成功能和炎癥反應(yīng)的影響，這為MI的治療提供參考資料。

材料和方法

1 細(xì)胞系及試劑

HL-1心肌細(xì)胞系購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司。肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB isoenzyme，CKMB）、心肌鈣蛋白I（cardiac troponin I， cTnI）、肌紅蛋白（myoglobin， MYO）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）ELISA試劑盒購(gòu)自Cusabio；EZH2抗體（21800-1-AP）購(gòu)自Proteintech；GAPDH抗體（ab22555）、histone H3抗體（ab1791）和兔IgG抗體（ab172730）購(gòu)自Abcam；HRP標(biāo)記的Ⅱ抗（A0216）購(gòu)自Beyotime；SYBR?Premix Ex Taq、PrimeScriptTMRT試劑盒和總RNA提取試劑盒購(gòu)自TaKaRa；高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素-鏈霉素和胰蛋白酶購(gòu)自HyClone；CCK-8試劑盒購(gòu)自Beyotime；質(zhì)粒中量抽提試劑盒購(gòu)自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；ChIP試劑盒購(gòu)自Millipore。所用引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，序列見表1。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 HL-1細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素），并置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。構(gòu)建siTUG1和對(duì)照質(zhì)粒siNC并分別轉(zhuǎn)染至HL-1細(xì)胞內(nèi)，隨機(jī)分成常氧（normoxia）組、缺氧（hypoxia）組、hypoxia+siNC組和hypoxia+siTUG1組。將normoxia組置于常氧條件（37 ℃、5% CO2），其余組置于缺氧條件（1% O2、5% CO2、94% N2）下培養(yǎng)24 h［7］。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整密度至2×107/L，接種于96孔板中（每孔各100 μL）。細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染siRNA。轉(zhuǎn)染方法如下：（1）稀釋質(zhì)粒：用50 μL的Opti-MEM稀釋200 μmol/L的siRNA，混勻后于室溫孵育5 min；（2）稀釋Lipo3000：用50 μL Opti-MEM稀釋10 μL Lipo3000，混勻并室溫孵育5 min。將（1）與（2）混勻并于室溫孵育20 min，加入24孔板中（每孔各50 μL）后并置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后，更換完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后分裝用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-1細(xì)胞，以2×107/L密度接種于96孔板（每組6個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL）。細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染siNC和siTUG1。根據(jù)分組，將hypoxia組、hypoxia+siNC組和hypoxia+siTUG1組置于缺氧條件下培養(yǎng)。待24 h后，向培養(yǎng)液中加入20 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀中450 nm處測(cè)定吸光度（A）值［8］。

2.4 ChIP實(shí)驗(yàn) 采用ChIP試劑盒，通過酶消化將細(xì)胞交聯(lián)染色質(zhì)超聲破碎后于4 ℃、16 099.2×g離心10 min，除去不溶解的沉淀。將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中分為50 μL一份。將超聲后的50 μL的樣本置于冰上，加入450 μL稀釋液（含2.25 μL蛋白酶抑制劑），混勻后移取5 μL上清液為內(nèi)參照“Input”。以IgG為陰性對(duì)照。分別加入不同抗體和20 μL混勻的蛋白A磁珠后于4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜。使用磁力架將蛋白A磁珠沉淀下來后洗滌并去除上清。進(jìn)一步洗脫蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物和反交聯(lián)蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物為單獨(dú)的DNA，加入100 μL ChIP清洗緩沖液，62 ℃振蕩孵育2 h后再于95 ℃孵育10 min［9］。然后將樣品置于室溫冷卻，將提取的DNA純化和RT-qPCR檢測(cè)。

2.5 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) Trizol試劑盒提取總RNA后按照PrimeScriptTMRT試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。參照SYBR?Premix Ex Taq試劑盒檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，復(fù)孔檢測(cè)后根據(jù)2-ΔΔCt法進(jìn)行比較［6］。

2.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 提取細(xì)胞蛋白，測(cè)定蛋白濃度。上樣行電泳并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫封閉結(jié)束后于4 ℃加入Ⅰ抗過夜孵育；次日用TBST洗膜后于室溫加入Ⅱ抗孵育2 h，待再次洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法顯色，在化學(xué)發(fā)光成像儀下拍照分析。

2.7 ELISA實(shí)驗(yàn) 取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)心肌損傷標(biāo)志物cTnI、CKMB、MYO及炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平。96孔板中加入待測(cè)樣本及標(biāo)準(zhǔn)品，于37 ℃恒溫孵育，加入生物素標(biāo)記的抗體孵育后加入HRP標(biāo)記的抗生物素蛋白孵育。洗滌后加入TMB顯色底物溶液于37 ℃避光顯色，加入終止液終止反應(yīng)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值［6］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。采用SPSS 24.0軟件分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 9.5作圖。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 lncRNA-TUG1在HL-1細(xì)胞系各分組中表達(dá)

如圖1所示，缺氧可誘導(dǎo)HL-1心肌細(xì)胞lncRNA-TUG1表達(dá)顯著升高（P<0.05）。此外，與hypoxia組和hypoxia+siNC組相比，hypoxia+siTUG1組lncRNA-TUG1表達(dá)顯著降低（P<0.05）。

Figure 1. RT-qPCR measurement of the expression of lncRNATUG1 in the cells of different groups. Mean±SEM. n=3. **P<0.01 vs normoxia group； ##P<0.01 vs hypoxia+siNC group.圖1 RT-qPCR檢測(cè)lncRNA-TUG1在各組細(xì)胞中的表達(dá)

2 lncRNA-TUG1通過EZH2途徑影響B(tài)DNF和eNOS的表達(dá)

ChIP分析顯示，沉默TUG1的表達(dá)可進(jìn)一步抑制EZH2與eNOS和BDNF啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合（P<0.05），見圖2。

Figure 2. Effects of lncRNA-TUG1 on the interaction of EZH2 with the promoter regions of eNOS （A） and BDNF （B）. IgG was used as a negative control and H3 as a positive control. Mean±SEM. n=3. **P<0.01 vs hypoxia+siNC group.圖2 lncRNA-TUG1靶向EZH2與eNOS和BDNF啟動(dòng)子區(qū)域間的相互作用

3 沉默TUG1表達(dá)緩解缺氧對(duì)HL-1細(xì)胞活力的抑制

與normoxia組相比，hypoxia組和hypoxia+siNC組細(xì)胞活力明顯降低（P<0.05）；相較于hypoxia組和hypoxia+siNC組，hypoxia+siTUG1組細(xì)胞活力得到顯著改善（P<0.05），見圖3。

Figure 3. Evaluation of cardiomyocyte viability by CCK-8 assay.Mean±SEM. n=6. **P<0.01 vs normoxia group； ##P<0.01 vs hypoxia+siNC group.圖3 CCK-8分析心肌細(xì)胞活力

4 沉默TUG1表達(dá)降低缺氧誘導(dǎo)的HL-1細(xì)胞心肌損傷標(biāo)志物的表達(dá)水平

與normoxia組相比，hypoxia組和hypoxia+siNC組CKMB、cTnI和MYO均顯著升高（P<0.05），而沉默TUG1表達(dá)能夠部分逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)，見圖4。

Figure 4. Measurement of markers of myocardial injury by ELISA. Mean±SEM. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs normoxia group； ##P<0.01 vs hypoxia+siNC group.圖4 ELISA檢測(cè)心肌損傷標(biāo)志物

5 沉默TUG1表達(dá)促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的HL-1細(xì)胞線粒體生物合成

與normoxia組相比，hypoxia組和hypoxia+siNC組線粒體生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白核呼吸因子1（nuclear respiratory factor 1， NRF1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1， PGC-1）和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與hypoxia組和hypoxia+siNC組相比，hypoxia+siTUG1組NRF1、PGC-1和TFAM蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），見圖5A。RT-qPCR結(jié)果同樣顯示，沉默TUG1后NRF1、PGC-1和TFAM的mRNA水平均顯著回升（P<0.05），見圖5B~D。

Figure 5. The expression of mitochondrial biosynthesis-related transcriptional regulator genes was detected by Western blot and RT-qPCR. A： Western blot showing the expression of mitochondrial biosynthesis-related proteins； B， C and D： the mRNA expression of mitochondrial biosynthesis-related genes. Mean±SEM. n=3. **P<0.01 vs normoxia group； ##P<0.01 vs hypoxia+siNC group.圖5 Western blot和RT-qPCR檢測(cè)線粒體生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因

6 沉默TUG1表達(dá)抑制缺氧誘導(dǎo)的HL-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與normoxia組相比，hypoxia組和hypoxia+siNC組IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與hypoxia組和hypoxia+siNC組相比，hypoxia+siTUG1組IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)受到顯著抑制（P<0.05），見圖6A~C。ELISA結(jié)果顯示，沉默TUG1能顯著抑制炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放（P<0.05），見圖6D~F。

Figure 6. RT-qPCR and ELISA for inflammatory factors. RT-qPCR showing the mRNA expression of inflammatory factors： IL-1β（A）， IL-6 （B） and TNF-α （C）； ELISA for inflammatory factors： IL-1β （D）， IL-6 （E） and TNF-α （F）. Mean±SEM. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs normoxia group； ##P<0.01 vs hypoxia+siNC group.圖6 RT-qPCR和ELISA檢測(cè)炎癥因子

討論

TUG1位于人染色體22q12.2，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是長(zhǎng)度為7.1 kb的lncRNA［10］。lncRNA-TUG1被認(rèn)為是心血管疾病預(yù)后不良的生物標(biāo)志物［11］。lncRNA-TUG1在缺氧心肌細(xì)胞中過表達(dá)，并可能通過刺激ROS的產(chǎn)生，加重心肌細(xì)胞損傷［12］。此外，先前研究［6］顯示在小鼠MI模型中沉默TUG1可進(jìn)一步通過抗炎發(fā)揮心肌保護(hù)作用。部分可能歸因于沉默TUG1表達(dá)后進(jìn)一步上調(diào)了eNOS和BDNF的水平［6］。然而，其中具體機(jī)制尚不明確。本研究構(gòu)建HL-1細(xì)胞缺氧模型，通過沉默TUG1表達(dá)，進(jìn)一步探索缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-TUG1對(duì)EZH2以及eNOS和BDNF的作用。此外，我們還探討了沉默TUG1的表達(dá)對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的線粒體合成功能和炎癥反應(yīng)的影響。

本研究結(jié)果顯示沉默TUG1的表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了缺氧對(duì)心肌細(xì)胞活力的抑制。已有研究指出過表達(dá)lncRNA-TUG1可能靶向EZH2參與多種腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移［13］。此外，Miti?等［14］在小鼠肢體缺血模型中觀察到抑制EZH2的表達(dá)后可能進(jìn)一步促進(jìn)了eNOS和BDNF的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示沉默TUG1表達(dá)可能抑制EZH2與eNOS、BDNF啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合。EZH2被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞激活和自身免疫性炎癥的重要調(diào)節(jié)因子［15］。eNOS是調(diào)節(jié)心血管穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)血管內(nèi)皮NO的合成［16］。缺血可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中NO合成限速酶eNOS的激活，促進(jìn)NO生成發(fā)揮舒張血管的作用［17］。此外，在膿毒性心肌病的小鼠模型中觀察到BDNF可通過刺激eNOS進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡發(fā)揮心肌保護(hù)作用［18］。我們先前研究［6］顯示沉默TUG1后，小鼠心肌組織中eNOS和BDNF的表達(dá)上調(diào)。此外，部分研究［19-20］表明eNOS和BDNF表達(dá)水平的增高可以降低動(dòng)脈粥樣硬化模型中炎癥因子的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示沉默TUG1表達(dá)可抑制EZH2與BDNF和eNOS啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，這可能是沉默TUG1降低缺氧心肌細(xì)胞炎癥的潛在機(jī)制。心肌細(xì)胞損傷心臟維持正常功能所需的ATP超過95%源自線粒體的氧化磷酸化［21］。PGC-1α可通過NRF1和TFAM來誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生［22］。沉默TUG1可進(jìn)一步上調(diào)miR-26a緩解LPS誘導(dǎo)的線粒體損傷及炎癥反應(yīng)［23］。同樣，本研究結(jié)果顯示沉默TUG1可進(jìn)一步促進(jìn)缺氧心肌細(xì)胞線粒體生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白NRF1、PGC-1和TFAM的表達(dá)。這說明沉默TUG1表達(dá)對(duì)缺氧誘導(dǎo)的HL-1細(xì)胞線粒體生物合成具有保護(hù)作用。

綜上所述，lncRNA-TUG1可能通過EZH2途徑參與線粒體功能紊亂和炎癥反應(yīng)的過程。當(dāng)lncRNATUG1表達(dá)降低時(shí)，其與EZH2的結(jié)合減弱，進(jìn)而影響EZH2與eNOS和BDNF啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。因此，沉默TUG1可能通過EZH2途徑影響eNOS和BDNF的表達(dá)并緩解缺氧誘導(dǎo)的HL-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)。此外，沉默TUG1可上調(diào)線粒體合成相關(guān)蛋白NRF1、PGC-1和TFAM的表達(dá)，促進(jìn)線粒體生物合成。總之，沉默TUG1可能通過EZH2途徑減輕缺氧心肌細(xì)胞的線粒體功能紊亂和炎癥反應(yīng)。