張諺鵬 林 苗 肖亞紅 溫劉發(fā)

(華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院,廣州 510642)

我國是肉雞產(chǎn)業(yè)大國,禽飼用添加劑的開發(fā)具有重要意義。自“禁抗”以來,不少學者都在研究開發(fā)替代抗生素的添加劑來穩(wěn)定或提高肉雞生長性能,此前已開發(fā)出諸多可行的植物提取物[1]。其中,姜黃提取物與石榴皮提取物具有多種生物學活性,可作為抗生素的替代物應用于肉雞生產(chǎn)中。

姜黃提取物含有姜黃素類與揮發(fā)油類化合物,還含有黃酮類、糖類、多肽類、脂肪酸和微量元素[2]。姜黃乙醚和甲醇提取物對多種革蘭氏陽性菌存在抑菌潛力[3],其中的揮發(fā)油類化合物對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸埃希菌等有較強的抑菌活性[4]。此外,姜黃素類化合物對炎癥性疾病(關節(jié)炎、炎癥性腸道疾病、牛皮癬、皮炎)和神經(jīng)病理性疼痛有良好的預防和治療作用[5]。研究顯示,飼糧中添加487.5 mg/kg的姜黃素能顯著提高舍飼羔羊的平均日增重[6]。石榴皮提取物主要成分是鞣質(zhì)類、黃酮類和生物堿類,次要成分有氨基酸、糖類等。有體外試驗表明,鞣質(zhì)類成分鞣花酸對白色念珠菌、新生隱球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、煙曲霉菌和胞內(nèi)分枝桿菌等具有抗菌活性[7]。石榴皮煎劑能降低炎癥模型小鼠的血清中白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和分泌型免疫球蛋白(sIgA)的含量,提高小鼠免疫力[8]。另有研究顯示,50 mg/kg石榴皮甲醇提取物對胃潰瘍模型大鼠潰瘍的抑制率達到65.87%[9],表明石榴皮甲醇提取物能緩解消化道疾病;飼糧中添加2.0%的石榴皮粉能提高拜城油雞的平均日增重和屠宰率[10],有利于禽類養(yǎng)殖。

目前的研究報道多是單一的姜黃提取物、石榴皮提取物或二者分別與其他植物提取物聯(lián)合應用于畜禽養(yǎng)殖中,有關二者聯(lián)合應用于禽類養(yǎng)殖則鮮有報道。與此同時,單獨應用某一種植物提取物的效果很少能與抗生素相當,且不同的試驗條件和動物模型導致結果差別很大。本研究擬將姜黃提取物和石榴皮提取物聯(lián)合應用于文昌雞的養(yǎng)殖中,探究其對文昌雞生長性能、血清免疫指標和盲腸微生物的影響,期望能在飼養(yǎng)效果上有良好、穩(wěn)定地表現(xiàn),使其作為無害有效的飼料添加劑投入到實際生產(chǎn)中,以期為多種植物提取物聯(lián)合應用于禽業(yè)養(yǎng)殖中提供借鑒和依據(jù),豐富復合提取物的研究資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

石榴皮提取物(10∶1,即10 kg石榴皮通過水提得到1 kg提取物),其主要成分是鞣質(zhì)類、黃酮類和生物堿類,次要成分為氨基酸和糖類等;姜黃提取物(10∶1,即10 kg姜黃通過水提得到1 kg提取物),主要成分是姜黃素類與揮發(fā)油類化合物,次要成分有黃酮類、糖類、多肽類、脂肪酸和微量元素。以上二者均購自西安某生物工程有限公司。姜黃提取物與石榴皮提取物的提取工藝流程為:挑選原料→粉碎→水提→濃縮→浸膏→溶劑萃取→濃縮→浸膏→噴霧干燥→粉碎→提取物。按1∶1的比例將石榴皮提取物與姜黃提取物混合均勻制成復合提取物,在飼糧中添加時以玉米芯粉和麥飯石為載體配制成預混劑。

1.2 試驗設計

選取57日齡文昌雞母雞1 260只,隨機分為7組,每組5個重復,每個重復36只,開始試驗前各重復體重差異不顯著(P>0.05),均勻度整齊。對照組飼喂不添加復合提取物的基礎飼糧,試驗組分別飼喂在基礎飼糧中添加100、200、400、800、1 600和3 200 g/t復合提取物的試驗飼糧,試驗期為35 d。基礎飼糧依據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《雞的飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)配制,其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) kg/t

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在惠州京基智農(nóng)畜牧有限公司雞場進行。試驗雞采用籠養(yǎng)模式,各組飼養(yǎng)管理方式、飼養(yǎng)環(huán)境條件一致。試驗期間試驗雞自由采食粉料,保證料槽余料充足;自由飲水,除了開始試驗時使用多維抗應激外,未使用其他添加劑或藥物;每天24 h光照(白天自然光照,晚上開照明燈補光);疫苗接種按照雞場的免疫程序執(zhí)行;定期配制試驗飼糧,定期進行水線的清潔、地面的沖洗。

1.4 樣品采集與指標檢測

1.4.1 生長性能的測定

飼養(yǎng)試驗開始時稱量試驗雞空腹體重,記為初始體重,飼養(yǎng)試驗結束時稱量試驗雞空腹體重,記為終末體重。在飼養(yǎng)試驗期間,每天觀察雞群的健康狀況,記錄每日投料、余料及雞只死淘情況。根據(jù)記錄的數(shù)據(jù),計算試驗雞的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和死亡率(MR)。

1.4.2 血清的采集與免疫指標的檢測

挑選每個重復中最接近該重復平均體重的5只雞進行采樣,采樣前進行12 h的饑餓處理。通過頸動脈放血,用10 mL離心管接血液(2/3容積),避免污染,每只雞采集2管血液;將盛有血液的離心管置于離心管架上,室溫傾斜放置1～2 h后,用離心機以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,完畢后取上清1.5 mL,裝于2只2 mL離心管中,標明組別后放到樣品袋,轉(zhuǎn)到干冰箱暫存后存入-20 ℃冰箱,待測血清免疫指標。

血清中免疫球蛋白G(IgG)、γ-干擾素(IFN-γ)、IL-1β、IL-6、脂多糖(LPS)含量均采用對應試劑盒(IgG、LPS、IFN-γ試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn),IL-1β、IL-6試劑盒由廣州東林生物科技有限公司生產(chǎn))通過全自動生化分析儀進行檢測。

1.4.3 盲腸微生物樣采集與檢測

1.4.3.1 采集

將采血后的雞只屠宰,剪下每只雞的2條盲腸,用棉線在回盲韌帶處結扎,一條盲腸置于5 mL離心管中,編號,置于有干冰的泡沫箱中,并于當日轉(zhuǎn)至-20 ℃冰箱中保存;另一條盲腸剪開后用鑷子擠壓收集內(nèi)容物于無菌凍存管內(nèi),將無菌凍存管放入干冰中,之后于-80 ℃保存,待檢。

1.4.3.2 盲腸微生物檢測

本試驗所有盲腸微生物樣本的擴增、測序和物種注釋流程均由深圳微生太科技有限公司完成,具體流程如下。

(1)DNA抽提和PCR擴增

根據(jù)E.Z.N.A.?soi試劑盒說明書進行總DNA抽提,用NanoDrop2000分光光度計檢測DNA濃度和純度,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量;用338F(5’ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增(PCR儀:ABI geneamp?9700型),擴增程序為:95 ℃預變性3 min,27個循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),最后72 ℃延伸10 min。擴增體系為20 μL,包含4 μL 5×FastPfu緩沖液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL引物(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu聚合酶,10 ng DNA模板,由超純水補至20 μL。

(2)文庫構建與測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,用QuantiFluorTM-ST進行定量檢測,根據(jù)Illumina MiSeq平臺標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建PE 2*300的文庫。利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺進行測序。

(3)物種注釋

將原始序列fastq文件通過qiime tools import插件轉(zhuǎn)化文件格式,然后運用QIIME2 dada2插件進行質(zhì)控、修剪、去噪、拼接和去嵌合體得到特征序列。運用QIIME2 feature-classifier插件將擴增特征序列(ASV)的代表序列(根據(jù)338F/806R引物對將數(shù)據(jù)庫修剪到V3～V4區(qū)域)與Greengenes數(shù)據(jù)庫比對,得到物種的分類信息表。

(4)α多樣性及相關性分析

α多樣性及相關性分析主要用qiime2 diversity插件完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用Excel 2019對數(shù)據(jù)進行計算,并使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進行方差分析,組間多重比較采用Duncan氏法,以P<0.05作為差異顯著性判斷標準,統(tǒng)計數(shù)據(jù)用平均值±標準誤(mean±SE)表示。

2 結 果

2.1 復合提取物對文昌雞生長性能的影響

由表2可知,試驗開始前各組間初始體重無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比,添加200、400 g/t復合提取物顯著提高了文昌雞的終末體重和平均日增重(P<0.05);添加400 g/t復合提取物顯著提高了文昌雞的平均日采食量(P<0.05);添加200 g/t復合提取物顯著降低了文昌雞的料重比(P<0.05)。

表2 復合提取物對文昌雞生長性能的影響Table 2 Effects of compound extract on growth performance of Wenchang broilers

以復合提取物添加量100、200、400、800 g/t為自變量(M),分別以平均日增重、平均日采食量和料重比為因變量(N)展開線性分析,其調(diào)整后R2、P值及線性回歸方程如表3所示。由表3可知,平均日增重無法建立線性模型,不能進一步分析;平均日采食量和料重比可以建立線性方程,但從調(diào)整后R2及P值可知,這2個指標的線性分析預測結果準確性不高,無法下定結論。因此,又以復合提取物添加量100、200、400、800 g/t為自變量(X),分別以平均日增重、平均日采食量和料重比為因變量(Y)進行二次曲線分析,3個指標調(diào)整后R2、P值及二次曲線方程如表4所示,二次回歸圖如圖1所示。由表4可知,平均日采食量和料重比與復合提取物的二線曲線調(diào)整后R2較低,擬合程度低,而平均日采食量是這3個指標中二次曲線擬合度最好的;從3個指標的P值來看,均無顯著性差異,但平均日采食量更加有線性的趨勢;由圖1可知,平均日采食量的數(shù)據(jù)點更接近曲線。綜上所述,復合提取物添加量通過影響3個指標中的平均日采食量,進而影響生長性能的解釋更科學合理,由其二次曲線方程得出,當復合提取物添加量為481.45 g/t時,平均日采食量最高,生長性能最好。

圖1 平均日增重、平均日采食量和料重比與復合提取物添加量的二次回歸圖Fig.1 Quadratic regression diagram of ADG, ADFI, F/G and compound extract supplemental level

表3 平均日增重、平均日采食量和料重比(N)與復合提取物添加量(M)的線性分析Table 3 Linear analysis of ADG, ADFI, F/G (N) and compound extract supplemental level (M)

表4 平均日增重、平均日采食量和料重比(Y)與復合提取物添加量(X)的二次曲線分析Table 4 Quadratic curve analysis of ADG, ADFI, F/G (Y) and compound extract supplemental level (X)

2.2 復合提取物對文昌雞血清免疫指標的影響

由表5可知,與對照組相比,添加3 200 g/t復合提取物顯著提高了文昌雞血清中IFN-γ含量(P<0.05),顯著降低了血清中IL-1β含量(P<0.05);各添加復合提取物組文昌雞血清中IgG、IL-6、LPS含量均顯著降低(P<0.05)。

表5 復合提取物對文昌雞血清免疫指標的影響Table 5 Effects of compound extract on serum immune indexes of Wenchang broilers

2.3 復合提取物對文昌雞盲腸微生物的影響

2.3.1 測序結果

經(jīng)Illumina公司的MiSeq PE300平臺進行測序,40個樣本得到全部原始序列數(shù)為2 656 290,進行質(zhì)量控制、去噪、拼接、去嵌合體,形成操作分類單元(OTU)。所有原始序列得到OTU數(shù)為2 082 884,質(zhì)量控制比例為78.41%。

2.3.2 注釋信息基礎統(tǒng)計

根據(jù)物種絕對豐度表,基于Greengenes數(shù)據(jù)庫的注釋信息,全部樣本的Feture sequence從2個界[細菌界(Bacteria)、古細菌界(Archaea)]中共篩選出13個門,22個綱,30個目,46個科,79個屬和113個種。

根據(jù)門相對豐度表,基于Greengenes數(shù)據(jù)庫的注釋信息得到所有樣本門水平的注釋信息,如圖2所示。由圖2可知,相對豐度排在前6的門有擬桿菌門(Bacteroidetes,48.37%)、厚壁菌門(Firmicutes,41.77%)、變形菌門(Proteobacteria,4.28%)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes,1.66%)、放線菌門(Actinobacteria,1.56%)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres,0.61%)。

Bacteroidetes:擬桿菌門;Firmicutes:厚壁菌門;Proteobacteria:變形菌門;Synergistetes:互養(yǎng)菌門;Actinobacteria:放線菌門;Deferribacteres:脫鐵桿菌門;Fusobacteria:梭桿菌門;Elusimicrobia:迷蹤菌門;Spirochaetes:螺旋體門;Verrucomicrobia:疣微菌門;Lentisphaerae:黏膠球形菌門;Tenericutes:軟壁菌門;Unclassified:未分類。圖2 文昌雞盲腸微生物門水平物種組成Fig.2 Species composition of cecal microbiota at phylum level of Wenchang broilers

根據(jù)屬相對豐度表,基于Greengenes數(shù)據(jù)庫的注釋信息,得到所有樣本屬水平的注釋信息,如圖3所示。由圖3可知,相對豐度排在前8的屬有擬桿菌屬(Bacteroides,24.40%)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus,6.59%)、巴恩斯氏菌屬(Barnesiella,5.60%)、巨單胞菌屬(Megamonas,5.17%)、Papillibacter(3.40%)、普氏菌屬(Prevotella,2.96%)、梭菌屬(Clostridium,2.77%)、糞桿菌屬(Faecalibacterium,2.61%)。

Unclassified:未分類;Bacteroides:擬桿菌屬;Ruminococcus:瘤胃球菌屬;Barnesiella:巴恩斯氏菌屬;Megamonas:巨單胞菌屬;Prevotella:普氏菌屬;Ruminococcaceae_Clostridium:瘤胃球菌科梭菌屬;Faecalibacterium:糞桿菌屬;Dethiosulfovibrio:脫硫代硫酸鹽弧菌屬;Lachnospiraceae_Clostridium:毛螺菌科梭菌屬;Desulfovibrio:脫硫弧菌屬;Alistipes:另枝菌屬;Selenomonas:月形單胞菌屬;Butyricicoccus:丁酸球菌屬;Lactobacillus:乳桿菌屬;Oscillospira:顫螺旋菌屬;Gemmiger:芽殖菌屬;Sporobacter:孢桿菌屬;Other:其他。圖3 文昌雞盲腸微生物屬水平物種組成Fig.3 Species composition of cecal microbiota at genus level of Wenchang broilers

2.3.3 α多樣性分析

由表6中的Goods_coverage指數(shù)可以得出,所有樣本的注釋情況良好,此次測序結果能反映出樣本中微生物的真實情況。與對照組相比,各添加復合提取物組的Chao1、Ace、Simpson指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。與添加100 g/t復合提取物組相比,添加3 200 g/t復合提取物組Shannon指數(shù)顯著降低(P<0.05)。

表6 復合提取物對文昌雞盲腸微生物α多樣性的影響Table 6 Effects of compound extract on cecal microbial α diversity of Wenchang broilers

2.3.4 菌屬差異性

由表7可知,與對照組相比,添加100 g/t復合提取物組文昌雞的乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度顯著增高(P<0.05),而添加400、3 200 g/t復合提取物組無顯著性差異(P>0.05),但有提高其相對豐度的趨勢;添加400、3 200 g/t復合提取物組的顫螺旋菌屬(Oscillospira)相對豐度顯著降低(P<0.05)。與添加100 g/t復合提取物組相比,添加400 g/t復合提取物組的優(yōu)桿菌屬(Eubacterium)相對豐度顯著增高(P<0.05)。

表7 復合提取物對文昌雞9個菌屬相對豐度的影響Table 7 Effects of compound extract on relative abundances of 9 bacterial genera of Wenchang broilers %

2.3.5 相關性分析

Pheatmap可用于分析環(huán)境因子或其他臨床表型數(shù)據(jù)與微生物群落或物種之間是否顯著相關。對文昌雞盲腸微生物中部分菌屬的相對豐度與復合提取物添加量、文昌雞平均日增重進行相關性分析,結果如圖4所示。由圖4可知,文昌雞盲腸微生物中Asteroleplasma、優(yōu)桿菌屬、歐陸森氏菌屬(Olsenella)的相對豐度與平均日增重呈顯著正相關(P<0.05),文昌雞盲腸微生物中瘤胃球菌科梭菌屬(Ruminococcaceae_Clostridium)、Papillibacter、Desulfosporosinus、顫螺旋菌屬、羅氏菌屬(Roseburia)、毛螺菌科梭菌屬(Lachnospiraceae_Clostridium)的相對豐度與復合提取物添加量呈顯著負相關(P<0.05)。

X軸為影響因子,Y軸為物種,同時,左邊的色條標注了物種所屬門分類。通過計算獲得R值(秩相關)和P值。R值在圖中以不同顏色展示,右側圖例是不同R值的顏色區(qū)間。P值小于0.05表示存在顯著相關,其中0.01≤P<0.05用*標注,0.001≤P<0.01用**標注。The X-axis represents the influencing factor and the Y-axis represents species. The color bar on the left marks the classification of the phylum to which the species belongs. R value (rank correlation) and P-value were obtained by calculation. Wherein, the R value is displayed in different colors in the graph, and the legend on the right shows the color range of different R values. A P-value less than 0.05 indicates a significant correlation. 0.01≤P<0.05 is marked with *, and 0.001≤P<0.01 is marked with **.ADG:平均日增重 average daily gain;AL:復合提取物添加量 compound extract supplemental level;Phylum:門;Actinobacteria:放線菌門;Firmicutes:厚壁菌門;Asteroleplasma:無甾醇原體屬;Eubacterium:優(yōu)桿菌屬;Olsenella:歐陸森氏菌屬;Ruminococcaceae_Clostridium:瘤胃球菌科梭菌屬;Oscillospira:顫螺旋菌屬;Roseburia:羅氏菌屬;Lachnospiraceae_Clostridium:毛螺菌科梭菌屬。圖4 文昌雞盲腸微生物相關性分析Fig.4 Correlation analysis of cecal microbiota of Wenchang broilers

3 討 論

3.1 復合提取物對文昌雞生長性能的影響

目前植物提取物在肉雞上的應用效果已初步顯現(xiàn),如山香圓葉、夜交藤、絲蘭、博落回、五味子和連翹等[11-12]。單一使用某些植物提取物對肉雞的生長性能存在無提升或提升不明顯的現(xiàn)象。例如,周璐麗等[13]在基礎飼糧中添加300 mg/kg姜黃提取物飼養(yǎng)文昌雞9周,其平均日增重無顯著提升;樊祥宇等[14]在飼糧中添加100或200 mg/kg姜黃素顯著降低了29～70日齡中速型黃羽肉雞的平均日采食量,但試驗全期平均日增重無顯著變化。此外,某些植物提取物需要添加過高劑量才發(fā)揮效果。例如,李婉雁等[15]的研究顯示,在基礎飼糧中添加5 000 mg/kg姜黃粉才能顯著提高試驗雞的全期增重和降低料重比;黃飄飄等[10]報道,在飼糧中添加2%(20 000 mg/kg)的石榴皮粉時拜城油雞的平均日增重才顯著高于對照組。

本試驗結果顯示,添加200、400 g/t復合提取物顯著提高了文昌雞的平均日增重;添加400 g/t復合提取物顯著提高了文昌雞的平均日采食量;添加200 g/t復合提取物顯著降低了文昌雞的料重比。這是因為姜黃提取物中的姜黃素具有較好的抗炎活性,能減少胃腸道炎癥來保護腸道,有利于腸腔對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[16];石榴皮中的鞣花酸的抑菌譜廣[7],能降低胃腸道疾病發(fā)生率[9],促進腸道健康,使機體蛋白質(zhì)沉積加快,促進生長。上述試驗結果也表明姜黃提取物與石榴皮提取物聯(lián)合使用效果良好,中、低添加劑量就能提升文昌雞的生長性能,比起二者單獨使用的效果要好,復合提取物有著使用劑量小、效果優(yōu)的特點。根據(jù)二次曲線分析數(shù)據(jù)可知,以復合提取物添加量為自變量、平均日采食量為因變量二次回歸分析的調(diào)整后R2較高,二次回歸方程擬合度較好,其呈現(xiàn)出的規(guī)律性較強且P值相對而言更接近顯著;以平均日增重為因變量時,調(diào)整后R2較低,二次回歸方程擬合度較差,其呈現(xiàn)出的規(guī)律性弱且P值較大;而以料重比為因變量時,調(diào)整后R2為負數(shù),在此不做討論。因此,本試驗以平均日采食量進行分析更加科學、合理,通過二次回歸方程計算得出,當復合提取物添加量為481.45 g/t時,文昌雞的平均日采食量最高,生長性能最好。姜黃提取物與石榴皮提取物聯(lián)合使用可能存在某種正向靶點,不僅提高采食量,還使文昌雞擁有良好的腸道環(huán)境和健康水平,促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收,最終提高文昌雞的生長性能。

3.2 復合提取物對文昌雞血清免疫指標的影響

免疫球蛋白(Ig)由B淋巴細胞產(chǎn)生,能和抗原特異性結合,廣泛分布于動物血清、組織液,從Ig含量的變化可以看出動物的免疫水平[17]。本研究中,添加400 g/t復合提取物顯著降低了文昌雞血清中IgG含量,而荀文娟等[18]在基礎飼糧添加300或400 mg/kg姜黃素均能顯著提高早期斷奶仔豬血清中IgG含量,Hosseini-Vashan等[19]在飼糧中添加15、30或50 g/kg經(jīng)尿素處理的石榴皮至熱應激肉雞42日齡,其血清中IgG含量顯著上升。本結果與上述學者試驗結果存在差異的原因可能是本試驗所用復合提取物含有的功效成分姜黃素與鞣花酸發(fā)揮出與IgG類似的作用,當機體發(fā)生免疫反應時就不會產(chǎn)生過多的IgG,而由姜黃素、鞣花酸發(fā)揮作用,這使得機體用于合成免疫的蛋白質(zhì)減少,用于生長的蛋白質(zhì)量增加,有利于雞的增重。本試驗中,添加3 200 g/t復合提取物組血清中IFN-γ含量顯著升高,表明添加高水平的復合提取物促進了機體IFN-γ的表達,進而提高機體的免疫能力。李云等[20]在研究石榴皮多糖的免疫調(diào)節(jié)作用時發(fā)現(xiàn),石榴皮多糖組中干擾素的含量比模型組顯著增高,且石榴皮多糖濃度越高,改善的效果越明顯,呈劑量效應關系,本試驗結果與此相符。

IL-1β為促炎因子,與細胞繁殖、分化和凋亡相關[21]。本試驗中,添加3 200 g/t復合提取物顯著降低了文昌雞血清中IL-1β含量,但添加400 g/t復合提取物顯著增加了文昌雞血清中IL-1β含量,這可能與該組雞平均日采食量、平均日增重較高有關,當機體細胞生長繁殖速度快時,機體會產(chǎn)生更多的IL-1β。IL-6有調(diào)節(jié)免疫應答、造血功能等功能[22]。在本研究中,添加100、400、3 200 g/t復合提取物均顯著降低了血清中IL-6含量,表明飼糧中復合提取物的添加使得文昌雞保持在較低的炎癥水平,具有良好免疫應答能力。孫慧男等[23]的試驗表明,5～30 μmoL/L的姜黃素顯著抑制LPS誘導肺泡上皮細胞炎癥產(chǎn)生的IL-6;飼糧中添加300或400 mg/kg姜黃素可顯著降低斷奶仔豬空腸黏膜中IL-1β、IL-6的相對表達量[24]。本結果與上述研究結果相似,飼糧添加適量的復合提取物能降低文昌雞血清中IL-6、IL-1β含量,減少機體炎癥發(fā)生,促進機體健康,提高生長性能。其作用機制為,姜黃素能夠阻斷核因子-κB(NF-κB)信號通路,抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體聚集,從而中斷IL-1β釋放,達到抑制炎癥反應的效果[25]。

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分,在細菌死亡或快速生長時釋放,能誘導畜禽產(chǎn)生炎癥。本試驗中,添加100、400、3 200 g/t復合提取物均顯著降低了文昌雞血清中LPS含量,表明添加復合提取物能降低文昌雞的炎癥水平,提高其免疫能力。Rajput等[26]給雛雞飼喂含200 mg/kg姜黃素的基礎飼糧,在42 d時顯著提高LPS誘導的雛雞B淋巴細胞和T淋巴細胞的活性,且飼喂含姜黃素飼糧的雛雞表現(xiàn)出更好的免疫反應;飼糧中添加β-胡蘿卜素、姜黃素、大蒜素能夠顯著上調(diào)蛋白酶激活亞基3(PSME3)、蛋白酶激活亞基4(PSME4)基因的表達,增強雛雞空腸免疫力[27];鞣花酸在體內(nèi)與體外試驗中均可調(diào)節(jié)LPS誘導的炎癥因子表達,阻斷LPS-Toll樣受體4(TLR4)-NF-κB信號通路[28]。本試驗結果表明,飼糧中添加復合提取物能降低由LPS所致的腸屏結構損傷,減少腸道炎癥的發(fā)生,促進文昌雞機體健康。

3.3 復合提取物對文昌雞盲腸微生物的影響

3.3.1 注釋信息統(tǒng)計分析

腸道是畜禽最大的細菌庫,隨著測序技術的發(fā)展,我們可以研究實驗室不能培養(yǎng)出的腸道微生物。注釋信息統(tǒng)計結果顯示,文昌雞的盲腸微生物優(yōu)勢菌門為擬桿菌門(48.37%)、厚壁菌門(41.77%)、變形菌門(4.28%)、互養(yǎng)菌門(1.66%)、放線菌門(1.56%)。家禽的腸道微生物是復雜而多樣的,家禽從出生至第4周盲腸微生物多樣性呈增加趨勢,從第4周到第16周開始下降,而4周后厚壁菌門的相對豐度增加,變形菌門的相對豐度降低[29],本試驗結束于文昌雞的93日齡,因而從菌門比例上看,厚壁菌門較高而變形菌門較低。

3.3.2 α多樣性分析

α多樣性能反映一個群落內(nèi)物種的多樣性,在本研究中則反映某個樣品中物種的復雜程度。α多樣性通過α多樣性指數(shù)呈現(xiàn),Chao1、Ace指數(shù)可以評估一個樣本中OTU數(shù)目的多少,是反映菌群豐度的指數(shù),其數(shù)值越大,代表OTU數(shù)目越多,某種群數(shù)目越多;Shannon、Simpson指數(shù)是用來估計樣品中物種多樣性的指數(shù),二者數(shù)值越大,其物種多樣性越高;Goods_coverage指數(shù)是測序深度指數(shù),反映的是樣品特征序列與數(shù)據(jù)庫的注釋情況,其數(shù)值越大,注釋水平越好,最大值為1。

本試驗中,從Goods_coverage指數(shù)可以看出,所有樣本的注釋情況良好,此次測序結果能反映出樣本中微生物的真實情況。各組Chao1、Ace、Simpson指數(shù)無顯著差異,而添加3 200 g/t復合提取物組的Shannon指數(shù)比添加100 g/t復合提取物組顯著降低,表明過高劑量的添加復合提取物會使文昌雞盲腸微生物的多樣性降低,從Chao1、Ace、Simpson指數(shù)的數(shù)值上看也能推測出該推論。

3.3.3 菌屬差異分析

擬桿菌門是腸道生態(tài)系統(tǒng)中非常成功的競爭者,具有強大的營養(yǎng)靈活性和宿主腸道環(huán)境適應能力,其組成和代謝活動在很大程度上受飼糧調(diào)節(jié),與脂肪和蛋白質(zhì)的攝入量有關。菌屬差異分析結果顯示,文昌雞盲腸微生物中擬桿菌門占比最高,可能與文昌雞后期飼糧油脂含量偏高有一定關系。厚壁門大多屬于有益菌,乳桿菌屬于該門類,高纖維的飼糧可以增加腸道中厚壁菌門的數(shù)量。變形菌門是革蘭氏陰性菌,大多屬于病原菌,如大腸桿菌、埃希氏菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等著名的致病菌屬均屬于該門類。放線菌門因在某一發(fā)育階段形成分枝細絲而得名,該門有益菌和有害菌都包含。

正常菌群與宿主之間、正常菌群之間通過營養(yǎng)競爭、代謝產(chǎn)物等相互制約,維持著良好的生存平衡,當這種平衡被打破,有些正常菌群就會變成致病菌群,這類菌群稱為條件致病菌。本研究中,我們統(tǒng)計了5種有益菌屬(雙歧桿菌屬、優(yōu)桿菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、顫螺旋菌屬)和4種條件致病菌屬(鏈球菌屬、梭菌屬、埃希氏菌屬、腸球菌屬)的相對豐度,分析其組間差異,以尋找腸道有益菌群、條件致病菌群與復合提取物添加量的關系。由試驗結果可知,4種條件致病菌的相對豐度在各組間均無顯著差異,表明試驗期間飼糧添加復合提取物并不會給肉雞盲腸中條件致病菌創(chuàng)造有利條件而產(chǎn)生腸道危害,利于肉雞腸道微生態(tài)和諧。對于有益菌而言,優(yōu)桿菌屬的許多菌種可產(chǎn)生的短鏈脂肪酸、保護腸道黏膜屏障、降低炎癥水平和增強胃腸道運動機能,對機體營養(yǎng)代謝和維持腸道平衡有重要的作用。添加400 g/t復合提取物組優(yōu)桿菌屬的相對豐度比添加100 g/t復合提取物組顯著增高,雖與較對照組相比無顯著差異,但有增加的趨勢。顫螺菌屬可以產(chǎn)生丁酸鹽等,被稱為下一代益生菌的候選者,有研究發(fā)現(xiàn)它與體質(zhì)變瘦呈正相關,顫螺菌可能具有減肥、降脂、緩解代謝綜合征等作用。本試驗中,添加400、3 200 g/t復合提取物組顫螺旋菌屬的相對豐度較對照組顯著降低,顫螺旋菌屬數(shù)量減少,有利于試驗雞增重的提升。乳桿菌屬能與腸道黏膜上皮細胞緊密結合形成“占位性”保護,并且通過增加頂端緊密連接的細胞間完整性來維持腸道滲透性;在與腸道上皮細胞的聯(lián)合作用下,乳桿菌會刺激腸上皮杯狀細胞,使杯狀細胞產(chǎn)生大量黏液,阻止致病菌侵入腸上皮[30]。添加100 g/t復合提取物組乳桿菌屬的相對豐度較對照組顯著增高,添加400、3 200 g/t復合提取物組與對照組無顯著差異,但有提高的趨勢,這表明飼糧添加適量的復合提取物能夠提高文昌雞腸道微生物中乳桿菌屬的相對豐度,改善腸道健康,提高免疫能力,促進其健康生長。

目前,有關研究已表明肉雞腸道微生物的組成與宿主生長和健康密切相關,腸道菌群的競爭和自我調(diào)節(jié)影響著肉雞腸道穩(wěn)態(tài)與體重變化,微生物可能通過自身的碳水化合物代謝和脂質(zhì)代謝影響肉雞的免疫水平和能量代謝水平,進而影響體重。

在本試驗中,基于屬水平相對豐度表,對文昌雞盲腸微生物部分菌屬的相對豐度與復合提取物添加量、文昌雞的平均日增重的相關性進行了分析,結果表明Asteroleplasma、優(yōu)桿菌屬、歐陸森氏菌屬這3個菌屬的相對豐度與文昌雞的平均日增重顯著正相關,推測飼糧中添加復合提取物能夠提高文昌雞盲腸微生物中這3個菌屬的相對豐度,這3個菌屬通過菌群互作或產(chǎn)生有益于宿主的物質(zhì)對文昌雞腸道健康、營養(yǎng)吸收產(chǎn)生有利影響,從而提高平均日增重,促進文昌雞的生長。隨著復合提取物添加量的提升,文昌雞盲腸微生物中瘤胃球菌科梭菌屬、Papillibacter、Desulfosporosinus、顫螺旋菌屬、羅氏菌屬、毛螺菌科梭菌屬的相對豐度降低,推測高劑量添加復合提取物會使文昌雞盲腸微生物豐富度降低,這與復合提取物中功效成分姜黃素、鞣花酸的抑菌生物活性有關,另一種可能是姜黃素、鞣花酸對這些菌屬存在“特異性”抑制,使得其相對豐度降低。

4 結 論

飼糧中添加400 g/t的復合提取物能改善文昌雞腸道微生態(tài),增強機體免疫能力,使文昌雞的平均日采食量得到改善,進而提高平均日增重,最終提高生長性能;通過二次回歸方程得出,當復合提取物添加量為481.45 g/t時,文昌雞的平均日采食量最高。此外,文昌雞盲腸微生物中Asteroleplasma、優(yōu)桿菌屬、歐陸森氏菌屬的相對豐度與平均日增重呈顯著正相關,過高添加量的復合提取物會降低文昌雞盲腸微生物的豐富度。