張慶忠,龍思芳,戚國平,魏勝蘭,吳富小,朱啟悅,張亞亞,李 秋,韋小龍

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,貴州 都勻 558000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種臨床表現(xiàn)為手、足小關(guān)節(jié)的侵襲性炎癥、器官受累、關(guān)節(jié)畸形、功能喪失等癥狀的疾病[1-3]。國內(nèi)RA發(fā)病率約為0.3%,全世界為0.5%～1.0%,若控制不好約35%RA患者10年內(nèi)會喪失工作能力[2-3]。目前,治愈RA的文獻(xiàn)資料報(bào)道不多,該病的發(fā)生與其組織、關(guān)節(jié)畸變的直接代謝關(guān)聯(lián)性研究資料也不豐富。花蝴蝶學(xué)名赤脛散(PolygonumruncinatumBuch.-Ham.var.SinenseHemsl.),為蓼科蓼屬植物。貴州省苗族民間中草藥醫(yī)生常用此藥治療RA,效果較好[4-5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),苗藥花蝴蝶回調(diào)RA模型大鼠脂肪細(xì)胞、白細(xì)胞變化的效果較好。結(jié)合另一些研究資料,苗藥花蝴蝶調(diào)節(jié)牛二型膠原蛋白誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)模型大鼠實(shí)驗(yàn)研究指標(biāo)有甘油三酯(TG)、脂聯(lián)素(ADPN)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、類風(fēng)濕因子(RF)、免疫球蛋白(Ig)等[6-8]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討苗藥花蝴蝶回調(diào)CIA模型大鼠炎癥、關(guān)節(jié)畸形等的直接代謝相關(guān)因子及其作用機(jī)制?，F(xiàn)將本實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1苗藥花蝴蝶 提取藥液制備:采自貴州省都勻市螺螄殼等地新鮮苗藥花蝴蝶全株約1 500g,清理洗凈后實(shí)驗(yàn)室水提3次,最后取濃縮液靜置備用。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動物及試劑 SPF級雄性SD大鼠40只,體重(180±20)g,由陸軍軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供[SCXK-(軍)2022-0012]。完全弗氏佐劑(CFA)購自美國SIGMA公司;ADPN、IL-10、牛Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ)購自北京索萊寶科技有限公司;氨甲蝶呤片為貴州鼎晟泰生物科技有限公司提供(批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H31020644)等。

1.2方法

1.2.1CIA建模 將40只大鼠隨機(jī)分為正常組8只及建模組32只,按照動物福利保護(hù)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(本校倫理委員會動物實(shí)驗(yàn)倫理審查表編號:2023013)。將CⅡ溶于0.1 g/mL醋酸溶液,制成濃度為1 mg/mLCⅡ溶液,搖床4 ℃過夜。次日將CⅡ溶液與CFA按體積比(1∶2)混合,并于冰上乳化成乳劑(即CIA建模液)。每只建模組大鼠左右后足跖部皮內(nèi)注射0.25 mg CIA建模液。

1.2.2建模后分組 CIA建模后大鼠單足關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分大于或等于3.5,出現(xiàn)前足或后足關(guān)節(jié)紅腫、踝關(guān)節(jié)明顯腫脹,視為造模成功[9]。建模成功CIA模型大鼠隨機(jī)分為CIA模型組(模型組)8只、氨甲蝶呤治療組(氨甲蝶呤組)8只、花蝴蝶高劑量治療組(花蝴蝶高組)8只、花蝴蝶低劑量治療組(花蝴蝶低組)8只。

1.2.3給藥 分組第2天,各組大鼠經(jīng)灌胃給藥。正常組大鼠給予生理鹽水,氨甲蝶呤組大鼠給予1.04 mg/kg氨甲蝶呤,每周2次;結(jié)合民間用藥經(jīng)驗(yàn)[4-5],花蝴蝶高、低組藥液量分別為每天7.6、3.8 mg/kg。灌胃約35 d即停止給藥(可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況調(diào)整)。

1.2.4觀察指標(biāo)

1.2.4.1足腫脹情況觀察 建模前1 d,建模后第4、8、12、16、20、24、28、32天,觀察、評估各組大鼠左右后足跖關(guān)節(jié)腫脹情況,并照相記錄。根據(jù)各組大鼠足關(guān)節(jié)腫脹評分標(biāo)準(zhǔn)[1,9]進(jìn)行比較。

1.2.4.2血液相關(guān)指標(biāo)檢測 末次給藥后第2天,腹腔注射10%水合氯醛麻醉[1](0.1 mg/100 g鼠體重),大鼠仰位固定行腹主動脈取全血3 mL即送貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行TG、RF、IgA、IgG、IgM等指標(biāo)檢測。

1.2.4.3IL-10、ADPN檢測 按“1.2.4.2”法麻醉大鼠,大鼠仰位固定行腹主動脈取全血3 mL,靜置1 h并以2 000 r/min離心15 min,取血清,嚴(yán)格按酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA法)試劑盒說明檢測IL-10、ADPN。

1.2.4.4足關(guān)節(jié)病理切片 按“1.2.4.2”法麻醉大鼠,取足關(guān)節(jié),并用4%多聚甲醇固定,后送黔南州人民醫(yī)院病理科行鼠足關(guān)節(jié)病理切片(HE染色)制作并掃描成數(shù)字圖片資料。進(jìn)行足趾關(guān)節(jié)病理切片評分[9]。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠足腫脹情況 CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)評分明顯高于正常組、氨甲蝶呤組及花蝴蝶高、低組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);氨甲蝶呤組、花蝴蝶高組大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)評分與正常組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖1、表1。

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)評分比較分,n=8)

注:A為正常組;B為CIA模型組;C為氨甲蝶呤組;D為花蝴蝶高組;E為花蝴蝶低組。

2.2各組大鼠RF、IgA、IgG、IgM水平比較 CIA模型組大鼠RF水平明顯高于正常組、氨甲蝶呤組及花蝴蝶高、低組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CIA模型大鼠IgA水平明顯低于正常組和氨甲蝶呤組,但明顯高于花蝴蝶高組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),氨甲蝶呤組IgA水平明顯低于正常組,明顯高于花蝴蝶高、低組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。花蝴蝶高組大鼠IgA水平明顯低于正常組,略高于花蝴蝶低組,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CIA模型大鼠IgG水平明顯高于正常組和氨甲蝶呤組,略低于花蝴蝶低組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),略高于花蝴蝶高組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。氨甲蝶呤組大鼠IgG水平明顯低于花蝴蝶高、低組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),略高于正常組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?；ê呓M大鼠IgG水平明顯高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),略低于花蝴蝶低組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CIA模型組、氨甲蝶呤組、花蝴蝶高組大鼠IgM水平均明顯高于正常組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),CIA模型組大鼠IgM水平略高于氨甲蝶呤組及花蝴蝶高、低組,花蝴蝶高組大鼠IgM水平略低于花蝴蝶低組,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠RF、IgA、IgG、IgM水平比較

2.3各組大鼠TG、ADPN、IL-10水平比較 CIA模型組大鼠TG水平明顯低于正常組、氨甲蝶呤組和花蝴蝶高組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),略低于花蝴蝶低組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。氨甲蝶呤組大鼠TG水平略低于正常組,花蝴蝶高、低組,花蝴蝶高組大鼠TG水平略低于正常組,略高于花蝴蝶低組,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CIA模型組大鼠ADPN水平明顯低于正常組、氨甲蝶呤組、花蝴蝶高組,氨甲蝶呤組大鼠ADPN水平明顯低于花蝴蝶低組,花蝴蝶高組大鼠ADPN水平明顯高于氨甲蝶呤組和花蝴蝶低組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CIA模型組大鼠IL-10水平明顯低于正常組、花蝴蝶高組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),略低于氨甲蝶呤組、花蝴蝶低組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.4各組大鼠足趾關(guān)節(jié)病理切片評分比較 CIA模型組大鼠脂肪細(xì)胞評分低于其他組,白細(xì)胞評分高于其他組;與其他組比較,CIA模型組大鼠足關(guān)節(jié)骨髓腔內(nèi)現(xiàn)低度脂肪細(xì)胞,而白細(xì)胞彌漫性增生,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3、圖3。

表3 各組大鼠足趾關(guān)節(jié)病理切片評分比較分,n=8)

注:A為正常組;B為CIA模型組;C為氨甲蝶呤組;D為花蝴蝶高組;E為花蝴蝶低組。

3 討 論

雖然RA病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚,但有研究認(rèn)為脂肪細(xì)胞變化及其分泌功能性因子和免疫調(diào)節(jié)因子紊亂是RA發(fā)生機(jī)制之一[6-8]。本實(shí)驗(yàn)足關(guān)節(jié)病理切片結(jié)果提示,CIA模型組大鼠足關(guān)節(jié)骨髓腔內(nèi)現(xiàn)明顯低度脂肪細(xì)胞,脂肪細(xì)胞可能是RA炎癥、關(guān)節(jié)畸形等直接代謝關(guān)聯(lián)的重要指標(biāo)細(xì)胞之一。

RF是臨床醫(yī)學(xué)診斷RA時常用經(jīng)典檢測指標(biāo)[10-12]。本實(shí)驗(yàn)中,CIA模型組大鼠RF、IgM水平明顯高于其他組,IgG水平低于花蝴蝶低組而高于其他組,可能是CIA模型組大鼠沒有給藥花蝴蝶,其體內(nèi)CⅡ、CFA持續(xù)刺激,CIA模型組大鼠反復(fù)多次產(chǎn)生了抗體IgG、IgM和抗抗體IgG、IgM等,導(dǎo)致了RF-IgG和RF-IgM水平顯著增加,最終升高了RF、IgG、IgM水平。

CIA模型組大鼠TG、ADPN水平明顯低于其他組,提示可能CIA模型組大鼠脂肪細(xì)胞顯著減少,導(dǎo)致該細(xì)胞分泌功能性物質(zhì)(如TG等,TG是重要能源物質(zhì)之一)和免疫活性因子(如ADPN等)明顯不足,促進(jìn)了CIA模型組大鼠發(fā)生RA和病變。這雖與相關(guān)研究結(jié)果(脂肪細(xì)胞組織是具有內(nèi)分泌和免疫功能的活性組織)相似[6-7],但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

此外,CIA模型組大鼠IL-10水平也較其他組顯著降低。IL-10是公認(rèn)的炎癥與免疫抑制因子,作為一種多細(xì)胞源、多功能的細(xì)胞因子,其相對或絕對缺乏,會持續(xù)引起免疫激活,導(dǎo)致RA[8,13]。另有研究報(bào)道,因IL-10抑制了Th1細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用、單核細(xì)胞化學(xué)趨化作用等[14-15],使RF-IgG和RF-IgM水平顯著增高,即升高了RF水平。

苗藥花蝴蝶可能通過回調(diào)CIA模型大鼠脂肪細(xì)胞減少,恢復(fù)了其功能性物質(zhì)(如TG等)正常分泌,因此緩解了CIA模型大鼠能量代謝,由于模型大鼠能量供應(yīng)正常,助力回轉(zhuǎn)了大鼠炎癥的發(fā)展、關(guān)節(jié)組織畸變凋亡等;此外,苗藥花蝴蝶可能通過回調(diào)CIA模型鼠能量代謝水平,使其正常分泌免疫因子,如脂肪因子ADPN、IL-10等,而這些直接參與免疫調(diào)節(jié)的活性因子又緩解了CIA模型大鼠炎癥、關(guān)節(jié)畸形等癥狀。目前,這些免疫因子與CIA模型鼠關(guān)節(jié)畸形等變化的直接物質(zhì)代謝機(jī)制,仍是本課題組進(jìn)一步研究的方向之一。

綜上所述,苗藥花蝴蝶可能通過回調(diào)CIA模型鼠脂肪細(xì)胞的減少,保證了正常的能量代謝(如TG)和免疫調(diào)節(jié)因子分泌(如ADPN、IL-10等),增強(qiáng)了免疫調(diào)節(jié)作用(如回調(diào)了RF、IgG、IgM等),緩解了CIA模型大鼠足關(guān)節(jié)炎癥、畸形等。