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        二代交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值

        2023-12-02 04:03:44王燕歐維正楊秀章楊毅
        貴州醫(yī)藥 2023年11期
        關(guān)鍵詞:二者恒溫核酸

        王燕 歐維正 楊秀章 楊毅

        (貴陽(yáng)市公共衛(wèi)生救治中心檢驗(yàn)科,貴州 貴陽(yáng) 550003)

        結(jié)核病(TB)是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起的慢性傳染病。多色巢式熒光定量PCR(Xpert MTB/RIF)作為快速分子診斷技術(shù)于2010年12月由WHO推薦[1],因其具有較高的靈敏性和特異性,操作簡(jiǎn)便且快速,已在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用。交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(CPA)是一種新穎的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法[2],也是我國(guó)首個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的核酸擴(kuò)增技術(shù),相對(duì)Xpert MTB/RIF而言,CPA檢測(cè)MTB的臨床應(yīng)用更具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)。一代CPA(恒溫?cái)U(kuò)增-試紙條法)被證明是一種簡(jiǎn)便、快速、特異的MTB檢測(cè)方法[3],并已獲得WHO所認(rèn)可[4],但因其手動(dòng)處理步驟較多,限制了它在工作量大的臨床實(shí)驗(yàn)室中的使用,主要推薦在基層實(shí)驗(yàn)室開展[5]。后續(xù)發(fā)展的二代CPA(恒溫?cái)U(kuò)增-實(shí)時(shí)熒光法)則可實(shí)現(xiàn)了多通道“一管式”全自動(dòng)核酸分析,即在一個(gè)密閉檢測(cè)管內(nèi)完成核酸裂解結(jié)合、清洗、洗脫和擴(kuò)增反應(yīng)。因此,本研究旨在評(píng)估二代CPA作為TB的快速分子診斷技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值。

        1 資料與方法

        1.1一般資料 選取2021年7月至2022年7月本院收治患者送檢的各類標(biāo)本235例,其中,痰液98例、肺泡灌洗液76例、胸(腹)水37例、其它標(biāo)本(穿刺液及分泌物等)24例。所有標(biāo)本均經(jīng)研究對(duì)象知情同意后獲得,排除標(biāo)本不合格者、二代CPA和Xpert MTB/RIF檢測(cè)失敗者。

        1.2試劑和儀器

        1.2.1試劑 二代CPA檢測(cè)試劑為杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司的“結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑盒(恒溫?cái)U(kuò)增-實(shí)時(shí)熒光法 )”[注冊(cè)號(hào)為國(guó)械注準(zhǔn)20193401027 ];Xpert MTB/RIF檢測(cè)試劑為美國(guó)Cepheid公司的“Gene Xpert?MTB/RIF試劑盒”[注冊(cè)號(hào)為國(guó)食藥監(jiān)械(進(jìn))字2014第3401153號(hào)]。

        1.2.2儀器 UC0108核酸擴(kuò)增檢測(cè)分析儀(杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司)、Gene Xpert?檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Cepheid公司)等。

        1.3檢測(cè)方法

        1.3.1Xpert MTB/RIF檢測(cè) 取不少于2 mL標(biāo)本置于有螺旋蓋的前處理管中,然后加入相當(dāng)于1~2倍標(biāo)本體積的處理液,旋緊前處理管,在渦旋振蕩器上渦旋振蕩15~30 s,室溫靜置15 min,使標(biāo)本充分液化。打開反應(yīng)盒,取2 mL處理后標(biāo)本從加樣孔緩慢加入反應(yīng)盒,然后將反應(yīng)盒置于檢測(cè)模塊,儀器自動(dòng)化檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后,檢測(cè)結(jié)果可直接在檢測(cè)系統(tǒng)窗口下觀察。

        1.3.2二代CPA檢測(cè) 取用于Xpert MTB/RIF檢測(cè)后剩余液化標(biāo)本1 mL加至1.5 mL離心管中, 14 170×g離心3 min,棄上清。同時(shí)將MTB-DNA提取液充分混勻,全部轉(zhuǎn)入MTB-內(nèi)標(biāo)管中,靜置10~20 s后,充分混勻至管底無(wú)可見紫色附著物。將混合液全部轉(zhuǎn)入已棄上清的標(biāo)本離心管中,充分混勻至管底無(wú)可見附著物。最后將總混合液全部轉(zhuǎn)入MTB-全自動(dòng)檢測(cè)管中,蓋好管蓋上機(jī)檢測(cè)。以試劑盒自帶的MTB-陽(yáng)性/陰性對(duì)照作為外部質(zhì)控。MTB檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)典型S型擴(kuò)增曲線(包括未到平臺(tái)期的S曲線),當(dāng)MTB Tt≤40時(shí),MTB為陽(yáng)性;否則MTB為陰性(同時(shí)滿足內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果接受標(biāo)準(zhǔn))。

        1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Xpert MTB/RIF和二代CPA對(duì)不同標(biāo)本類型的MTB陽(yáng)性檢出率比較采用χ2檢驗(yàn),p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;二者的一致性比較采用Kappa檢驗(yàn),Kappa值0~0.20示極低的一致性,0.21~0.40示一般的一致性,0.41~0.60示中等的一致性,0.61~0.80示高度的一致性,0.81~1示幾乎完全一致。

        2 結(jié) 果

        2.1235例標(biāo)本同步進(jìn)行Xpert MTB/RIF和二代CPA檢測(cè),Xpert MTB/RIF檢測(cè)MTB陽(yáng)性率為43.38%(103/235),二代CPA檢測(cè)MTB陽(yáng)性率為42.13%(99/235)。不同標(biāo)本類型的MTB陽(yáng)性檢出率比較見表1。

        表1 Xpert MTB/RIF和二代CPA檢測(cè)各種標(biāo)本類型的MTB陽(yáng)性率比較

        2.2二代CPA與Xpert MTB/RIF對(duì)235例標(biāo)本檢測(cè)MTB的結(jié)果比較 二者對(duì)全部標(biāo)本的陽(yáng)性符合率88.35%,陰性符合率93.94%,總符合率91.49%,一致性比較,Kappa=0.83。

        2.3Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果為“MTB高”的標(biāo)本有11例,為“MTB中”的標(biāo)本有44例,為“MTB低”的標(biāo)本有30例,上述標(biāo)本二代CPA檢測(cè)均為MTB陽(yáng)性;Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果為“MTB 極低”的標(biāo)本有18例,二代CPA檢測(cè)MTB陽(yáng)性有6例,陰性有12例;Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果為“MTB 未檢出”的標(biāo)本有132例,二代CPA檢測(cè)MTB陽(yáng)性有8例,陰性有124例。

        3 討 論

        有研究[6]中,LAMP、SAT和Xpert MTB/RIF一樣,對(duì)檢測(cè)MTB均表現(xiàn)出較高的靈敏性和特異性,明顯高于抗酸染色和羅氏培養(yǎng)等傳統(tǒng)方法,極大地提高了臨床標(biāo)本的MTB檢出率。Xpert MTB/RIF是較為成熟的TB快速分子診斷技術(shù),在長(zhǎng)期的實(shí)踐中已得到了臨床的廣泛認(rèn)可[7]。

        本文結(jié)果顯示,不同標(biāo)本類型間檢測(cè)MTB的陽(yáng)性率比較,二代CPA和Xpert MTB/RIF差異均顯示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。全部標(biāo)本的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,二者檢測(cè)MTB的結(jié)果也有著極高的一致性(Kappa=0.83)。表明應(yīng)用二代CPA和Xpert MTB/RIF對(duì)胃吸液檢測(cè)MTB的靈敏性和特異性相似,與文獻(xiàn)[8]研究結(jié)果基本相符。

        研究發(fā)現(xiàn)二代CPA和Xpert MTB/RIF對(duì)MTB含菌量較多的標(biāo)本(Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果為“MTB 低”及以上),二者檢測(cè)結(jié)果完全一致,差異主要表現(xiàn)在少數(shù)Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果為“MTB 極低”或“MTB 未檢出”的標(biāo)本,這可能與二者的最低檢出限值存在差異有關(guān)。一方面二者靶基因不同,二代CPA的靶基因是IS6110,屬多拷貝基因,而Xpert MTB/RIF的靶基因是rpoB,屬單拷貝基因。有文獻(xiàn)[9]報(bào)道,以單拷貝基因?yàn)闄z測(cè)靶基因的方法比以多拷貝基因?yàn)闄z測(cè)靶基因的方法敏感性低。本文結(jié)果顯示,二代CPA比Xpert MTB/RIF的陽(yáng)性率略低(42.13% vs 43.38%),這或許與本研究的標(biāo)本量不夠大有關(guān)。另一方面二者自動(dòng)化操作有差異,二代CPA多一步上機(jī)前標(biāo)本離心富集的手工過程,如果該步驟處理不當(dāng),可能反而會(huì)導(dǎo)致菌量的丟失,這或許是本研究二代CPA比Xpert MTB/RIF陽(yáng)性率低的另一原因。熟練掌握二代CPA的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,將有益于提高二代CPA的檢測(cè)質(zhì)量。

        二代CPA和Xpert MTB/RIF都具有操作簡(jiǎn)便、高度自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì),整個(gè)過程不到2 h,而二者檢測(cè)MTB的結(jié)果具有極高的一致性,因此,二代CPA同Xpert MTB/RIF一樣可推薦用于臨床對(duì)MTB的快速檢測(cè)。但Xpert MTB/RIF可以同時(shí)檢測(cè)利福平耐藥性則是它的另一大優(yōu)勢(shì)。就檢測(cè)成本而言,二代CPA明顯低于Xpert MTB/RIF,二代CPA更適合在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)推廣應(yīng)用。

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