陳靜文 陳少彬 魏潤葵 袁秋婷 何子毅(東莞市中心血站，廣東 東莞 523000)

我國血液篩查對HIV、HBV 和HCV 感染標(biāo)志物的檢測策略為“應(yīng)至少采用核酸和血清學(xué)試劑各進(jìn)行1 次檢測[1]”，大多數(shù)血站采用的是2 遍血清學(xué)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbent assays，ELISA)和1 遍核酸檢測(nucleic acid testing，NAT)的策略，較好地保障血液安全。 本站采用的是2 遍國產(chǎn)ELISA 試劑和1 遍進(jìn)口PCR(6 混1)的檢測模式，在實際工作中，核酸檢測為反應(yīng)性的項目主要為HBV DNA[2]，且絕大多數(shù)為首次獻(xiàn)血者，少數(shù)為重復(fù)獻(xiàn)血者。 首次獻(xiàn)血者在被檢出HBV DNA 陽性時則被屏蔽獻(xiàn)血，而少數(shù)的重復(fù)獻(xiàn)血者被檢出HBV DNA 后，我們發(fā)現(xiàn)其核酸檢測閾值循環(huán)數(shù)(threshold cycle，Ct)可能與前1 次獻(xiàn)血間隔時間或累積獻(xiàn)血次數(shù)有一定差異。 為了了解不同類型的HBsAg-/HBV DNA＋獻(xiàn)血者的檢測結(jié)果差異，進(jìn)一步評估重復(fù)獻(xiàn)血者的核酸檢測殘余風(fēng)險，我們對不同獻(xiàn)血次數(shù)、不同獻(xiàn)血間隔時間的獻(xiàn)血者HBV DNA 檢測Ct 值進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 通過血站信息系統(tǒng)獲取2019 年2 月—2022年1 月在本站參與無償獻(xiàn)血的270 283 名獻(xiàn)血者的核酸檢測結(jié)果(Ct 值)及其獻(xiàn)血時間等信息作為研究資料。

1.2 試劑與儀器 HBsAg 酶免檢測試劑(北京萬泰公司，批號:B20180728—B20211038；珠海麗珠公司，批號:20180814 08—2019122108；英科新創(chuàng)公司，批號:2020055110—202108 5125)；Roche Cobas TaqScreen MPX v2.0 核酸檢測試劑(羅氏診斷公司，批號:G16011，G11355，F(xiàn)07571，E31914，324291)。 所用試劑均為國家食品藥品檢定研究院鑒定為合格產(chǎn)品，且在有效期內(nèi)使用。 Freedom evo 全自動加樣儀(TECAN 公司)，AE368 全自動酶免分析系統(tǒng)(深圳愛康公司)MICROLAB STAR IVD 加樣儀(漢密爾頓公司)，Cobas s201 全自動核酸檢測系統(tǒng)(羅氏診斷公司)，8420 型離心機(jī)(KUBOTA 公司)。

1.3 方法 在血站信息系統(tǒng)(啟奧9.0)查詢2019 年2 月—2022 年1 月獻(xiàn)血者的獻(xiàn)血次數(shù)和獻(xiàn)血時間，核酸檢測Ct 值(包括混檢和拆分的Ct 值)，并按獻(xiàn)血者累計獻(xiàn)血次數(shù)分為:初次獻(xiàn)血者組(A)及重復(fù)獻(xiàn)血者組(B)；重復(fù)獻(xiàn)血者組再按具體的獻(xiàn)血次數(shù)分為重復(fù)獻(xiàn)血2 次組(C1)、重復(fù)獻(xiàn)血≥3 次組(C2)；重復(fù)獻(xiàn)血者組再按首次核酸檢測反應(yīng)性與前1 次獻(xiàn)血的時間的間隔時長分為:＜1 年組(D1)、1～3 年組(D2)、≥3 年組(D3)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 獻(xiàn)血者HBV DNA 檢測Ct 值采用M(QR)表示，HBV DNA 檢出率采用百分比(%)表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件繪制箱體圖，組間HBV DNA 檢出率比較采用卡方檢驗，組間Ct 值差異采用獨立樣本的Mann-Whitney U檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同類型獻(xiàn)血者的HBV DNA 核酸檢測結(jié)果 見表1。

表1 不同類型獻(xiàn)血者的HBV DNA 檢出率比較 (n，%)

2.2 不同類型獻(xiàn)血者的HBV DNA 檢測Ct 值及其分布情況

各組Ct 值經(jīng)正態(tài)性檢驗呈非正態(tài)分布，采用中位數(shù)(四分位數(shù))表示，見表2。

表2 各組核酸混檢與拆分的Ct 值情況[M(QR)]

2.3 各組Ct 值的分布情況 見圖1～3。

圖1 初次獻(xiàn)血者與重復(fù)獻(xiàn)血者的Ct 值分布情況

圖2 不同獻(xiàn)血次數(shù)獻(xiàn)血者的核酸拆分Ct 值分布情況

3 討論

近年來本市的無償獻(xiàn)血招募模式經(jīng)過多番調(diào)整和實踐，現(xiàn)今以團(tuán)體預(yù)約招募為主、街頭采血為輔，重復(fù)獻(xiàn)血者的結(jié)構(gòu)比例也有所提升。 由于重復(fù)獻(xiàn)血者的血液安全性較高，各地血站也努力招募和鞏固重復(fù)獻(xiàn)血者隊伍，以期從源頭上保障血液安全。 然而，在血站實驗室的核酸檢測中，我們?nèi)园l(fā)現(xiàn)一定比例的HBsAg 無反應(yīng)性的重復(fù)獻(xiàn)血者被檢出HBV DNA。 我國是HBV 高發(fā)地區(qū)，且有多種HBV 亞型，實驗室ELISA 等血清學(xué)檢測方法因試劑、檢測儀器、人員操作、感染人員條件復(fù)雜等因素，導(dǎo)致仍有部分感染情況復(fù)雜的獻(xiàn)血者漏檢，尤其是隱匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)，給臨床用血安全造成潛在風(fēng)險[3-5]。 我們通過分析不同類型獻(xiàn)血者與其核酸HBV DNA 檢測混檢(6混1)與單檢(拆分)的Ct 值的相關(guān)性，探討本地區(qū)重復(fù)獻(xiàn)血者的乙型肝炎隱匿性感染風(fēng)險，為實驗室優(yōu)化血液檢測策略提供參考依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)初次獻(xiàn)血者組的HBV DNA 檢出率明顯高于重復(fù)獻(xiàn)血者組(P＜0.05)，這與魏勝男等[6]報道的78 份HBV DNA 反應(yīng)性標(biāo)本的獻(xiàn)血者中60.3%(47/78)為重復(fù)獻(xiàn)血者的結(jié)果不同。 有研究分析了我國18 家地市級血站獻(xiàn)血者血液HBV 檢測相關(guān)數(shù)據(jù)情況，發(fā)現(xiàn)各地區(qū)血站的初次獻(xiàn)血者、重復(fù)獻(xiàn)血者HBsAg ELISA 不合格率呈現(xiàn)較大地區(qū)性差異[7]，原因可能與不同地區(qū)的HBV 流行率、血液篩查模式以及獻(xiàn)血者人群結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。 因此，各地區(qū)針對不同類型的重復(fù)獻(xiàn)血者開展HBV DNA 的感染風(fēng)險評估對鞏固低危獻(xiàn)血者隊伍和優(yōu)化血液篩查策略具有重要意義。 從本研究重復(fù)獻(xiàn)血者組中檢出小部分OBI 獻(xiàn)血者，且其核酸單檢(拆分)Ct 值比初次獻(xiàn)血者組高，按照PCR 原理擴(kuò)增的初始濃度與Ct 值的負(fù)相關(guān)以及混檢Ct 值越大，拆分陽性率相關(guān)性越差的關(guān)系推斷[8]，重復(fù)獻(xiàn)血者拆分Ct 值越高說明標(biāo)本中所攜帶的HBV 載量可能越低。 圖1 可見拆分Ct 值分布較混檢Ct 值的寬，離群值也較混檢Ct 值的多，說明該OBI 獻(xiàn)血者的感染情況更加隱匿，檢測難度更大。 有研究報道HBsAg-/HBV DNA＋獻(xiàn)血者的病毒載量極低且病毒載量具有波動性，即便后續(xù)幾次檢測陰性也不能排除非感染狀態(tài)[9]，鄭欣等[10]通過10 年的長期隨訪追蹤隱匿性乙型肝炎病毒感染者的預(yù)后轉(zhuǎn)歸情況，發(fā)現(xiàn)42.5%的OBI 獻(xiàn)血者仍保持OBI 感染狀態(tài)，有7.5%的OBI 獻(xiàn)血者在多次復(fù)查中結(jié)果呈多次陰陽結(jié)果交替轉(zhuǎn)換的情況，以至于病毒核酸檢測出現(xiàn)漏檢機(jī)會。

由于重復(fù)獻(xiàn)血者定期參加獻(xiàn)血，在前1 次獻(xiàn)血時合格的獻(xiàn)血者再次獻(xiàn)血時，HBV 感染性指標(biāo)轉(zhuǎn)陽，表明該獻(xiàn)血者是在獻(xiàn)血間隔期內(nèi)的新感染者。 本研究分析不同獻(xiàn)血間隔時間的獻(xiàn)血者的核酸檢測Ct 值，發(fā)現(xiàn)初次獻(xiàn)血者組拆分Ct 值分別與間隔1 年內(nèi)重復(fù)獻(xiàn)血者組、間隔≥3 年重復(fù)獻(xiàn)血者組比較，重復(fù)獻(xiàn)血間隔時間在1～3 年內(nèi)混檢的Ct 值與拆分比較，均有差異(P＜0.05)。 說明Ct 值與不同獻(xiàn)血間隔時間可能存在一定的相關(guān)性。 獻(xiàn)血間隔時間短的獻(xiàn)血者可能比較注重自身健康及衛(wèi)生問題，防范病毒感染的警惕性較高，而間隔1～3 年的重復(fù)獻(xiàn)血者組較間隔1 年內(nèi)在間隔時間上更長，其拆分Ct 值中位數(shù)較低，病毒拷貝量更大，此類人群可能在前次獻(xiàn)血成功并檢測正常后有放松防范的心態(tài)，等到再次獻(xiàn)血時正處于HBV 感染窗口期或乙型肝炎急性感染期[11]，因此，間隔1～3 年內(nèi)重復(fù)獻(xiàn)血者組的血液可能比短期內(nèi)經(jīng)常獻(xiàn)血人群的風(fēng)險大。 從本次的研究結(jié)果看，間隔≥3 年的重復(fù)獻(xiàn)血者在獻(xiàn)血人群中的數(shù)量雖然少，其感染HBV風(fēng)險依然存在。 而從累計獻(xiàn)血次數(shù)分類的結(jié)果看，不同累計獻(xiàn)血次數(shù)的重復(fù)獻(xiàn)血者之間的拆分Ct 值差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但重復(fù)≥3 次獻(xiàn)血者組的拆分Ct 值分布寬度比重復(fù)2 次獻(xiàn)血者組要大，且離群值更多，重復(fù)獻(xiàn)血次數(shù)越多才能被核酸檢測系統(tǒng)檢測識別出來的獻(xiàn)血者，其感染情況較獻(xiàn)血次數(shù)少的更為復(fù)雜和隱匿。 有報道高齡組獻(xiàn)血者OBI 感染率明顯高于低齡組，且衛(wèi)生知識普及度低，定期獻(xiàn)血的主動性不足、機(jī)體免疫力相對低，生活中易暴露，而低齡組出生時正處于乙肝疫苗接種普及時代[12]。 這可能也是獻(xiàn)血間隔時間長或獻(xiàn)血次數(shù)的增加，獻(xiàn)血者感染暴露的風(fēng)險增大的另一個因素。 由于本次收集的獻(xiàn)血者信息量有限，尚未能區(qū)分比較間隔時間≥3 年的獻(xiàn)血者的感染風(fēng)險，有待今后加大樣本量，豐富其結(jié)果分析。

無論是初次獻(xiàn)血者組還是重復(fù)獻(xiàn)血者組，均存在HBV DNA 漏檢的風(fēng)險。 這取決于篩查試劑的靈敏度和血液標(biāo)本的質(zhì)量。 Candotti 等[13]報道了更低感染劑量的HBV 經(jīng)輸血引起HBV 感染的病例。 若OBI 獻(xiàn)血者的HBV 載量在檢測試劑的最低檢測限上下，也有可能發(fā)生輸血感染風(fēng)險。 李春祥等[14]采用提取體積6 mL 血漿PEG 沉降及超高速離心富集HBV 的方法，雖然該方法可有效提高極低病毒載量標(biāo)本的陽性檢出率，但操作繁瑣，一般的實驗室難以開展。 此外，對于HBsAg ELISA 檢測存在弱反應(yīng)性(高S/CO 值陰性標(biāo)本)時需要特別關(guān)注不同核酸檢測模式的結(jié)果，其單檢模式的HBV DNA 陽性檢出率較混檢模式的高[15-16]，如若懷疑該標(biāo)本可能存在血清學(xué)漏檢，可增加化學(xué)發(fā)光法作為補(bǔ)充試驗或直接對其進(jìn)行核酸單檢。 因此，為防止OBI 獻(xiàn)血者的機(jī)會性漏檢，只有選擇更高靈敏度的檢測試劑，不斷優(yōu)化檢測模式，甚至采用更先進(jìn)的新技術(shù)。

綜上所述，獻(xiàn)血者核酸檢測HBV DNA 的Ct 值與不同獻(xiàn)血次數(shù)、不同獻(xiàn)血間隔時間存在一定的相關(guān)性，開展不同類型重復(fù)性獻(xiàn)血者的核酸檢測殘余風(fēng)險評估對鞏固低危獻(xiàn)血隊伍和保障源頭血液安全具有重要意義。 血站實驗室應(yīng)定期開展針對實驗室檢測策略有效性的評估，以不斷提高檢測能力，確保血液安全。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。