葉鑫，王夢涵，袁婉婧，胡凡，曾宏亮，謝彪?

（1.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410031）

結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其早期特異性癥狀不明顯，發(fā)生和發(fā)展極其隱蔽，因此大部分結直腸癌被發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是中晚期。此時，腫瘤細胞已轉移至淋巴結或遠處器官，預后差，治愈率低，是導致結直腸癌病死率居高不下的重要原因之一［1］。手術及長期放化療依然是大多數(shù)結直腸癌患者的首選治療方案，但其預后效果略有不足，尤其是針對轉移性病變的患者。研究表明，轉移性病變的患者五年生存率僅約12%，生存率是未轉移患者的50%［2］。

中醫(yī)藥治療強調治病求本，扶正祛邪，注重防治，臨床常用健脾補腎之法，養(yǎng)先后天之本，扶正氣以御邪，同時促進脾的運化功能和腎的氣化功能，有助于津液的代謝和血液的化生，以祛瘀之法祛除“痰”“瘀”等結直腸癌病理產(chǎn)物，瘀血去則新血生，從而使人體的病理狀態(tài)趨于正常。

上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤的發(fā)展和轉移中起著不可忽視的作用［3］，而波形纖維蛋白（Vimentin）是EMT的標志蛋白，參與調控腫瘤細胞的黏附和轉移，在多種上皮來源的惡性腫瘤中均顯示高表達。E黏鈣蛋白（E-cadherin）可以增強細胞黏附力，高表達時可以抑制腫瘤細胞浸潤轉移，是公認的抑癌因子，其表達缺失是EMT的發(fā)生標志［4-5］。

血管內皮生長因子C（VEGF-C）是近來發(fā)現(xiàn)的介導腫瘤淋巴管生成及淋巴結轉移的重要因子，血管內皮生長因子受體3（VEGFR-3）是VEGF-C其中一個重要受體，其在人體各組織中均有表達，但在腫瘤發(fā)生時，VEGFR-3在許多腫瘤組織中處于過表達的狀態(tài)［6-7］。

因此，本實驗以裸鼠成瘤模型為研究對象，通過免疫組化法檢測裸鼠瘤體組織中VEGF-C、VEGFR-3、Vimentin及E-cadherin的表達情況，探討健脾補腎法對結直腸癌移植瘤組織的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

16只SPF級裸鼠，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，體質量18～20 g，雌雄各半，飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所動物實驗中心的獨立通氣籠盒內，溫度24 ℃，濕度40%～50%，白晝交替。動物質量合格證：430727201101778068，許可證號：SCXK2019-0004。本次實驗符合《實驗動物管理條例》相關規(guī)定。

1.2 藥物與試劑

健脾補腎中藥復方組方：人參15 g，黃芪20 g，砂仁5 g，白術15 g，茯苓15 g，陳皮6 g，半夏9 g，山藥20 g，女貞子10 g，墨旱蓮10 g，菟絲子10 g，枸杞子10 g，雞血藤10 g，白花蛇舌草2 g，三七3 g，半枝蓮15 g，甘草5 g；其配方顆粒購買于湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院。VEGF-C、VEGFR-3抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：Al10188078、BB09192758）；E-cadherin、Vimentin抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：00113481、00110734）；人結直腸癌細胞株（中國科學院上海細胞庫，HCT116）。

1.3 主要儀器

顯微鏡（奧林巴斯 BX53）；石蠟切片機（YB-8LF）；輪轉式切片機（RM2245）；自動組織脫水機（HP300）；生物組織攤烤片機（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司YT-7F型）；細胞培養(yǎng)基（DMEM）。

1.4 建模、分組及給藥

取HCT116人結直腸癌細胞株150 μL（約含細胞1 × 107個）接種于已自適應1周的裸鼠右腿內側構建結直腸癌移植瘤模型。在籠中飼養(yǎng)14 d后，將16只造模后的裸鼠隨機分為對照組和實驗組兩組。裸鼠建模成功后首次灌胃時間記為第1天。對照組灌胃0.9%氯化鈉溶液0.4 mL/d ，實驗組灌胃健脾補腎中藥復方23.4 g/kg，兩組均隔天給藥1次，連續(xù)14 d。

1.5 取材

灌胃第15天脫頸處死裸鼠，剝離瘤體，眼科剪將其剪成兩部分，一部分常規(guī)制作石蠟組織切片，另一部分放入-80 ℃冰箱凍存。

1.6 觀察指標與方法

將包埋好的腫瘤組織經(jīng)流水沖洗后用蒸餾水浸泡5 min；切片置于檸檬酸鈉緩沖液中煮沸15 min、流水沖洗；而后浸泡于3%過氧化氫溶液20 min、PBS沖洗三次；封閉滅活內源性過氧化酶后分別加 VEGF-C、VEGFR-3、E-cadherin、Vimentin等一抗（1∶100體積比稀釋），置入4 ℃冰箱過夜，室溫復溫后加二抗（1∶500體積比稀釋）室溫放置30 min、PBS沖洗3次；DAB 顯色、蘇木精復染；脫水、透明、封片。本研究由病理科醫(yī)師進行閱片。

VEGF-C、VEGFR-3、E-cadherin及Vimentin顯示胞質及胞膜陽性（有黃色或棕褐色顆粒）。計算陽性細胞數(shù)比率，＜ 5%的細胞陽性著色為0分；6%～25%的細胞陽性著色為1分；26%～50%的細胞陽性著色為2分；51%～75%的細胞陽性著色為3分；＞ 75%的細胞陽性著色為4分。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較符合正態(tài)分布采用t檢驗，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組裸鼠移植瘤組織中VEGF-C、VEGFR-3免疫組化表達情況比較

VEGF-C、VEGFR-3在對照組中均呈現(xiàn)高表達，經(jīng)健脾補腎中藥復方干預后，與對照組比較，實驗組移植瘤組織中VEGF-C和VEGFR-3的表達明顯下調，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.05）。結果見圖1、表1。

圖1 兩組腫瘤組織中VEGF-C、VEGFR-3的表達（× 40）

表1 兩組移植瘤組織中VEGF-C、VEGFR-3表達情況比較（±s）

表1 兩組移植瘤組織中VEGF-C、VEGFR-3表達情況比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05。

VEGFR-3 2.42±0.53 0.28±0.49*組別對照組實驗組n8 8 VEGF-C 2.00±0.82 0.14±0.38*

2.2 兩組裸鼠移植瘤組織中Vimentin、E-cadherin免疫組化表達情況比較

Vimentin在對照組中呈現(xiàn)高表達，E-cadherin呈現(xiàn)低表達，經(jīng)健脾補腎中藥復方干預后，與對照組比較，實驗組移植瘤組織中Vimentin表達明顯下調，Ecadherin表達明顯上調，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。結果見圖2、表2。

圖2 兩組腫瘤組織中Vimentin、E-cadherin的表達（× 40）

表2 兩組移植瘤組織中Vimentin、E-cadherin表達情況比較（±s）

表2 兩組移植瘤組織中Vimentin、E-cadherin表達情況比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05；與對照組比較，**P ＜ 0.05。

組別對照組實驗組E-cadherin 1.43±0.98 2.57±0.53**n8 8 Vimentin 2.29±0.76 0.14±0.38*

3 討論

健脾補腎法是通過應用六君子湯合二至丸加減解毒祛瘀類中藥而實現(xiàn)，前期研究已表明本法可明顯抑制人結直腸癌移植瘤的增殖［8］。健脾補腎中藥復方中人參健脾補氣、益腎氣助腎陽，黃芪扶正祛邪、健脾益氣，二者合而為君；茯苓、山藥健脾補腎、益氣養(yǎng)陰，白術、茯苓健脾滲濕，女貞子、墨旱蓮益腎滋陰，菟絲子、枸杞子補腎填精為臣；氣虛易滯，砂仁化濕開胃以助行氣，陳皮理氣健脾，氣為血之帥，氣虛則血瘀滯于內，三七、雞血藤活血化瘀，脾失運化，痰瘀阻于內，半夏燥濕化痰，共為佐藥；再以清熱解毒的白花蛇舌草、半枝蓮，健脾益氣，調和諸藥的甘草為佐使。全方應用補氣藥、補陰藥，加以兩味清熱解毒藥，伍以活血、化痰、滲濕、理氣藥，共奏健脾益氣、補腎固本、活血行氣、化瘀解毒之功效。人參中的主要成分人參皂苷Rb2具有抑制結直腸癌細胞EMT的作用，人參皂苷Rb3則能夠抑制血管生成起到抑癌作用［9-10］。甘草中的甘草黃素能明顯抑制轉移性結直腸癌細胞EMT［11］。本次實驗研究結果表明健脾補腎法可能對人結直腸癌組織的轉移具有抑制作用。

目前針對轉移性結直腸癌的治療主要采用靶向藥物［12］，其中代表便是表皮生長因子（EGFR）靶向藥物及血管內皮生長因子靶向藥物，盡管該治療方法顯示出了較好的治療效果，但是患者個體的耐藥性及此類藥物有嚴格的適用人群等依然是限制其應用的首要問題［13-14］。腫瘤發(fā)展的過程中，E-cadherin的缺失抑或是Vimentin表達升高都能提示EMT的發(fā)生，諸多研究顯示，結直腸癌的組織學分級、分化程度及臨床分期與E-cadherin的低表達密切相關［15］，而Vimentin在分化程度低的結直腸癌組織中表達明顯高于中-高分化腺癌組織［16］，因此作為EMT標志物的E-cadherin與Vimentin具有成為預測結直腸癌發(fā)生、發(fā)展的潛在新靶點的潛力。本次研究結果表明，健脾補腎法可下調人結直腸癌裸鼠組織中VEGF-C、VEGFR-3、Vimentin的表達同時上調E-cadherin的表達，下一步或許可以通過研究健脾補腎法來進一步探索結直腸癌的轉移，發(fā)現(xiàn)新的靶點。

有研究表明，VEGFR-3與VEGF-C特異性結合后，可降低內皮細胞間黏附力，增加淋巴管通透性，促進腫瘤細胞侵襲轉移［17］，VEGF-C/VEGFR-3信號通路是腫瘤轉移過程中促進腫瘤淋巴管生成和轉移的重要信號傳導途徑［18］，乳腺癌中VEGF-C是非EMT細胞轉化為EMT細胞的重要介質［19］。因此，可以推測運用健脾補腎法在人結直腸癌裸鼠組織中可能通過抑制VEGF-C/VEGFR-3信號通路的激活而降低Vimentin的表達或提高E-cadherin表達進而抑制EMT的發(fā)生，達到抑制腫瘤轉移的效果。

4 結論

綜上所述，健脾補腎法通過下調人結直腸癌裸鼠組織VEGF-C、VEGFR-3、Vimentin的表達同時上調E-cadherin的表達，說明健脾補腎法能抑制腫瘤細胞的轉移，從而達到抗腫瘤的效果，可能是通過抑制EMT轉化發(fā)揮作用，但其具體途徑及作用機制仍需進一步研究。